王 玉，柳 森，段健誠，王林華，鄧高威，張慶起，閻斌倫，2，4，高 煥，2，4

（1.江蘇海洋大學(xué)海洋科學(xué)與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，連云港 222005；2.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院，連云港 222005；3.連云港贛榆佳信水產(chǎn)開發(fā)有限公司，連云港 222100；4.江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺，南京 210014）

脊尾白蝦（Exopalaemoncarinicauda）是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要品種之一［1］。在山東、江蘇、浙江等沿海地區(qū)脊尾白蝦的養(yǎng)殖面積已達(dá)2萬hm2，年產(chǎn)量超過4.5萬t［2］。但隨著養(yǎng)殖分布和產(chǎn)量的不斷擴(kuò)大，脊尾白蝦的種質(zhì)退化非常明顯，色質(zhì)、存活率、抗氧化能力均有顯著的下降［3］。因此開發(fā)新型飼料、改善脊尾白蝦的色澤、促進(jìn)脊尾白蝦生長等對脊尾白蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展有重要作用。

研究表明類胡蘿卜素對水產(chǎn)動物有重要影響，如改善水產(chǎn)動物體色和肉質(zhì)、提高水產(chǎn)動物繁殖力、促進(jìn)生長、提高抗氧化能力等［4］。而水產(chǎn)動物本身不能合成類胡蘿卜素，只能從食物中獲取［5］，所以類胡蘿卜素作為一種飼料添加劑在水產(chǎn)配合飼料中應(yīng)用廣泛。作為類胡蘿卜素中最為重要的具有維生素A活性的一種，β 胡蘿卜素對提升水產(chǎn)動物的生理功能有廣泛作用［5］，例如飼料中添加β 胡蘿卜素可提高錦鯉（Cyprinuscarpio haematopterus）的色質(zhì)、中華絨螯蟹（Eriocheirsinensis）的繁殖力和孵化率、鮭魚屬魚類（Oncorhynchus）和鱒屬魚類（Salmo）的卵子質(zhì)量、斑馬魚（Daniorerio）的抗氧化能力［6－9］。

本文擬使用不同劑量的β 胡蘿卜素飼喂脊尾白蝦仔蝦，探究飼料中β 胡蘿卜素的添加量對脊尾白蝦的生長和抗氧化酶活性的影響，以期獲得脊尾白蝦飼料中β 胡蘿卜素的最佳添加量，為脊尾白蝦人工養(yǎng)殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脊尾白蝦仔蝦（0.29±0.01）g由江蘇連云港贛榆佳信水產(chǎn)開發(fā)有限公司提供。β 胡蘿卜素添加劑（β 胡蘿卜素含量1%）購自武漢秉德生物科技有限公司。超氧化物歧化酶（SOD）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）和過氧化氫酶（CAT）的測定所用試劑盒由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取大小均勻、體格健壯、活動力強(qiáng)的脊尾白蝦仔蝦450尾，隨機(jī)分成5組，每組設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)30尾，放入提前配備好海水的60 L（50 cm×40 cm×30 cm）小型硬塑料水箱內(nèi)（箱中注水體積為箱容積的三分之二），β 胡蘿卜素添加劑按0 g·kg－1（A組，對照）、0.5 g·kg－1（B組）、1.0 g·kg－1（C組）、1.5 g·kg－1（D組）、2.0 g·kg－1（E組）濃度加入基礎(chǔ)飼料中投喂，脊尾白蝦基礎(chǔ)飼料的配置方案和成分含量參見表1。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)飼料制備

根據(jù)表1配方，分別將各組原料混合均勻，超細(xì)粉碎，加入一定量的清水?dāng)嚢?，再用絞肉機(jī)擠壓出2 mm的顆粒，緊接著將擠壓出的飼料放入60℃烘箱中3 h，再用攪拌機(jī)將飼料粒打碎，用篩絹網(wǎng)篩選出0.2～0.8 mm的飼料顆粒，置于－4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 實(shí)驗(yàn)飼料配方和營養(yǎng)水平Tab.1 Test feed formula and nutritional level

