王鈞濤 陳木溪 李立斌 伍健繽 雷建軍 陳國菊 曹必好 陳長(zhǎng)明

(1華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東 廣州 510642；2廣東和利農(nóng)種業(yè)股份有限公司，廣東 汕頭 515800；3廣東和利農(nóng)農(nóng)業(yè)研究院有限公司，廣東 汕頭 515800)

活性氧(reactive oxygen species，ROS)由有氧代謝產(chǎn)生，可以在任何生物細(xì)胞的任何部位產(chǎn)生[1]。ROS包括超氧陰離子()、羥基自由基(·OH)等含氧自由基，也包括過氧化氫(H2O2)、單線態(tài)氧(1O2)等非自由基形式的含氧分子，其中可被過氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)催化生成H2O2。H2O2可進(jìn)行兩類反應(yīng)，第一類通過抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)(ascorbate-glutathione cycle，ASA-GSH)生成水，此類反應(yīng)可清除ROS，該循環(huán)由抗壞血酸(ascorbate，ASA)和還原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)組成[2]，該途徑分布于植物葉綠體、線粒體和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，抗壞血酸過氧化物酶(aseorbate peroxidase，APX)是其中的關(guān)鍵酶[3]；第二類反應(yīng)是通過哈伯韋斯(Haber-weiss)反應(yīng)和芬頓(Fenton)反應(yīng)生成高度活潑的·OH，此成分是破壞性最強(qiáng)的活性氧，氧化電位(2.80 V)僅次于氟(2.70 V)[4]。此外，ROS 也是植物體內(nèi)重要的應(yīng)激信號(hào)之一，使用H2O2對(duì)植物體進(jìn)行預(yù)處理，可顯著提高植物對(duì)非生物脅迫的耐受性[5]。

Foyer 等[6]于1976年發(fā)現(xiàn)了以ASA 為電子供體的過氧化物酶。1981年Nakano 等[7]確定此酶為APX。APX 通過催化ASA 和H2O2反應(yīng)，使其生成單脫氫抗壞血酸自由基(monodehydroascorbate，MDA)和水，以清除植物體內(nèi)的H2O2[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，敲除OsAPX2 的突變體水稻(Oryza sativa)中APX 活性明顯下降，植物體表現(xiàn)為對(duì)多種逆境脅迫敏感，且H2O2和MDA 含量較高[10]；在缺少AtAPX6的擬南芥(Arabidopsis thaliana)種子中ROS 的水平更高，并顯示出氧化損傷[11]；過表達(dá)APX基因明顯地提高了煙草(Nicotiana tabacumL.)和苜蓿(Medicago sativa)的抗逆性狀[12]。Panchuk 等[13]和Mullineaux 等[14]研究表明，APX 在熱脅迫、傷害脅迫中有重要作用。APX 還會(huì)和其他抗逆基因產(chǎn)生協(xié)同作用以提高植物抗逆性；Shafi 等[15]研究表明，與野生型植株或過表達(dá)單一基因植株相比，同時(shí)過表達(dá)超氧化物酶(superoxide dismutase，SOD)和APX基因的擬南芥植株在鹽脅迫下積累更高的生物量和纖維素含量。此外，在干旱條件下，高粱[Sorghum bicolor(L.) Moench]的APX基因和谷胱甘肽過氧化物酶(glutatione peroxidase，GPX)基因的表達(dá)量表現(xiàn)出了協(xié)同調(diào)節(jié)現(xiàn)象[16]。H2O2是唯一具有跨膜高滲透性和較高穩(wěn)定性的ROS[17]，APX的存在對(duì)于植物ROS 信號(hào)調(diào)節(jié)具有至關(guān)重要的作用。在OsAPX4-RNAi 的水稻植株中，Rubisco 的羧化速率大幅增加，并間接導(dǎo)致光合作用蛋白和其他活性氧清除系統(tǒng)蛋白的相關(guān)基因大量表達(dá)[16]；在正常生長(zhǎng)條件下基因沉默并未影響植物的生長(zhǎng)，但OsAPX4-RNAi 的植株出現(xiàn)了早衰的現(xiàn)象，同時(shí)對(duì)各類脅迫和衰老信號(hào)更為敏感[18]，可見APX基因?qū)S持植物的正常生理活動(dòng)及增強(qiáng)植物的抗逆性狀具有重要意義。目前，已經(jīng)在水稻、煙草、小麥(Triticum aestivumL.)、番茄(Lycopersicon esculentumMill.) 和茄子(Solanum melongenaL.)等重要經(jīng)濟(jì)作物中克隆并鑒定了APX基因[19-23]。

