岳寧波 李云洲 王 勇 高 彬 吳 浪 須 文 閆見敏 秦 蕾

(1貴州大學農(nóng)學院，貴州 貴陽 550025；2中國農(nóng)業(yè)大學園藝學院，北京 100083；3 東北農(nóng)業(yè)大學園藝學院，黑龍江 哈爾濱 150000)

番茄(Solanum lycopersicom)屬茄科番茄屬經(jīng)濟作物，因其含有番茄紅素、類黃酮、β-胡蘿卜素等營養(yǎng)元素深受人們喜愛[1-2]。然而，各種不良環(huán)境對番茄的生產(chǎn)造成了嚴重威脅。優(yōu)化番茄的農(nóng)藝性狀是提高番茄產(chǎn)量的重要途徑。側(cè)枝及根系的發(fā)育是番茄生產(chǎn)中重要的農(nóng)藝性狀，良好的植株形態(tài)對番茄的生長發(fā)育具有重要影響。作物的水分和養(yǎng)分均通過根系獲取[3]，理想的根系和枝條結(jié)構(gòu)是影響作物產(chǎn)量的重要因素[4-5]。此外，根系還能為植株提供機械支持，產(chǎn)生激素，影響植株的生長發(fā)育及生理生化過程[6]。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)達的植株根系，不僅能夠提高作物氮素的利用效率，而且能提高產(chǎn)量，根系較發(fā)達的植株在養(yǎng)分及水分獲取中擁有更強的競爭力[7]。增加側(cè)根形成可以促進整個番茄植株發(fā)育，從而提高番茄的產(chǎn)量[8]。

促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)普遍存在于真核生物，且在進化過程中高度保守，能夠控制細胞的分化，參與真核生物的應(yīng)激反應(yīng)[9-10]。MAPK 級聯(lián)反應(yīng)途徑主要由MAPK、MAPK 的激酶(MAP kinase kinase，MAPKK)、MAPKK的激酶(MAP kinase kinase kinase，MAPKKK)三部分組成[11-12]，幾乎參與了植物生長發(fā)育的每個過程[13]。同時，MAPK 還參與生長素、乙烯、脫落酸等植物激素的信號轉(zhuǎn)導途徑[14-16]。MAPK 按照結(jié)構(gòu)的不同，分為A、B、C、D 共4 個亞組，其中SlMAPK6 處于B 亞組。孔福苓[17]通過順式元件分析發(fā)現(xiàn)，SlMAPK6 存在分生組織表達、胚乳表達、中胚層發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子等相關(guān)元件，推測其在番茄發(fā)育過程中也發(fā)揮重要作用。

CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein 9)基因編輯技術(shù)在2013年首次應(yīng)用于植物基因編輯[18]。在CRISPR系統(tǒng)中，單導向RNA(single-guide RNA，sgRNA)與Cas9 核酸酶結(jié)合形成穩(wěn)定復合物，對靶標DNA 進行切割[19-20]，在靶標DNA 雙鏈斷裂后，通過非同源末端連接或同源定向修復的激活機制，實現(xiàn)靶標基因的特異性編輯[21]。目前，CRISPR/Cas9 技術(shù)已應(yīng)用于多種農(nóng)作物，如番茄[22-23]、葡萄[24]、芥藍[25]、水稻[26]等。

本研究通過CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)研究SlMAPK6 在番茄生長發(fā)育中的功能，旨在為番茄分子育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

番茄材料為矮番茄自交系，引自西北農(nóng)林科技大學園藝學院番茄種質(zhì)資源庫，保存于貴州大學農(nóng)學院植物病理實驗室。

1.2 sgRNA 的設(shè)計與CRISPR/Cas9 載體的構(gòu)建

通過Sol Genomics Network 網(wǎng)站獲得SlMAPK6 基因(登錄號:Solyc05G049970)序列，利用DISIGN 在線軟件(http:/ /crispr.mit.edu/)對外顯子部分進行靶位點分析，選擇敲除3 個靠近基因編碼區(qū)5′端、GC 含量不低于43%的靶序列[27]。通過DNA 重組技術(shù)構(gòu)建CRISPR/Cas9 載體，命名為SlMAPK6-CRISPR，將SlMAPK6-CRISPR 載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，在含有卡那霉素(Kan)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落PCR 后進行測序驗證，并將獲得陽性菌株用70%甘油保存于-80℃，備用。