1.2.3 飼養(yǎng)管理

養(yǎng)殖期間，自然光照，全天24 h充氧，溶氧量＞5mg·L－1，鹽度為23.0±0.1，pH為7.8±0.2，水溫為16.0～20.0℃。實(shí)驗(yàn)開始前將脊尾白蝦仔蝦饑餓24 h，以達(dá)到清理蝦腸道的目的。飼喂時(shí)間為早晚各喂一次，分別為早晨8∶00和下午6∶00，投喂量為初始脊尾白蝦體質(zhì)量的3%，實(shí)際投喂量根據(jù)脊尾白蝦的生長狀況和吃食情況進(jìn)行適當(dāng)?shù)脑鰷p。投喂前每天進(jìn)行清污，同時(shí)觀察蝦的生活狀態(tài)，如果發(fā)現(xiàn)死蝦，及時(shí)撈出，并做好記錄。投喂飼料后0.5 h，對蝦的進(jìn)食情況進(jìn)行觀察，蝦的頭部如果出現(xiàn)灰色小點(diǎn)說明蝦進(jìn)食完成，根據(jù)情況吸出殘餌，防止蝦過度進(jìn)食。在早晨投喂1 h以后進(jìn)行換水，換水量為水體積的1／3，2 d換一次，換水前備好已配鹽度并經(jīng)曝氣的海水。每天觀察增氧機(jī)運(yùn)行情況，防止蝦因缺氧造成死亡。飼養(yǎng)周期為30 d。

1.3 樣本采集與制備

飼養(yǎng)結(jié)束后，饑餓脊尾白蝦24 h，將各個分組的存活蝦全部撈出，分別裝入袋子中，標(biāo)好分組號，然后用紙巾吸掉體表的水分，測定各組實(shí)驗(yàn)蝦總質(zhì)量，取平均值得各組蝦終末質(zhì)量。用手術(shù)解剖刀片去殼、取肉、切碎，用電子天平準(zhǔn)確稱取0.2 g待測機(jī)體的肌肉組織，按質(zhì)量（g）∶體積（mL）＝1∶9的比重，用移液槍加入9倍體積的生理鹽水，在冰水浴中用機(jī)械勻漿器勻漿，每次勻漿10 s，間隔休息30 s，勻漿3～5次，于冷凍離心機(jī)中5 000 r·min－1離心10 min，取上清液按1∶9的比例用生理鹽水稀釋成1%組織勻漿，放入冰箱中－20℃保存待測，并于24 h內(nèi)測完酶活，酶活測定方法嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.4 指標(biāo)測定

存活率（SR）、特定生長率（SGR）、質(zhì)量增加率（WGR）具體計(jì)算公式如下：

存活率（%）＝st／s0×100%

特定生長率（%·d－1）＝（lnwt－lnw0）／t×100%

質(zhì)量增加率（%）＝（wt－w0）／w0×100%式中，wt是實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)脊尾白蝦的平均體質(zhì)量（g），w0是實(shí)驗(yàn)初始脊尾白蝦的平均體質(zhì)量（g），st是實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)脊尾白蝦存活數(shù)量（尾），s0為實(shí)驗(yàn)初始投放脊尾白蝦數(shù)量（尾），t為實(shí)驗(yàn)周期（d）。

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

所有測得的數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。利用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，并采用LSD法進(jìn)行多重比較分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加β 胡蘿卜素對脊尾白蝦生長的影響

添加β 胡蘿卜素對脊尾白蝦生長有顯著的影響，顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表2，其中脊尾白蝦的特定生長率（SGR）、質(zhì)量增加率（WGR）、存活率（SR）在濃度0.5～1.5 g·kg－1范圍內(nèi)顯著高于對照組（P＜0.05），β 胡蘿卜素添加量在0.5 g·kg－1、1.0 g·kg－1、1.5 g·kg－1時(shí)，SGR分別增加11.94%、6.29%、10.69%，WGR分別增加89.88%、65.24%、80.94%，SR分 別 增 加83.35%、50.01%、60.01%，均顯著高于對照組（P＜0.05）。但添加濃度達(dá)到2.0g·kg－1時(shí)，與對照組相比，SGR不再增加，SR則有下降的趨勢，下降幅度達(dá)16.65%。比較各添加濃度組，β 胡蘿卜素添加量在0.5 g·kg－1時(shí)β 胡蘿卜素對脊尾白蝦生長的效果最佳，SGR、WGR、SR增加幅度達(dá)到最高（11.94%、89.88%、83.35%），并明顯高于對照組（P＜0.05）。

表2 飼料中β 胡蘿卜素添加量對脊尾白蝦生長的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）Tab.2 Effect ofβ carotene addition in feed on grow th performance of Exopalaemon carinicauda（M ean±SD）