蕓薹屬(Brassica)是十字花科中最重要的屬，含40 余個(gè)種，其中包括許多重要的蔬菜、油料及飼料作物[24]，蕓薹屬作物具有對(duì)高溫、低滲、高鹽環(huán)境和除草劑敏感的特點(diǎn)，使其栽培過程受到較大的限制，因此對(duì)蕓薹屬作物的抗逆基因進(jìn)行分析具有重要的意義。在20世紀(jì)上葉通過細(xì)胞學(xué)研究，推測(cè)大白菜(B.rapa，n ＝10)、黑芥(B.nigra，n ＝8)和甘藍(lán)(B.oleracea，n ＝9)這3 個(gè)染色體數(shù)目較少的物種為蕓薹屬作物的二倍體基本種，基本種之間兩兩雜交形成了芥菜(B.juncea，n ＝18)、歐洲油菜(B.napus，n ＝19)和埃塞俄比亞芥(B.carinata，n ＝17)這3 個(gè)染色體數(shù)目較多的異源四倍體種[25]。韓國學(xué)者Nagaharu[26]通過種間雜交證實(shí)了這個(gè)推測(cè)，并用三角形表示這六種作物之間的親緣關(guān)系，即禹氏三角。目前對(duì)蕓薹屬作物中的APX家族基因的鑒定和分析鮮見報(bào)道，本試驗(yàn)以禹氏三角上的大白菜、甘藍(lán)和歐洲油菜為目標(biāo)物種，鑒定APX基因，分析其基因結(jié)構(gòu)、染色體分布、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和APX基因的進(jìn)化指數(shù)，并通過已發(fā)布的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)APX基因進(jìn)行表達(dá)分析，以期為進(jìn)一步研究蕓薹屬植物APX家族基因成員在逆境脅迫中的功能提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 APX 家族基因的生物信息學(xué)鑒定

擬南芥、大白菜和甘藍(lán)的基因組下載自數(shù)據(jù)庫Ensembl Plants(http:/ /plants.ensembl.org/)，歐洲油菜基因組下載自數(shù)據(jù)庫Brassicadatabase (http:/ /brassicadb.org/)。以從NCBI 下載的8 個(gè)擬南芥APX基因序列為探針，通過makeblastdb 命令建立本地大白菜、甘藍(lán)和歐洲油菜的編碼序列(coding sequence，CDS) BLAST 數(shù)據(jù)庫，并使用本地BLAST[27]進(jìn)行比對(duì)，E-value 值設(shè)為1e-5。找到候選的大白菜、甘藍(lán)和歐洲油菜的APX同源基因，去除重復(fù)、冗余以及假基因。

1.2 APX 染色體定位和基因序列分析

檢索擬南芥、大白菜、甘藍(lán)和歐洲油菜的基因組注釋文件(gff)中APX基因的注釋信息并制成表格；將APX基因的基因名，所在染色體名稱，起始、終止位點(diǎn)，染色體長(zhǎng)度信息輸入至TBtools[28]進(jìn)行染色體定位制圖。使用工具SAMtools[29]提取擬南芥、大白菜、甘藍(lán)和歐洲油菜APX的CDS 和蛋白序列。將序列輸入到ExPASy ProtParam (http:/ /web.expasy.org/compute＿pi/)進(jìn)行APX 蛋白分子量、等電點(diǎn)預(yù)測(cè)。

1.3 APX 基因的進(jìn)化樹構(gòu)建和分析

將擬南芥、大白菜、甘藍(lán)和歐洲油菜共49 個(gè)APX氨基酸序列經(jīng)MAFFT[30]多重比對(duì)以后輸入到MEGA7.0 中，采用最大似然法(maximum likelihood method)構(gòu)建APX 蛋白進(jìn)化樹，步長(zhǎng)校驗(yàn)(bootstrap)設(shè)為1 000 次。

