林榕燕 吳建設 林 兵 葉秀仙 鐘淮欽 黃敏玲

(福建省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所/福建省農(nóng)業(yè)科學院花卉研究中心/福建省特色花卉工程技術研究中心，福建 福州 350013)

雜交蘭 (Cymbidiumhybrid) 屬于蘭科(Orchidaceae)蘭屬(Cymbidium Sw.)，其花色艷麗、株系整齊、花香淡雅，具有較高的觀賞價值，是蘭花市場中極具發(fā)展?jié)摿Φ奶m花種類[1-2]。在蘭花長期栽培馴化過程中產(chǎn)生芽變，其葉片在不同位置變異成不同色斑，如條紋葉、透明葉、黃葉或斑點葉等，稱之為線藝或葉藝；葉藝品種觀葉勝觀花，觀賞和經(jīng)濟價值成倍增長，蘭花葉藝新品種的選育越來越受到人們的重視[3-5]。當前，葉藝蘭品種的選育主要通過組培過程中的芽變、體細胞無性繁殖的自然突變和人工誘變等途徑獲得，但這些方法具有不確定性，且工作量大、耗時長，導致葉藝蘭的育種效率低[6]。因此，通過揭示雜交蘭葉色變異(葉藝形成)的機理，并結合現(xiàn)代分子育種等手段進行定向選育，將對其產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的理論和實踐意義。

對一些模式植物(如水稻和擬南芥)葉色突變體的研究表明，葉色變異主要是源于調控葉綠素生物合成與分解代謝、血紅素代謝以及葉綠體發(fā)育與形成等相關基因的突變，參與這些代謝過程的基因有很多，其中任意一個基因發(fā)生突變都可能導致植物的葉色發(fā)生變 異[7-11]。尿卟啉原脫羧酶(uroporphyrinogen decarboxylase，UROD) 在植物中催化尿卟啉原Ⅲ(Urogen Ⅲ)脫羧產(chǎn)生糞卟啉原Ⅲ(Coprogen Ⅲ)，是葉綠素、光敏色素和血紅素分支合成中的關鍵酶[12]，其活性改變可能會使尿卟啉大量富集，甚至導致細胞死亡[13]。研究發(fā)現(xiàn)煙草中只有1 種UROD，由核基因編碼，含有葉綠體導肽，反義抑制UROD 會導致葉綠素合成減少[14]；而玉米、擬南芥和水稻中存在2 個UROD 編碼基因，且二者的表達受到光、晝夜節(jié)律以及植物氮代謝調節(jié)，其在合成葉綠素方面起重要作用[15-16]。有關UROD基因在蘭科植物中的研究報道較少，石閃閃[13]通過DNA 直接測序法在墨蘭達摩中得到UROD基因，并推測該基因在墨蘭中主要參與葉綠素的合成。雜交蘭UROD基因的研究更是鮮見報道。

鑒于UROD基因在植物葉綠素合成中的重要性，揭示該基因在雜交蘭葉色調控中的分子機制，將對雜交蘭葉藝品系的選育具有重要意義。本研究以自主選育的雜交蘭葉藝品系爪藝紫妍氏K21-1 及其親本紫妍氏K21 的葉片為材料，在轉錄組分析發(fā)現(xiàn)UROD基因在供試材料中存在差異表達的前期研究基礎上，克隆UROD基因，初步分析該基因及編碼蛋白質的序列特征，檢測不同材料不同組織中基因的表達情況，并對葉綠素含量、葉綠素前體物質含量及關鍵酶濃度等生理指標進行測定，旨在為后續(xù)雜交蘭UROD基因的功能驗證及雜交蘭的葉藝形成機制研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以雜交蘭紫妍氏(K21，葉片綠色)和爪藝紫妍氏(K21-1，葉片綠色淺黃邊)的葉片為材料進行UROD基因的克隆，以及葉綠素含量、Urogen Ⅲ含量、Coprogen Ⅲ含量和關鍵酶濃度的測定；以K21 的根、莖、葉為材料，進行UROD基因的表達分析。

1.2 試驗方法

1.2.1 雜交蘭總RNA 提取及cDNA 第一鏈合成 取K21 的根、莖、葉及K21-1 的綠葉區(qū)和黃葉區(qū)葉片各0.1 g，研磨后，參照林榕燕等[17]的方法，使用通用植物總RNA 提取試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司)，按說明書提取總RNA；檢測合格后的RNA 用于cDNA 第一鏈的合成，具體步驟參照PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]說明書。

