李 欣，趙玉紅，張 鈞，周 浩，李登文，趙立青，石建黨，李小菊，張偉英，張翠竹

（南開大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物國家級實驗教學(xué)示范中心，天津 300071）

《國家中長期教育改革和發(fā)展規(guī)劃綱要（2010—2020 年）》明確提出：優(yōu)化學(xué)科專業(yè)、類型、層次結(jié)構(gòu)，促進(jìn)多學(xué)科交叉和融合[1-3]。學(xué)科交叉融合不僅可以拓展學(xué)生視野，帶來思維的碰撞和啟迪，激發(fā)學(xué)生的自主學(xué)習(xí)意識和創(chuàng)新實踐能力，更有助于推動高等院校學(xué)科協(xié)同發(fā)展，完善具有跨學(xué)科視野和協(xié)同創(chuàng)新意識的復(fù)合型人才培養(yǎng)機(jī)制[2-4]。

基礎(chǔ)生物化學(xué)實驗課程是我校生命科學(xué)學(xué)院生物實驗教學(xué)中心（以下簡稱“中心”）面向本校藥學(xué)專業(yè)大二年級開設(shè)的基礎(chǔ)性實驗必修課。以往的實驗教學(xué)內(nèi)容來源于本院教師多年教學(xué)成果，涵蓋了生物化學(xué)領(lǐng)域諸多重要基礎(chǔ)理論與實驗技術(shù)，知識體系成熟；但與選課學(xué)生專業(yè)關(guān)聯(lián)度弱，導(dǎo)致學(xué)生學(xué)習(xí)積極性不高。為此，中心通過開展以跨學(xué)科交叉融合為特色的實驗教學(xué)體系研究，探索并嘗試了基于學(xué)科交叉的實驗教學(xué)內(nèi)容改革，旨在打破生命科學(xué)與藥學(xué)專業(yè)課程之間的壁壘[4-5]，讓學(xué)生能夠?qū)⑸飳W(xué)的理論和方法靈活運用于藥學(xué)領(lǐng)域的相關(guān)研究中，維生素C 含量測定就是改革內(nèi)容之一。

1 實驗內(nèi)容改革

維生素C（Vc）又名抗壞血酸，是維持機(jī)體正常活動的重要維生素之一，廣泛參與機(jī)體氧化、還原等復(fù)雜代謝過程。Vc 是世界衛(wèi)生組織及聯(lián)合國工業(yè)發(fā)展組織共同確定的人類26 種基本藥物之一，可用于防治壞血病，增加人體免疫力，輔助各種急、慢性傳染性疾病，紫癜以及癌癥等多種疾病的臨床治療[6-7]。但Vc 具有強還原性，在氧化劑、熱、光、堿性物質(zhì)以及銅、鐵等金屬離子的影響下很容易被氧化分解而失效[8-9]。原實驗教學(xué)內(nèi)容只是在單一條件下對樣品中Vc含量進(jìn)行測定，并未涉及影響Vc 穩(wěn)定性諸多因素的考察。而對于藥學(xué)專業(yè)而言，研究Vc 穩(wěn)定性影響因素對于相關(guān)藥劑配方、貯存條件和藥物配伍都具有重要的實踐指導(dǎo)意義。

要考察Vc 穩(wěn)定性影響因素，首先要選擇并建立起科學(xué)合理的檢測方法。Vc 含量測定方法有很多，如碘量法、2,4-二硝基苯肼法、高效液相色譜法等，但碘量法和 2,4-二硝基苯肼法所用試劑具有一定毒性，而高效液相色譜法成本較高，均不適于受眾面廣的基礎(chǔ)實驗教學(xué)[10-11]。原教學(xué)內(nèi)容中采用2,6-二氯靛酚滴定法對Vc 進(jìn)行定量，但2,6-二氯靛酚試劑不穩(wěn)定，且滴定終點依靠主觀判斷，對于低年級本科生而言，經(jīng)常容易因?qū)嵺`經(jīng)驗不足而造成較大誤差。因此，改進(jìn)后的實驗內(nèi)容采用紫外分光光度法檢測Vc 含量變化，該方法具有準(zhǔn)確穩(wěn)定、快速簡便、試劑安全、成本低廉等諸多優(yōu)點，且不易受其他還原性物質(zhì)成分的干擾[12]。