1.3 農(nóng)桿菌介導的番茄遺傳轉(zhuǎn)化

番茄遺傳轉(zhuǎn)化方法參照Chetty 等[28]的方法并加以優(yōu)化。番茄種子用1% NaClO 消毒3 ～5 min 后，用無菌蒸餾水沖洗6 次，置于1/2MS 培養(yǎng)基(2.21 g·L-1MS＋30 g·L-1蔗糖＋7 g·L-1瓊脂)上，在25℃、16 h/8 h(光照/黑暗)的人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)。取生長7 d 的番茄無菌苗切取子葉，將其在預培養(yǎng)基[4.42 g·L-1MS ＋2.0 mg·L-16-芐氨基腺嘌呤(6-benzylaminopurine，6-BA) ＋0.1 mg·L-1吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid，IAA) ＋30 g·L-1蔗糖＋7 g·L-1瓊脂]上培養(yǎng)2 d 后用于遺傳轉(zhuǎn)化。用含有目的載體的農(nóng)桿菌菌液浸染1 ～2 min，轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)基(4.42 g·L-1MS ＋2.0 mg·L-16-BA ＋0.1 mg·L-1IAA ＋30 g·L-1蔗糖＋7 g·L-1瓊脂)生長2 d；然后轉(zhuǎn)入延遲篩選培養(yǎng)基(4.42 g·L-1MS ＋2.0 mg·L-16-BA ＋0.1 mg·L-1IAA ＋350 mg·L-1Timentin＋30 g·L-1蔗糖＋7 g·L-1瓊脂)生長7 d；再轉(zhuǎn)入抗性篩選培養(yǎng)基(4.42 g·L-1MS＋2.0 mg·L-16-BA＋0.1 mg·L-1IAA ＋30 mg·L-1Kan＋30 g·L-1蔗糖＋7 g·L-1瓊脂)進行篩選。每15 d 繼代1 次，培養(yǎng)基同抗性篩選培養(yǎng)基。待不定芽長至1 ～3 cm 后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(2.21 g·L-1MS＋30 g·L-1蔗糖＋7 g·L-1瓊脂)，長出不定根后移植至滅菌土壤中培養(yǎng)。

1.4 突變體植株的分子檢測與表型鑒定

取抗性植株的葉片約0.1 g，采用CTAB 法提取基因組總DNA 進行PCR 擴增。PCR 擴增使用卡那基因特異性引物Kan-F 和Kan-R(表1)，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。根據(jù)靶序列設(shè)計特異引物，使用引物SlMAPK6-Target1-F、SlMAPK6-Target1-R，SlMAPK6-Target2-F、SlMAPK6-Target2-R 和SlMAPK6-Target3-F、SlMAPK6-Target3-R(表1)對所有抗性植株的基因組DNA 進行PCR 擴增驗證靶點，以O(shè)ff-target1-F、Offtarget1-R，Off-target2-F、Off-target2-R、Off-target3-F、Offtarget3-R、Off-target4-F、Off-target4-R(表1)進行PCR擴增檢測是否脫靶并送樣測序，使用DNAMAN 軟件進行序列比對分析。對T1植株的表型進行觀察和拍照，測量根長、莖徑，統(tǒng)計不定根及側(cè)枝數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 sgRNA 的設(shè)計和SlMAPK6-CRISPR 載體的構(gòu)建

根據(jù)軟件分析，分別在SlMAPK6 基因的第1、第2、第3 個外顯子上共選取了3 個靶位點，即GGTGGGC ACAGTAACATAAGAGG，GATAAAGCTTCTCAGTCAC ATGG，CCAACAGCTGACTGATGAACACT(圖1)。回收純化sgRNA-SlMAPK6 片段并與酶切后的載體連接，成功獲得SlMAPK6-CRISPR 重組質(zhì)粒(圖2)。

圖1 SlMAPK6 基因圖示與靶點位置和序列Fig.1 Schematic of the SlMAPK6 gene，and the sgRNA target site and sequence

2.2 脫靶率檢測

根據(jù)CRISPR-P 在線軟件(http:/ /crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)檢測SlMAPK6 可能存在的脫靶位點，在得分較高的外顯子區(qū)域，隨機選取4 個潛在脫靶位點對T1番茄植株進行脫靶驗證，所用的脫靶驗證引物見表1，PCR 驗證后測序，并進行比對，結(jié)果顯示，SlMAPK6 被成功編輯，可用于后續(xù)試驗。

表1 試驗中所用的引物Table1 The primers used in this study

圖2 SlMAPK6-CRISPR 載體結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Carrier structure of the SlMAPK6-CRISPR