2.2 添加β 胡蘿卜素對脊尾白蝦抗氧化酶活性的影響

通過測定脊尾白蝦肌肉組織中超氧化物歧化酶（SOD）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）和過氧化氫酶（CAT）活性，表明β 胡蘿卜素的添加量對脊尾白蝦抗氧化酶活性有顯著的影響（表3）。β 胡蘿卜素的添加量在0.5～1.5 g·kg－1范圍內(nèi)，脊尾白蝦的抗氧化能力均有一定程度的提升。β 胡蘿卜素添加量在0.5 g·kg－1、1.0 g·kg－1、1.5 g·kg－1時(shí)，相對于對照組，SOD分別增加10.41%、33.04%、18.81%，ACP分別增加46.50%、38.09%、57.76%，CAT分別增加148.82%、105.29%、102.94%；其中SOD在β 胡蘿卜素添加量1.0 g·kg－1時(shí)最高，達(dá)到60.84 U·mgprot－1，ACP在β 胡蘿卜素添加量1.5 g·kg－1時(shí)最高，達(dá)到66.97 U·mg－1，CAT在β 胡蘿卜素添加量0.5 g·kg－1時(shí)最高，達(dá)到4.23 U·mgprot－1；而AKP分 別 下 降41.04%、12.74%、37.74%。β 胡蘿卜素的添加量達(dá)到2.0 g·kg－1時(shí)，脊尾白蝦的抗氧化能力并沒有提升，SOD、ACP和CAT與對照組無明顯差異（P＞0.05），相反AKP出現(xiàn)了顯著增加，相比對照組提高了35.61%。

3 討論

3.1 β 胡蘿卜素對脊尾白蝦生長的影響

本研究通過測定脊尾白蝦的特定生長率、質(zhì)量增加率、存活率，發(fā)現(xiàn)一定濃度的β 胡蘿卜素對脊尾白蝦的生長有顯著促進(jìn)效果，其中添加量在0.5 g·kg－1時(shí)，特定生長率、質(zhì)量增加率、存活率分別提高了11.94%、89.88%、83.35%，揭示了β 胡蘿卜素作為水產(chǎn)動物飼料添加劑的可行性。β 胡蘿卜素對水產(chǎn)動物生長影響的研究已有多次報(bào)道，例如楊新瑜和劉貴軍［10］以4%的β 胡蘿卜素添加在飼料中投喂89尾均重128 g的中華鱉（Trionyxsinensis）73 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加β 胡蘿卜素的試驗(yàn)組成活率比對照組提高了13.5%，日增重提高了105.6%。袁春營和崔青曼［7］以添加50、100 mg·kg－1β 胡蘿卜素的飼料飼喂中華絨螯蟹（Eriocheirsinensis）60 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中華絨螯蟹的存活率都達(dá)到了100%，質(zhì)量增加率比對照組分別提高了13.08%、26.23%。白東清等［11］以添加1.0g·kg－1β 胡蘿卜素（1%）的飼料飼喂錦鯉（Cyprinuscarpiohaematopterus）2個月，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，錦鯉的增長率達(dá)到370.2%，顯著高于對照組。這些研究結(jié)果說明飼料中適當(dāng)添加β 胡蘿卜素確實(shí)能促進(jìn)水產(chǎn)動物生長。但是，本文研究也發(fā)現(xiàn)當(dāng)β 胡蘿卜素（1%）添加量達(dá)到2.0 g·kg－1時(shí)，脊尾白蝦的存活率與對照組相比下降了16.65%。盡管較高劑量β 胡蘿卜素導(dǎo)致脊尾白蝦死亡的機(jī)制不明，但是不能否認(rèn)β 胡蘿卜素對脊尾白蝦的積極調(diào)節(jié)效果。本實(shí)驗(yàn)規(guī)格（0.29±0.01）g的脊尾白蝦飼料中β 胡蘿卜素（1%）添加量為0.5 g·kg－1時(shí)，發(fā)現(xiàn)脊尾白蝦生長效果最好，因此在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中探明脊尾白蝦生長對β 胡蘿卜素添加濃度的響應(yīng)范圍后，β 胡蘿卜素可以作為養(yǎng)殖脊尾白蝦的一種飼料添加劑。