2 主要儀器和試劑

儀器：Nanodrop2000C 超微量分光光度計；水浴鍋；酸度計；電子天平等。

試劑：Vc 標(biāo)準(zhǔn)品（購自北京索萊寶科技有限公司，分析純）；碳酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉、硫酸銅（購自天津市化學(xué)試劑供銷公司，分析純）；新煮沸后冷卻的蒸餾水等。

3 實驗方法與結(jié)果分析

3.1 溶液的配制

3.1.1 2×Vc 標(biāo)準(zhǔn)儲備液（200 mg/L）的配制

準(zhǔn)確稱取0.020 g 的Vc 標(biāo)準(zhǔn)品置于小燒杯中，用蒸餾水充分溶解；轉(zhuǎn)移到100 mL 容量瓶中，定容至刻度，搖勻后等分成2 份，用碳酸氫鈉粉末調(diào)節(jié)pH，分別配制成pH 6.0 和pH 8.0 的2×Vc 標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

3.1.2 Vc 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制

用移液器準(zhǔn)確移取50、100、200、400、500、600、750 μL 的上述pH 6.0 的2×Vc 標(biāo)準(zhǔn)儲備液，分別置于1.5 mL 棕色離心管中，用蒸餾水補足體積至1 mL，充分混勻，即配制成終質(zhì)量濃度為10、20、40、80、100、120、150 mg/L 的Vc 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

3.1.3 影響因子溶液的配制

2×焦亞硫酸鈉溶液：焦亞硫酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的水溶液，碳酸氫鈉粉末調(diào)節(jié)pH 至6.0。

100×硫酸銅溶液：硫酸銅質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的水溶液，pH 6.0。

100×乙二胺四乙酸二鈉溶液：乙二胺四乙酸二鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%水溶液，碳酸氫鈉粉末調(diào)節(jié)pH 至6.0。

3.2 最大吸收波長的選擇

分別將pH 6.0 和pH 8.0 的2×Vc 標(biāo)準(zhǔn)儲備液用蒸餾水等體積稀釋成100 mg/L 的1×工作液，以蒸餾水作為空白參比溶液，使用Nanodrop2000C 超微量分光光度計在190～840 nm 波長范圍內(nèi)分別對2 種不同pH 的1×Vc 工作液和10%碳酸氫鈉溶液進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果見圖1—3?？芍? 種不同pH 值下，Vc 的最大吸收波長均為266 nm，碳酸氫鈉在此波長處無吸收。同法檢測影響因子溶液在266 nm 處的紫外吸收，結(jié)果見圖4—6，可見影響因子溶液在此波長處同樣無干擾。由此確定紫外分光光度法檢測波長為266 nm。

圖1 pH 6.0 的1×Vc 工作液光譜掃描結(jié)果

圖2 pH 8.0 的1×Vc 工作液光譜掃描結(jié)果

3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用紫外分光光度法在波長266 nm 處，以蒸餾水為空白參比溶液，依次測定Vc 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的吸光度，結(jié)果見表1。以Vc 質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖 7。回歸方程為：y=0.0072x+0.0097，R2=0.9997，表明 Vc 質(zhì)量濃度在150 mg/L 以下與吸光度具有良好的線性關(guān)系。

圖3 10%碳酸氫鈉溶液光譜掃描結(jié)果

圖4 1×焦亞硫酸鈉溶液光譜掃描結(jié)果

圖5 1×硫酸銅溶液光譜掃描結(jié)果

圖6 1×乙二胺四乙酸二鈉溶液光譜掃描結(jié)果

表1 Vc 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度對應(yīng)的吸光度

圖7 Vc 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

3.4 Vc 穩(wěn)定性影響因素考察

3.4.1 溫度與作用時間對Vc 穩(wěn)定性的影響

將pH 6.0 的2×Vc 標(biāo)準(zhǔn)儲備液用蒸餾水等體積稀釋成100 mg/L 的1×工作液，平均分裝于3 個棕色試劑瓶中，分別置于室溫、70 ℃和99 ℃水浴鍋中，在0、15、30、60 min 時間點依次取樣，用紫外分光光度法在266 nm 波長下測定吸光度，代入圖7 中的線性回歸方程，計算Vc 相對含量變化（見表2）。結(jié)果表明，隨著溫度的升高，Vc 含量呈現(xiàn)明顯下降趨勢，說明Vc對熱不穩(wěn)定，高溫會促進(jìn)Vc 的降解，且降解程度與作用時間呈正相關(guān)。