1.4 APX 蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

使用生物信息學(xué)分析工具h(yuǎn)mmer[31]的子程序hmmscan 掃描APX 蛋白序列獲得結(jié)構(gòu)域(domain)信息，E-value 設(shè)為1e-5；通過工具M(jìn)EME[32](http:/ /meme.org)預(yù)測(cè)APX 基因核酸序列和蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域(Motif)，預(yù)測(cè)數(shù)量設(shè)為最多10 個(gè)。通過生物信息學(xué)分析工具TBtools[28]對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行分析與繪圖。將APX 的氨基酸序列輸入至軟件Ⅰ-TASSER[33]進(jìn)行蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，使用model1.pdb 文件作為結(jié)果，并將結(jié)果拼接至環(huán)狀進(jìn)化樹上，分析結(jié)果。

將各基因通過軟件BLAST 相互比對(duì)，將比對(duì)結(jié)果以默認(rèn)形式輸出，上傳至工具circollto(http:/ /tools.bat.infspire.org/circoletto/)進(jìn)行circos 共線性的圖片輸出。分析輸出結(jié)果，將相互連線的基因作為基因?qū)斎胫罰araAT[34]，以模型平均(model averaging，MA)的方式進(jìn)行選擇壓力(Ka/Ks)分析。

1.5 APX 基因在逆境脅迫下的表達(dá)分析

通過NCBI(https:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索大白菜、甘藍(lán)和歐洲油菜中與逆境脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。經(jīng)過篩選選擇大白菜在高溫脅迫下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(NCBI 登錄號(hào)為PRJNA253868)，試驗(yàn)以大白菜[Brassica rapavar.trilocularis，種子來自加拿大國家研究委員會(huì)(National Research Council of Canoda，NRC)植物生物技術(shù)研究所]的胚、胚乳、14 和32 d 的葉片、未開放的花蕾、受精和未受精的胚珠以及花粉為材料，進(jìn)行42℃高溫處理。在甘藍(lán)中，選擇NCBI 登錄號(hào)為PRJNA453960 和PRJNA490257 的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)；其中PRJNA453960 以根腫病抗性甘藍(lán)xiangan336(CRXG336)和根腫病易感型甘藍(lán)景峰1 號(hào)(CS-JF1)的根部為材料，分別在感染后7(根腫病原發(fā)感染)和28 d(根腫病形成階段)進(jìn)行采樣；PRJNA490257 以白粉虱抗性甘藍(lán)(荷蘭溫姆海森Bojo Zaden B.V.的Rivera，Brassica oleraceavar.capitate)和白粉虱敏感型甘藍(lán)(荷蘭瓦戈寧根遺傳資源中心自留種)的葉片為材料，在播種后第49 天開始處理，連續(xù)使用白粉虱侵染4 d 并采樣。選擇NCBI 登錄號(hào)為PRJNA389508 的歐洲油菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，以歐洲油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系恢復(fù)系(09Y42，河南大學(xué)棉花生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開發(fā))的葉片為材料，在4 片真葉期分別進(jìn)行4℃低溫脅迫、40℃高溫脅迫、15%聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)滲透脅迫、30 μmol·L-1脫落酸(abscisic acid，ABA)和150 mmol·L-1NaCl 處理12 h 并采樣。將檢索到的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)通過prefetch 下載，fastq-dump 解壓為fastq.gz 文件，輸入至分析工具Salmon[35]進(jìn)行快速定量。取定量結(jié)果TVM 列，整合成表，提取APX 基因的表達(dá)數(shù)據(jù)并使用TBtools 繪制熱圖，進(jìn)行表達(dá)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 APX 家族基因成員的鑒定與染色體定位

以8 個(gè)擬南芥APX基因?yàn)樘结樞蛄?，通過makeblastdb 命令建立本地大白菜、甘藍(lán)和歐洲油菜的CDS BLAST 數(shù)據(jù)庫，經(jīng)本地BLAST 比對(duì)，去除假基因(pesudo gene)和可變剪切后，分別在大白菜、甘藍(lán)和歐洲油菜中得到9、10 和22 個(gè)APX基因的cDNA 序列全長(zhǎng)。按照與擬南芥APX基因的比對(duì)結(jié)果進(jìn)行命名，分為拉丁名簡(jiǎn)寫(如擬南芥為At，大白菜為Br)、APX和對(duì)應(yīng)基因名(如擬南芥為AtAPX1，其對(duì)應(yīng)的大白菜同源基因如果有3 個(gè)，分別為BaAPX1a、BaAPX1b、BaAPX1c)三部分；歐洲油菜的基因按照其所處的染色體位置分別命名為-o(來源于甘藍(lán))和-r(來源于大白菜)，例如來源于甘藍(lán)則為BnAPX1a-o。來自同一擬南芥基因比對(duì)結(jié)果的基因序列稱為同組序列。根據(jù)以上規(guī)則，將49 個(gè)APX基因分別命名為AtAPX1 ～BnAPXTha-r(表1)。