3.2 飼料中添加β 胡蘿卜素對脊尾白蝦抗氧化酶活性的影響

本研究對脊尾白蝦肌肉組織中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性測定表明，β 胡蘿卜素對脊尾白蝦抗氧化性有顯著影響，且依賴于β 胡蘿卜素的添加濃度。一般認(rèn)為超氧化物歧化酶通過歧化反應(yīng)把動物機(jī)體中有害的超氧自由基轉(zhuǎn)化成過氧化氫（H2O2）［12－13］，再通過過氧化氫酶將過氧化氫轉(zhuǎn)化成水，從而完成對機(jī)體的保護(hù)防御［14－15］。當(dāng)β 胡蘿卜素的添加量在0.5～1.5 g·kg－1范圍內(nèi)時(shí)，發(fā)現(xiàn)脊尾白蝦的抗氧化能力有一定程度的提升，韓繼衛(wèi)等［16］以β 胡蘿卜素飼喂三角帆蚌（Hyriopsiscumingii）時(shí)，發(fā)現(xiàn)隨著β 胡蘿卜素濃度的升高，SOD與CAT酶的活力先升高后降低，本文的結(jié)果與其相似。其他水產(chǎn)動物如仿刺參（Apostichopusjaponicus）的抗氧化能力隨飼料中β 胡蘿卜素含量（30～60 mg·kg－1）的增加而差異不明顯，但添加達(dá)到90 mg·kg－1時(shí)SOD、CAT酶 活 性 出 現(xiàn) 下 降［17］；脂 鯉（Hyphessobrycon caltistus）攝食添加類胡蘿卜素的飼料后血清中的總抗氧化能力出現(xiàn)升高，SOD活力則降低［18］；中華絨螯蟹攝食添加適量β 胡蘿卜素飼料后體內(nèi)SOD活性降低［7］，本文結(jié)果與其有所差異，但這些研究都表明β 胡蘿卜素與水產(chǎn)動物的抗氧化能力有一定的關(guān)聯(lián)性。

表3 飼料中β 胡蘿卜素添加量對脊尾白蝦抗氧化酶的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）Tab.3 Effect ofβ carotene addition in feed on antioxidant enzymes in Exopalaemon carinicauda（M ean±SD）

酸性磷酸酶和堿性磷酸酶是甲殼類動物體內(nèi)不可或缺的非特異性免疫酶，其免疫機(jī)制是直接參與磷酸基團(tuán)的化學(xué)反應(yīng)，降解生物機(jī)體體表的磷酸類物質(zhì)［19－20］，這種免疫機(jī)制是造成細(xì)胞活性氧的來源之一［21］。本研究發(fā)現(xiàn)添加β 胡蘿卜素后各添加組酸性磷酸酶活性出現(xiàn)了一定程度的增加。張坤［22］研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加含β 胡蘿卜素含量高的膠紅酵母可以顯著提高刺參（Oplopanaxelatus）的酸性磷酸酶活性，馮任勇和周小秋［23］研究也發(fā)現(xiàn)維生素A（β 胡蘿卜是一種維生素A源）提高了建鯉（C.carpiovar.jian）的酸性磷酸酶活性。在測定堿性磷酸酶活性時(shí)，本文發(fā)現(xiàn)β 胡蘿卜素的添加量在0.5～1.5 g·kg－1范圍內(nèi)堿性磷酸酶活性出現(xiàn)下降，與酸性磷酸酶的結(jié)果相反。何海琪和孫鳳［24］對中國明對蝦（Penaeuschinensis）的研究表明對蝦的堿性磷酸酶在肌肉中幾乎測不出活性，而在肝胰臟中活性很高，并認(rèn)為堿性磷酸酶具有組織特異性，因此盡管筆者測定發(fā)現(xiàn)添加一定范圍劑量β 胡蘿卜素的脊尾白蝦肌肉堿性磷酸酶活性出現(xiàn)下降，但不能認(rèn)為脊尾白蝦免疫能力的下降。

另外，本研究通過分析β 胡蘿卜素對脊尾白蝦抗氧化酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)除堿性磷酸性酶外，其他幾個酶活性相對于對照組來說都有增強(qiáng)，但變化幅度與β 胡蘿卜素的添加濃度不一致，與生長情況也不一致，表明β 胡蘿卜素對脊尾白蝦肌肉組織中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、酸性磷酸酶活性及脊尾白蝦生長情況的影響在0.5～1.5 g·kg－1范圍內(nèi)是非線性的。這種不一致現(xiàn)象在三角帆蚌［16］、仿刺參［17］、建鯉［23］的研究中也被發(fā)現(xiàn)。因此本研究認(rèn)為β 胡蘿卜素對水產(chǎn)動物非特異性免疫能力的增強(qiáng)既依賴于β 胡蘿卜素的濃度，也依賴于具體的生物種類。