3.4.2 pH 對Vc 穩(wěn)定性的影響

將pH 6.0 和pH 8.0 的2×Vc 標(biāo)準(zhǔn)儲備液分別用蒸餾水等體積稀釋成100 mg/L 的1×工作液，并裝入棕色試劑瓶，同時置于70 ℃水浴鍋中，在0、15、30、60 min 時間點依次取樣，用紫外分光光度法在266 nm波長下測定吸光度，由線性回歸方程計算Vc 相對含量變化（見表3）。結(jié)果表明，在相同溫度和作用時間下，Vc 在偏酸性溶液環(huán)境中相對穩(wěn)定，而在偏堿性條件下更易被破壞。

3.4.3 抗氧化劑對Vc 穩(wěn)定性的影響

將pH 6.0 和pH 8.0 的2×Vc 標(biāo)準(zhǔn)儲備液各自分別用蒸餾水和 2×焦亞硫酸鈉溶液等體積稀釋成100 mg/L 的1×工作液，并裝入棕色試劑瓶，同時置于99 ℃水浴鍋中，在0、15、30、60 min 時間點依次取樣，用紫外分光光度法在266 nm 波長下測定吸光度，由線性回歸方程計算Vc 相對含量變化（見表4）。結(jié)果表明，在相同溫度、作用時間和pH 下，抗氧化劑的加入可以明顯增加Vc 的穩(wěn)定性。

3.4.4 金屬離子及絡(luò)合劑對Vc 穩(wěn)定性的影響

將pH 6.0 的2×Vc 標(biāo)準(zhǔn)儲備液用蒸餾水等體積稀釋成100 mg/L 的1×工作液，并裝入棕色試劑瓶，按表5 分別加入乙二胺四乙酸二鈉溶液和硫酸銅溶液（硫酸銅溶液最后加），使其終濃度為1×，室溫靜置10 min，用紫外分光光度法在266 nm 波長下測定吸光度，由線性回歸方程計算Vc 相對含量變化（見表5）。結(jié)果表明，加入銅離子后Vc 含量顯著下降，而金屬離子絡(luò)合劑的加入可以有效保護(hù)Vc 免受銅離子破壞。

表2 溫度與作用時間對Vc 穩(wěn)定性的影響

表3 pH 對Vc 穩(wěn)定性的影響

表4 抗氧化劑對Vc 穩(wěn)定性的影響

表5 金屬離子（銅離子）及絡(luò)合劑對Vc 穩(wěn)定性的影響

4 實驗討論

4.1 實驗體系中pH 的確定

已有文獻(xiàn)報道，不同pH 值下Vc 的最大吸收波長會有所變化：當(dāng)pH＜6.0 時，最大吸收波長紫移；當(dāng)pH＞12.0 時，最大吸收波長紅移；而pH 值在6.0～10.0時，最大吸收波長保持一定，且Vc 在pH 為6.0 時性質(zhì)較為穩(wěn)定。本實驗的前期工作發(fā)現(xiàn)，100 mg/L 的Vc 水溶液本身pH 在4.5 左右，紫外分光光度法檢測最大吸收波長為247 nm，而用碳酸氫鈉調(diào)pH 為6.0和8.0 時，最大吸收波長穩(wěn)定為266 nm，與文獻(xiàn)報道一致。因此，本實驗選擇pH 6.0 的Vc 溶液作為研究對象，并將相關(guān)試劑pH 調(diào)至6.0～8.0，以使得后續(xù)吸光度測定能夠在恒定波長下進(jìn)行，操作更加便捷，結(jié)果更加準(zhǔn)確。