表1 3 種蕓薹屬作物與擬南芥的APX 家族基因的基本信息Table1 The sequence information of the APX gene family in three Brassica crops and Arabidopsis thaliana

表1 (續(xù))

將49 個(gè)APX基因所在的染色體信息制成染色體定位圖(圖1)。結(jié)果表明，8 個(gè)擬南芥APX基因分布在3 條染色體上，其在第4 條染色體上比較集中，有5個(gè)APX基因，另外3 個(gè)APX基因分布在第1、第3 條染色體上。甘藍(lán)、大白菜和歐洲油菜中的APX基因在染色體上分布較為分散，其中大白菜的9 個(gè)APX基因分布在A01、A03、A06、A07、A08、A09 染色體上，甘藍(lán)的10 個(gè)APX基因分布在C01、C03、C05、C06、C07、C08、C09 染色體上。歐洲油菜的22 個(gè)APX基因分布在A01、A03、A06、A07、A09、Ann、C01、C02、C03、C05、C06、C07、C08、C09 染色體上。從進(jìn)化上分析，大白菜A01、A03、A06 和A07 染色體上的APX基因傳遞到了對(duì)應(yīng)的歐洲油菜染色體上，而A08 染色體上的BrAPX1a和A01 染色體上的BrAPXSta未出現(xiàn)在歐洲油菜對(duì)應(yīng)染色體上。甘藍(lán)的APX基因都在歐洲油菜上得到了完整的保留，而歐洲油菜的A01 染色體上新出現(xiàn)了BnAPX5a-r和BnAPX2a-r1，歐洲油菜的C02 染色體上新產(chǎn)生了BnAPXTha-o2，該基因來源尚不明確。

圖1 3 個(gè)蕓薹屬作物與擬南芥的APX 基因在基因組染色體上的分布位置Fig.1 Distribution of APX genes in three Brassica crops and Arabidopsis thaliana on genomic chromosomes

2.2 APX 家族基因序列分析

由表1可知，3 種蕓薹屬作物APX基因所含平均堿基數(shù)從小到大依次為APX2(782 bp)、APX1(783 bp)、APX5(842 bp)、APX3(864 bp)、APX6(963 bp)、APX4(1 075 bp)、APXSt(1 077 bp)、APXTh(1 294 bp)。APX內(nèi)含子從5 個(gè)到11 個(gè)不等，其中APXTh組的內(nèi)含子數(shù)量偏多(9～11 個(gè))，而APX1 組的內(nèi)含子數(shù)量最少(5 個(gè)左右)；內(nèi)含子數(shù)量和基因序列長(zhǎng)度和擬南芥基本保持一致。編碼APX蛋白的氨基酸長(zhǎng)度集中在249 ～441 個(gè)氨基酸，其中最短的為BnAPX1a-r(249 aa)，最長(zhǎng)的為BrAPXTh-r(411 aa)；氨基酸平均分子量為77.78 kDa，其中分子量最小的為大白菜BrAPX2a(61.65 kDa)，最大的也來自大白菜BrAPXTha(111.73 kDa)；等電點(diǎn)平均為5.079 ，其中最低的是來自甘藍(lán)的BoAPXTha(4.97)，最高的是來自歐洲油菜的BnAPX1a-o(5.13)。