表2 潛在脫靶序列的突變Table2 Potential off-target sites

2.3 CRISPR/Cas9 介導的SlMAPK6 基因突變類型的分析

對2 株突變株CRISPR-3、CRISPR-7 的SlMAPK6基因靶位點上下游序列比對分析發(fā)現(xiàn)，3 個靶點中target1 和target2 均有突變，靶點target3 在CRISPR-7株系中有突變，但在CRISPR-3 株系中并未發(fā)生突變(圖3-C)。

CRISPR-3 株系在靶點target1 下游發(fā)生堿基替換，造成該突變株的編碼氨基酸發(fā)生變化，替換堿基數(shù)為5 bp(圖3-A)。CRISPR-7 株系在靶點target1 上有2 處堿基替換，而在該靶點下游有8 處堿基發(fā)生替換，其中有2～3 個堿基發(fā)生連續(xù)替換突變(圖4-A)。

CRISPR-3 在靶點target2 上發(fā)生3 處堿基替換和1處堿基缺失，而CRISPR-7 在靶點target2 上發(fā)生2 處堿基替換、1 處堿基缺失和1 處堿基插入(圖4-B)。2 個突變株系在靶點target2 發(fā)生堿基缺失位置相同(圖3-B)。

CRISPR-7 在3 個靶點均發(fā)生了堿基替換，在靶點target2 出現(xiàn)堿基缺失和堿基插入(圖4)；CRISPR-3在靶點target1 和target2 出現(xiàn)堿基突變，但在靶點target3 未發(fā)現(xiàn)突變(圖3-C)。雖然2 個株系突變的方式和位置不同，但是2 個突變株的SlMAPK6 基因均被成功編輯。

2.4 CRISPR/Cas9 介導的SlMAPK6 基因突變株的表型

T0培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，與野生型(WT)相比，突變株系都表現(xiàn)出了莖徑增加、側(cè)枝增加、根系更為發(fā)達的表型。將CRISPR-3 和CRISPR-7 的T1幼苗種植在滅菌的土壤中，在正常生長條件下，T1表現(xiàn)出根系更為發(fā)達、側(cè)枝增多的表型。該表型自幼苗期開始至成熟期一直顯著，在幼苗期，突變體CRISPR-3 和CRISPR-7 根長分別是WT 的2.13 倍和1.82 倍，且WT 無不定根，突變體擁有數(shù)量不一的不定根，根系面積也明顯增大；突變體CRISPR-3 和CRISPR-7 的后代的側(cè)枝數(shù)分別是WT 的1.69 倍和2.01 倍。在成熟期，突變體CRISPR-3 和CRISPR-7 根長分別是WT 的1.71 倍和1.61 倍，突變體的不定根顯著增加，WT 均無不定根；突變體CRISPR-3 和CRISPR-7 后代的側(cè)枝數(shù)分別是WT 的1.71 倍及1.55 倍。無論是幼苗期還是成熟期，突變體的莖徑一直顯著高于WT(圖4和表3)。結(jié)合突變株系的序列分析結(jié)果(圖3)及潛在脫靶位點(表2)驗證可知，突變株中的SlMAPK6 基因已被成功敲除，且敲除矮番茄SlMAPK6 基因后促進了番茄植株的根系生長及側(cè)枝發(fā)育。

表3 T1 野生型(WT)及突變體(CRISPR－3 和CRISPR－7)表型數(shù)據(jù)對比Table3 Comparison of phenotypic data of wild-type and mutant (CRISPR－3 and CRISPR－7) in T1 genegration

圖3 CRISPR/Cas9 介導的番茄SlMAPK6 基因突變類型Fig.3 The type of CRISPR/Cas9 system-induced SlMAPK6 mutation in Solanum lycopersicum

3 討論

本研究通過 CRISPR-Cas9 技術(shù)敲除番茄SlMAPK6，利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)傳遞Cas9 核酸酶和3 個sgRNA 進入番茄基因組，部分突變體植株實現(xiàn)了3 個sgRNA 靶標位點之間DNA 堿基或片段的缺失、替換和插入。本研究還發(fā)現(xiàn)番茄SlMAPK6 突變株CRISPR-3 和CRISPR-7 的形態(tài)普遍出現(xiàn)莖部增粗、側(cè)枝增加、根系更為發(fā)達、不定根數(shù)量增加等現(xiàn)象。突變株CRISPR-7 在靶點target1、target2、target3 均有發(fā)生突變，突變株CRISPR-3 在靶點target1、target2 發(fā)生突變，在靶點target3 未發(fā)生突變，其中靶點target1 和target3 處的突變主要是堿基替換，而靶點target2 附近發(fā)生堿基插入和堿基缺失突變，使該基因編碼區(qū)產(chǎn)生移碼突變，導致SlMAPK6 蛋白翻譯過程提前終止，從而使得SlMAPK6 蛋白失去原有的功能，這可能是造成番茄植株形態(tài)發(fā)生明顯變化的主要原因。