1.2.2 雜交蘭UROD基因序列克隆 在轉錄組測序的基礎上，根據(jù)預測UROD序列，設計一對引物UROD-F:5′-ATGGGGAGCATTTCTTACAACG-3′和UROD-R:5′-TCAAGAAGATAAATTGCGGTACCTG-3′用于PCR 擴增。擴增體系為50 μL，包含2×PCR buffer for KOD FX Neo 25 μL，1 U·μL-1KOD FX Neo 1 μL，2 mmol·L-1dNTP 10 μL，上、下游引物各1.5 μL，模板cDNA 1 μL，ddH2O 10 μL。PCR 擴增程序:94℃預變性2 min；98℃變性10 s，50℃退火30 s，68℃延伸90 s，30 個循環(huán)；68℃終延伸7 min。將回收的目的片段連接載體，經(jīng)轉化、菌液PCR 檢測后，挑選陽性克隆送至鉑尚生物技術(上海)有限公司進行測序。

1.2.3 生物信息學分析 參照林榕燕等[18]的報道，利用在線生物信息學分析軟件 ExPASy、WoLF PSORT、SOPMA，對UROD 蛋白質的理化性質、亞細胞定位、二級結構等進行分析；并通過DNAMAN 軟件和MEGA5.0 軟件進行序列多重比對分析及系統(tǒng)進化樹構建。

1.2.4UROD基因的表達分析 以K21 的根、莖、葉及K21-1 的綠葉區(qū)和黃葉區(qū)葉片cDNA 為模板，Actin(引物序列分別為Actin-F:5′-GGGTGCTTATGTTGGTG ATG-3′和Actin-R:5′-TTCAGAGGGGCTTCAGTAAGG-3′)為內(nèi)參基因，利用引物ChUROD-RT-F:5′-TGGAGC TCAAGCTGTTCAGA-3′和ChUROD-RT-R:5′-TGCGTC TTCTTTACGGAGGT-3′，按照SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]操作說明，在7500 Real-Time PCR System 儀(美國ABI 公司)上進行PCR 擴增，檢測ChUROD基因在各個模板中的表達水平。每個試驗設置3 個生物學重復，相對定量分析采用比較Ct 法，目的基因的相對表達量為2-△△Ct。

1.2.5 雜交蘭葉綠素含量、Urogen Ⅲ含量、CoprogenⅢ含量及關鍵酶濃度測定 參照謝泰祥等[19]的方法，并做適當修改，對K21 葉片和K21-1 葉片中黃葉區(qū)和綠葉區(qū)葉片的葉綠素a 和葉綠素b 含量進行測定。參照毛晶晶等[20]的方法，略作修改，對供試材料的Urogen Ⅲ含量和Coprogen Ⅲ含量進行測定。UROD濃度的測定采用雙抗體夾心法，操作步驟參照植物UROD 酶聯(lián)免疫分析試劑盒(上海晶抗生物工程有限公司)說明書。

2 結果與分析

2.1 雜交蘭UROD 基因的克隆

以雜交蘭K21 葉片及K21-1 黃葉區(qū)和綠葉區(qū)葉片的cDNA 為模板進行PCR 擴增，得到3 條約1 200 bp 的條帶(圖1)，將測序結果進行比對后，獲得一段完全一致的UROD基因序列，該基因開放閱讀框(open reading frame，ORF)序列長1 191 bp，命名為ChUROD，GenBank 登錄號為MN640068。

圖1 雜交蘭UROD 基因的克隆Fig.1 Cloning of UROD gene in Cymbidium hybrid

2.2 ChUROD 基因序列的生物信息學分析

經(jīng)軟件分析，ChUROD編碼氨基酸的個數(shù)為396 個，其編碼蛋白質的理論分子量為43. 78 kD，等電點為6. 42，蛋白質不穩(wěn)定系數(shù)為43. 38，平均親疏水性(grand average of hydropathy，GRAVY)為負值，說明ChUROD 為不穩(wěn)定親水性蛋白質。該蛋白質含有一個典型的尿卟啉原脫羧酶結構域(53 ～394 aa)，屬于URO-D＿CIMS＿like家族。此外，ChUROD 蛋白質不具有跨膜結構，定位于葉綠體的可能性最大。其二級結構中，α-螺旋、無規(guī)則卷曲、延伸鏈和β-轉角所占比例依次為45. 71%、32. 32%、15. 66%和6. 31%。