4.2 實驗條件的優(yōu)化

除了本實驗所考查的影響因素外，Vc 對光和水中溶解氧等因素同樣不穩(wěn)定，因此，本實驗一方面選用棕色離心管和棕色試劑瓶來裝Vc 溶液，盡量減少光照干擾；另一方面，本實驗涉及溶液均需要現(xiàn)用現(xiàn)配，所用蒸餾水為新煮沸冷卻后的蒸餾水，以盡量減少水中的溶解氧，更嚴(yán)格的做法是在水中通入惰性氣體如二氧化碳，這也是Vc 注射液的常用配制方法。除此之外，本實驗測定吸光度用到的是Nanodrop2000C 超微量分光光度計的基座模式，其優(yōu)點是樣品用量少，操作簡單，只需一個點樣步驟后就能夠在數(shù)秒間給出190～840 nm 的全波長掃描圖譜與最大吸收波長下的吸光度值，既節(jié)省樣品又節(jié)省時間，因此能夠有效避免因操作時間過長而導(dǎo)致Vc 含量變化，大大降低了實驗誤差。

5 教學(xué)設(shè)計

本實驗面向藥學(xué)專業(yè)大二年級學(xué)生開設(shè)，受眾面廣，實驗內(nèi)容不僅包含多組Vc 穩(wěn)定性影響因素的考察，還涉及紫外分光光度法的應(yīng)用以及較多的數(shù)據(jù)分析，而常規(guī)課堂實驗學(xué)時有限，無法充分滿足本實驗的教學(xué)需求。因此，課程組錄制了相關(guān)微課和微視頻，并掛到專門網(wǎng)站上供學(xué)生預(yù)習(xí)，學(xué)生可根據(jù)預(yù)習(xí)內(nèi)容在網(wǎng)站上與教師進(jìn)行反饋與互動。通過翻轉(zhuǎn)課堂的教學(xué)模式，教師可以在有限的學(xué)時里針對關(guān)鍵點和學(xué)生薄弱環(huán)節(jié)進(jìn)行有的放矢的講解，提高了學(xué)生自主學(xué)習(xí)能力和實驗教學(xué)效率。值得一提的是，教師會在課后布置相關(guān)的開放性思考題供學(xué)生討論，如“Vc 注射液配制中，除焦亞硫酸鈉外，還有什么常用的抗氧化劑，請設(shè)計一個實驗，考察該成分對Vc 穩(wěn)定性的影響”，開展課后研討不僅能夠夯實學(xué)生的課堂所學(xué)，激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，更有利于充分建立課堂知識與學(xué)生專業(yè)之間的關(guān)聯(lián)，進(jìn)一步體現(xiàn)學(xué)科之間的交叉性，提高學(xué)生理論聯(lián)系實踐的能力[13-14]。

6 結(jié)語

Vc 是常見的基礎(chǔ)藥物之一，廣泛用于治療和預(yù)防多種疾病，其含量穩(wěn)定性會直接影響到臨床應(yīng)用。因此，考察影響Vc 穩(wěn)定性的因素對于藥學(xué)專業(yè)中藥物制備、貯存和配伍顯得尤為重要。Vc 含量測定是我校生命科學(xué)學(xué)院面向藥學(xué)專業(yè)開設(shè)的常規(guī)實驗教學(xué)項目之一，為突出生物學(xué)基礎(chǔ)理論與實驗方法在藥學(xué)中的應(yīng)用，增強生命科學(xué)與藥學(xué)的關(guān)聯(lián)性與交叉性，課程組對原先單一條件下對樣品進(jìn)行定量的實驗教學(xué)內(nèi)容進(jìn)行改革，通過建立準(zhǔn)確、便捷、安全的紫外分光光度法，對溫度、作用時間、pH、抗氧化劑、金屬離子和絡(luò)合劑等因素導(dǎo)致的Vc 含量變化進(jìn)行了檢測。改革后的實驗內(nèi)容與藥學(xué)專業(yè)領(lǐng)域的研究內(nèi)容更加契合，對于打破學(xué)科知識界限，促進(jìn)2 個學(xué)科知識技能的深度融合，進(jìn)一步培養(yǎng)學(xué)生綜合素質(zhì)與協(xié)同創(chuàng)新能力具有積極作用[15]。