圖4 SlMAPK6 突變體(CRISPR－3 和CRISPR－7)T1與野生型表型Fig 4 SlMAPK6 mutants (CRISPR－3 and CRISPR－7)T1 and wild-type phenotypes

理想的植株形態(tài)是決定作物產(chǎn)量的核心因素[29]。植株側(cè)枝及根系的發(fā)育主要受遺傳、環(huán)境和激素的影響[5，30-31]。多項研究表明，MAPK 激酶信號通路參與調(diào)控植株的生長發(fā)育[9]。Shi 等[32]通過在煙草過表達GhMAPK7 促進了種子的萌發(fā)，且在同一條件下過表達植株生長更快，葉片也明顯大于野生型植株；Jia 等[33]發(fā)現(xiàn)，MKK7-MPK6 級聯(lián)反應(yīng)磷酸化PIN1 蛋白，調(diào)控擬南芥枝條分支、花絲生長和側(cè)根的形成。激素也是影響植株形態(tài)形成的重要因素，Deng 等[34]研究發(fā)現(xiàn)番茄生長素基因IAA15(SlIAA15)編碼的蛋白質(zhì)可調(diào)節(jié)植株中的生長素信號傳導，反向遺傳學方法證明SlIAA15 在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育方面發(fā)揮重要作用，SlIAA15 下調(diào)株系表現(xiàn)為葉片及莖部的絨毛數(shù)量減少，同時降低植株的頂端優(yōu)勢并伴隨腋芽、側(cè)根數(shù)目增加和坐果減少。本試驗同樣發(fā)現(xiàn)SlMAPK6 敲除株系表現(xiàn)出側(cè)根數(shù)目增多，但坐果數(shù)增加，推測SlMAPK6 與SlIAA15 分別調(diào)控番茄的側(cè)枝及側(cè)根發(fā)育途徑，且不在同一個通路上，還需后續(xù)研究以證實。

獨腳金內(nèi)酯是調(diào)節(jié)植株地上和地下形態(tài)形成的植物激素[35-37]。Kapulnik 等[38]發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中，獨角金內(nèi)酯會抑制擬南芥?zhèn)雀男纬?，番茄類胡蘿卜素裂解雙氧合酶8(SlCCD8)可以調(diào)控番茄獨腳金內(nèi)酯的合成；Kohlen 等[39]通過RNAi 技術(shù)干擾SlCCD8 評估其在番茄根際信號傳導中的作用，SlCCD8 敲除株系表現(xiàn)出腋芽分支增加、植株高度降低、節(jié)數(shù)增加和不定根增多等現(xiàn)象。Gao 等[40]通過 CRISPR-Cas9 獲得的NtCCD8 的突變體也發(fā)現(xiàn)了分枝增加、側(cè)根增多的表型，SlCCD7 編碼一種能夠裂解環(huán)狀和非環(huán)狀類胡蘿卜素的酶，Vogel 等[41]通過表達SlCCD7 反義鏈干擾其表達，結(jié)果顯示SlCCD7 干擾株系表現(xiàn)出分枝顯著增加。SlCCD7、SlCCD8 干擾株系的表型都與本試驗SlMAPK6敲除株系極為相似，暗示SlMAPK6 很可能是通過SlCCD7、SlCCD8 調(diào)控獨腳金內(nèi)酯來調(diào)控根系的生長發(fā)育。SlMAPK6 敲除株系表型是否與植物激素IAA、細胞分裂素(cytokinin，CK)及獨角金內(nèi)酯的含量有關(guān)，在后續(xù)研究中，將會對這些問題進行進一步研究。

4 結(jié)論

本研究通過CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)對番茄SlMAPK6 基因進行敲除突變，獲得2 個突變體CRISPR-3 和CRISPR-7，在正常生長條件下顯著促進了番茄的枝條及根系的生長發(fā)育。SlMAPK6 基因敲除突變體將為培育具有良好植株形態(tài)和功能的番茄品種提供材料基礎(chǔ)，同時為進一步探究SlMAPK6 的功能奠定基礎(chǔ)。