2.3 APX 家族基因進(jìn)化和蛋白結(jié)構(gòu)分析

為分析APX 家族基因的進(jìn)化特點(diǎn)，以擬南芥、大白菜、甘藍(lán)和歐洲油菜共49 個(gè)APX基因的蛋白序列，經(jīng)MAFFT 多重比對(duì)后在Mega7.0 環(huán)境下以最大似然法構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，并分析對(duì)應(yīng)APX基因的CDS 保守結(jié)構(gòu)域(CDS motif)、蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域(protein motif)以及基因結(jié)構(gòu)域(gene structure)，見圖2。由于同族序列在進(jìn)化樹上緊密的結(jié)合在一起，將進(jìn)化樹以BLAST 比對(duì)結(jié)果進(jìn)行劃分，APX1 組到APXTh組分別對(duì)應(yīng)羅馬數(shù)字Ⅰ～Ⅷ(APXSt組對(duì)應(yīng)Ⅶ，APXTh組對(duì)應(yīng)Ⅷ)，由此將進(jìn)化樹分為8 個(gè)亞族。其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ亞族在CDS 保守域的構(gòu)成和排列順序上均完全一致，且域外序列較短；在蛋白保守域的構(gòu)成和排列上，除了Ⅴ亞族缺少M(fèi)otif 9 以外，它們的構(gòu)成和排列順序亦完全一致；在包含內(nèi)含子的DNA 序列上，也擁有相近的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。Ⅶ和Ⅷ亞族擁有相似的CDS 保守域和蛋白保守域，Ⅷ亞族比Ⅶ亞族在CDS 保守域上多一個(gè)Motif 7，蛋白保守域在同一位置上多一個(gè)Motif 10，除此之外整體非常相似。Ⅳ亞族和Ⅵ亞族相對(duì)于其他亞族在CDS 保守域和蛋白保守域上相似性較低；Ⅳ亞族的CDS 保守域構(gòu)成和排列較為相似，僅有BnAPX4a-r包含一個(gè)額外的Motif 9，表明Ⅳ亞族的CDS 序列擁有一定的保守程度。此外，Ⅳ亞族在蛋白保守域上擁有較高的相似性，表明Ⅳ亞族在蛋白序列上擁有較高的保守程度；Ⅵ亞族在CDS 保守域的構(gòu)成和排列上差異較大，且Motif 7 和Motif 9 之間的距離差異較大，表明Ⅵ亞族CDS 序列保守程度較低，但Ⅵ亞族在蛋白保守域的構(gòu)成和排列上差異較小，表明Ⅵ亞族的蛋白序列保守程度較高。

采用環(huán)形樹狀圖并在樹末端附上對(duì)應(yīng)APX基因的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖(圖3)。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ亞族在三級(jí)結(jié)構(gòu)上較為相似，其中Ⅰ、Ⅱ亞族三級(jí)結(jié)構(gòu)高度相似。由于BnAPX1c-r、BrAPX1c、Ⅲ亞族和Ⅴ亞族擁有少量peroxidase 結(jié)構(gòu)域以外的冗余序列，它們相比其他序列結(jié)構(gòu)稍微復(fù)雜一些。Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅷ亞族在空間結(jié)構(gòu)上擁有更大的空間深度，由于在peroxidase 結(jié)構(gòu)以外擁有大量冗余序列，這些蛋白也含有更多的不規(guī)則卷曲。此外，所有APX 蛋白均不含跨膜結(jié)構(gòu)域。

圖2 3 個(gè)蕓薹屬作物與擬南芥APX 基因的CDS 保守域、蛋白質(zhì)保守域和基因結(jié)構(gòu)Fig.2 CDS motif，protein motif and exon-intron structure of three Brassica crops and Arabidopsis thaliana APX gene

圖3 3 個(gè)蕓薹屬作物與擬南芥APX 基因的進(jìn)化樹和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 Evolution tree and protein tertiary structure prediction of APX genes from Arabidopsis thaliana and three Brassica crops

由圖3可知，幾乎所有的APX基因都含有Motif 6，而Motif 6 不屬于peroxidase 結(jié)構(gòu)域，卻普遍存在于APX 蛋白中，且高度保守，在三級(jí)結(jié)構(gòu)上呈穩(wěn)定的螺旋結(jié)構(gòu)。本研究以BrAPX1 為例，將該蛋白拆分出peroxidase 結(jié)構(gòu)域和Motif 6 保守結(jié)構(gòu)域，peroxidase 結(jié)構(gòu)域三級(jí)結(jié)構(gòu)保守，普遍含有10 個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)，無跨膜域；而在APX 蛋白的末端普遍含有一個(gè)四周半的螺旋結(jié)構(gòu)與Motif 6 所在區(qū)域?qū)?yīng)(圖4)，且該區(qū)域序列經(jīng)BLAST 比對(duì)僅能比對(duì)到自身的同源基因。綜上，Motif 6 所在區(qū)域序列很有可能是區(qū)分APX基因和其他含有peroxidase 結(jié)構(gòu)域的基因的特征序列，但相關(guān)結(jié)論仍需要大量試驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)。

2.4 共線性分析和Ka/Ks 進(jìn)化指數(shù)分析

共線性分析表明，同組APX基因間均兩兩共線，非同組APX基因間均不共線，表明已準(zhǔn)確找到了APX家族基因。將兩兩共線的基因作為一對(duì)輸入至ParaAT 計(jì)算Ka/Ks 值，同時(shí)獲得費(fèi)雪氏校驗(yàn)值(FisherP-value)，將得出的值輸入至Excel 作圖。由圖5可知，122 對(duì)基因中有112 對(duì)APX基因的Ka/Ks 值小于1，表明APX 家族基因正受到純化選擇，同時(shí)P-value值近乎為0，表明這些結(jié)果擁有極高的置信度。

2.5 APX 家族基因在逆境脅迫下的表達(dá)分析

為了分析APX基因?qū)Ψ巧锖蜕锩{迫的響應(yīng)，從NCBI 數(shù)據(jù)庫中選擇了4 個(gè)表達(dá)譜分析數(shù)據(jù)包，經(jīng)salmon 快速定量后，提取APX基因的定量結(jié)果，并使用TBtools 進(jìn)行繪圖。由圖6-A 可知，BrAPX2a在大白菜胚和胚乳中對(duì)高溫脅迫產(chǎn)生明顯的上調(diào)表達(dá)響應(yīng)，但在葉片、花絮、胚珠和花粉當(dāng)中均無表達(dá)，說明BrAPX2a強(qiáng)烈響應(yīng)高溫脅迫，且存在組織表達(dá)特異性。3 個(gè)BrAPX1 基因在32 d 大白菜葉片的表達(dá)量明顯高于14 d 的葉片，在花和胚珠中的表達(dá)與32 d 大白菜葉持平，在花粉中基本不表達(dá)。BrAPX3a在大白菜葉片中持續(xù)表達(dá)，但在花序、胚珠中表達(dá)量較低，在花粉中基本不表達(dá)；BrAPX4a和BrAPXTha在14 d 大白菜葉片中表達(dá)較高，在32 d 葉片中表達(dá)量下降，在花序、胚珠中表達(dá)量較低，在花粉中基本不表達(dá)；BrAPX6a在14 d 大白菜葉片中表達(dá)量較低，在32 d 葉片中表達(dá)量上升，在花序、胚珠中表達(dá)量較低，在花粉中基本不表達(dá)；BrAPXSta在14 d 大白菜葉片中表達(dá)量較低，在32 d 大白菜葉片、花序中表達(dá)量上升，在胚珠中表達(dá)量下降，在花粉中基本不表達(dá)。

圖4 大白菜BrAPX1 的三級(jí)結(jié)構(gòu)和與之對(duì)應(yīng)蛋白保守結(jié)構(gòu)域Fig.4 Protein tertiary structure and the corresponding protein motif of BrAPX1 from Brassica rapa

由圖6-B 可知，經(jīng)根腫病病原菌感染，甘藍(lán)BoAPX1a、BoAPX1b、BoAPX1c、BoAPX3a、BoAPX4a和BoAPX6a對(duì)根腫病生物脅迫無明顯響應(yīng)。在生長(zhǎng)28 d 敏感型的甘藍(lán)根部中，BoAPX2a和BoAPXSta輕微上調(diào)表達(dá)，在敏感型生長(zhǎng)7 d 甘藍(lán)和抵抗性的甘藍(lán)中均無明顯響應(yīng)。BoAPX5a和BoAPXTha在敏感型和抵抗型甘藍(lán)的根部對(duì)根腫病有輕微的上調(diào)表達(dá)響應(yīng)。由圖6-C 可知，BoAPX1a和BoAPX1b在敏感型甘藍(lán)的個(gè)體中，遭遇白粉虱危害以后出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)，在抵抗型的甘藍(lán)個(gè)體中，遭遇白粉虱危害后上調(diào)表達(dá)。BoAPX1c、BoAPX2a、BoAPX3a和BoAPX6a在敏感型和抵抗型甘藍(lán)遭遇白粉虱危害的過程中均無明顯響應(yīng)，BoAPX4a和BoAPX5a在敏感型甘藍(lán)中表達(dá)量較高，而在抵抗型甘藍(lán)中整體較低，但對(duì)白粉虱危害無明顯響應(yīng)。BoAPXSta和BoAPXTha在遭遇白粉虱危害后出現(xiàn)下調(diào)表達(dá)。

由圖6-D 可知，除BnAPX1b-r以外，歐洲油菜APX1 組的基因在高溫、ABA 和鹽脅迫下均出現(xiàn)明顯的上調(diào)表達(dá)。BnAPX2a-r1 僅對(duì)高溫脅迫表現(xiàn)出明顯的上調(diào)表達(dá)。BnAPX1b-r、BnAPX2a-r2 和BnAPX2a-o對(duì)低溫、高溫、15%PEG 滲透脅迫、ABA 和鹽脅迫均無明顯響應(yīng)。APX3 組、APX4 組、APX5 組和APX6 組對(duì)脅迫的響應(yīng)較為一致，在遭遇低溫、高溫脅迫時(shí)，均出現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，在15%PEG 和鹽脅迫時(shí)出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，在ABA 脅迫時(shí)出現(xiàn)輕微的下調(diào)表達(dá)。APXSt 組和APXTh 組的響應(yīng)表現(xiàn)較為一致，在低溫脅迫時(shí)出現(xiàn)輕微的上調(diào)表達(dá)，在高溫脅迫時(shí)出現(xiàn)明顯的上調(diào)表達(dá)，在15%PEG、ABA 脅迫和鹽脅迫時(shí)幾乎不響應(yīng)。

圖5 3 個(gè)蕓薹屬作物與擬南芥APX 基因的Ka/Ks 進(jìn)化指數(shù)分布圖和對(duì)應(yīng)的置信度(P-value)Fig.5 Ka/Ks evolutionary index distribution map with corresponding confidence of three species of Brassica crops and Arabidopsis thaliana APX genes (P-value)

3 討論

本研究通過生物信息學(xué)方法，在大白菜和甘藍(lán)的基因組中分別鑒定到10 和9 條APX基因，比擬南芥中的APX基因(8 條)分別多2 和1 條[36]。研究表明，大白菜和甘藍(lán)的基因組是從擬南芥的基因組三倍化而來，因此部分?jǐn)M南芥基因在大白菜或者甘藍(lán)中有3 個(gè)同源基因[37]，但在本試驗(yàn)中，甘藍(lán)除有3 個(gè)APX1 同源基因外，其他APX基因均只有一個(gè)同源基因，且未發(fā)現(xiàn)APX3 同源基因，且大白菜中也有類似現(xiàn)象，除3 個(gè)APX1 同源基因外，其他7 個(gè)APX基因均只有一個(gè)同源基因。推測(cè)在大白菜和甘藍(lán)的進(jìn)化和選擇過程中，可能只保留了有功能的3 個(gè)APX1 同源基因，其他作用不大的甘藍(lán)和大白菜APX基因在三倍化后經(jīng)過長(zhǎng)期的進(jìn)化和環(huán)境適應(yīng)丟失了。研究表明，大白菜(B.rapa，n ＝10)和甘藍(lán)(B.oleracea，n ＝9)雜交形成了歐洲油菜(B.napus，n ＝19)[1，25，38]，因此理論上，歐洲油菜中基因的拷貝數(shù)是甘藍(lán)與大白菜基因拷貝數(shù)之和。本研究中，歐洲油菜中鑒定到22 個(gè)APX基因，大于甘藍(lán)與大白菜APX基因之和(19)，多出的APX同源基因可能是歐洲油菜適應(yīng)環(huán)境的結(jié)果。從進(jìn)化上分析，大白菜和甘藍(lán)中的大部分APX基因都已經(jīng)傳遞到了歐洲油菜上，只有大白菜A08 染色體上的BrAPX1a和A09染色體上的BrAPXSta未出現(xiàn)在歐洲油菜染色體上的對(duì)應(yīng)位置，并保留在歐洲油菜中的保留區(qū)域(Ann 染色體)，且歐洲油菜的 C02 染色體上新產(chǎn)生了BnAPXTha-o2；A01 染色體上新出現(xiàn)了BnAPX5a-r和BnAPX2a-r1，結(jié)合circos 和進(jìn)化樹分析表明，這2 個(gè)基因極有可能是通過染色體異源聯(lián)會(huì)并發(fā)生交叉互換保留在A01 染色體上的。

本研究結(jié)果表明，同源APX基因聚在同一枝，且具有相同的保守域，如來源于不同作物的APX1 聚在第Ⅰ亞族(圖2、3)，說明APX 在進(jìn)化中保守程度較高，這與白樺[39]和陸地棉[40]中APX基因的相關(guān)研究結(jié)果相似。結(jié)構(gòu)域分析表明，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ亞族在CDS 保守域和蛋白保守域、結(jié)構(gòu)等部分均擁有極為相似的構(gòu)成，表明這些序列可能擁有共同的祖先；同理，Ⅶ和Ⅷ亞族也可能擁有共同的祖先；Ⅳ亞族和Ⅵ亞族相對(duì)于其他亞族在CDS 保守域、蛋白保守域和基因結(jié)構(gòu)上均擁有較大的差異，表明這兩個(gè)亞族擁有相對(duì)獨(dú)立的進(jìn)化史。

圖6 不同脅迫處理下3 個(gè)蕓薹屬作物與擬南芥中APX 基因的熱圖Fig.6 Heatmap of APX gene in three Brassica crops and Arabidopsis thaliana under different stress treatments

大量研究表明，APX 基因家族中的APX1 和APX2在活性氧、高溫、干旱等脅迫后表達(dá)上調(diào)[41-45]，其中擬南芥AtAPX1 在活性氧和高溫脅迫中均有響應(yīng)[42-44]，AtAPX2 在適宜溫度下幾乎不表達(dá)，只有受到高溫脅迫才大量表達(dá)[46]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，歐洲油菜中APX1和APX2 的同源基因?qū)Ω邷孛{迫都有響應(yīng)，其中APX2響應(yīng)更為強(qiáng)烈，而其他APX基因?qū)Ω邷?、干旱和生物脅迫的響應(yīng)較小，推測(cè)可能在其他逆境脅迫中起作用。此外，本研究發(fā)現(xiàn)有些APX基因的表達(dá)具有一定的組織特異性，尤其是BaAPX2 在大白菜的胚和胚乳中對(duì)高溫脅迫產(chǎn)生明顯的上調(diào)表達(dá)響應(yīng)，但在葉片、花絮、胚珠和花粉當(dāng)中均無表達(dá)，說明BrAPX2a強(qiáng)烈響應(yīng)高溫脅迫，且存在組織表達(dá)特異性，推測(cè)可能是某些組織部位更容易受到外界環(huán)境脅迫，導(dǎo)致APX基因表達(dá)在各組織部位分布不均，這一現(xiàn)象在前人研究中鮮見報(bào)道。這些表達(dá)分析都是基于已有的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，但其詳細(xì)表達(dá)模式需要更多試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究在大白菜、甘藍(lán)和歐洲油菜中分別鑒定到了10、9 和22 個(gè)APX基因。APX 家族基因在進(jìn)化樹上可分為8 個(gè)亞族； APX 家族基因的peroxidase 結(jié)構(gòu)域保守，擁有相對(duì)穩(wěn)定的CDS 保守結(jié)構(gòu)域、蛋白保守結(jié)構(gòu)域和三級(jí)結(jié)構(gòu)；在peroxidase 結(jié)構(gòu)域的后端，所有APX 蛋白均含有一個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)，且該結(jié)構(gòu)被MEME 識(shí)別為一個(gè)獨(dú)立的Motif 6。APX家族基因整體正在經(jīng)歷純化選擇。不同物種間響應(yīng)脅迫的APX基因有可能不同；大部分APX1 和APX2 基因在受到脅迫時(shí)上調(diào)表達(dá)，但在植株遭遇過量脅迫時(shí)，可能出現(xiàn)下調(diào)表達(dá)。此外，部分APX基因的表達(dá)還具有組織特異性。大白菜、甘藍(lán)和歐洲油菜APX 家族生物信息學(xué)分析為研究蕓薹屬作物的逆境適應(yīng)及生長(zhǎng)發(fā)育分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

附表13 種蕓薹屬作物和擬南芥APX 家族基因的蛋白結(jié)構(gòu)域的基本信息Attached Table1 The basic information of the three kinds of Brassica crops and Arabidopsis APX protein structure domain

附表1(續(xù))

附表2 3種蕓薹屬作物和擬南芥APX 家族基因的進(jìn)化指數(shù)和對(duì)應(yīng)置信度Attached Table2 The evolutionary index and P-value of the three kinds of Brassica crops and Arabidopsis APX gene family

附表2(續(xù))

附表2(續(xù))

附表2(續(xù))