2.3 ChUROD 蛋白序列比對與進化分析

根據(jù)NCBI 在線BLAST 比對結果顯示，ChUROD蛋白序列與其他植物的相似性均較高，與墨蘭(Cymbidium sinense，AUY61989.1)的相似性最高，為98.61%，其他依次為:與桃紅蝴蝶蘭(Phalaenopsis equestris，XP＿020595834.1)的相似性為88.61%，與葡萄(Vitis vinifera，XP＿002274385.2) 的相似性為85.75%、與蘋果(Malus domestica，QDF44777.1)的相似性為85.55%、與白梨(Pyrus x bretschneideri，XP＿009369263.1)的相似性為85.08%，與海棗(Phoenix dactylifera，XP＿008782632.1)的相似性為84.37%，與菠蘿(Ananas comosus，OAY79965.1) 的相似性為83.87%。將ChUROD 蛋白序列與其他9 種植物UROD 進行序列比對分析，發(fā)現(xiàn)這些植物的UROD 之間具有較高的一致性，達86.37%(圖2)。

對ChUROD 系統(tǒng)進化分析表明(圖3)，所選蛋白可分為兩大組，一組為單子葉植物蛋白，一組為雙子葉植物蛋白。其中，雜交蘭ChUROD 蛋白位于單子葉植物蛋白組，與墨蘭親緣關系最近；與同屬蘭科的桃紅蝴蝶蘭和鐵皮石斛(Dendrobium catenatum)的進化距離也較近；與雙子葉植物蛋白組的棗(Ziziphus jujuba)、栓皮櫟(Quercus suber)親緣關系較遠。

2.4 雜交蘭ChUROD 基因相對定量表達分析

為了研究ChUROD基因在雜交蘭不同組織中的差異，以K21 根、莖、葉的cDNA 為模板，以雜交蘭Action基因為內(nèi)參，通過實時熒光定量 PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)分析ChUROD基因的表達情況(圖4)。結果表明，ChUROD基因在不同組織中均有表達，葉中的基因相對表達量顯著高于根和莖，葉中的相對表達量是根中的21 倍，是莖中的13 倍。

此外，比較了ChUROD基因在K21 葉片及K21-1黃葉區(qū)和綠葉區(qū)葉片中的表達量。由圖5可知，ChUROD基因的相對表達量在K21 綠色葉片中最高，顯著高于K21-1 葉片中該基因的相對表達量；且在K21-1 葉片中，黃葉區(qū)中ChUROD基因的相對表達量高于綠葉區(qū)，但無顯著性差異。

2.5 雜交蘭UROD酶濃度、Urogen Ⅲ含量、CoprogenⅢ含量及葉綠素含量比較

由圖6可知，UROD 酶濃度在K21 綠色葉片和K21-1 黃葉區(qū)葉片中顯著高于K21-1 綠葉區(qū)葉片，總體表現(xiàn)為K21 綠色葉片>K21-1 黃葉區(qū)色葉片>K21-1 綠葉區(qū)色葉片。

由圖7可知，UrogenⅢ相對含量在K21 綠色葉片、K21-1 黃葉區(qū)和綠葉區(qū)葉片中呈顯著性差異，表現(xiàn)為K21-1 黃葉區(qū)葉片>K21-1 綠葉區(qū)葉片>K21 綠色葉片。而CoprogenⅢ含量在K21 綠色葉片中顯著高于K21-1 綠葉區(qū)和K21-1 黃葉區(qū)葉片，表現(xiàn)為K21 綠葉片>K21-1 綠葉區(qū)葉片>K21-1 黃葉區(qū)葉片。

由圖8可知，在供試材料中，葉綠素a 和葉綠素b 含量均呈現(xiàn)顯著性差異，且具有相同的分布趨勢，均表現(xiàn)為K21 綠色葉片> K21-1 綠葉區(qū)葉片> K21-1 黃葉區(qū)葉片。進一步比較了不同葉片中葉綠素a(chla)/葉綠素b(chlb)值，發(fā)現(xiàn)K21-1 黃葉區(qū)葉片中chla/b 值顯著低于K21 綠色葉片和K21-1 綠葉區(qū)葉片。

3 討論

UROD基因作為卟啉類化合物分支合成酶的第一個基因，在代謝調節(jié)中起重要作用，對于動植物的生長發(fā)育都是必需的[21-23]。目前，在包括人類、大麥、煙草、擬南芥等許多動植物中均已克隆到了UROD基因，煙草UROD基因編碼一個約43 kD 的含葉綠體導肽的蛋白前體，UROD 需轉運到葉綠體中發(fā)揮作用，它的表達受光誘導，UROD基因突變會導致植物葉片受損[14]；小麥和黃瓜的UROD基因表達受光和熱的影響，在熱應激條件下，該基因在植物的綠化過程中起到重要的作用[24]。本研究在雜交蘭紫妍氏K21 及其葉藝品系爪藝紫妍氏K21-1 葉片中克隆獲得了UROD基因，該基因序列與其他植物UROD基因序列相似較高；系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)，雜交蘭與同屬蘭科的墨蘭親緣關系最近，但與雙子葉植物白梨、蘋果等的UROD親緣關系較遠，說明UROD 分布具有種屬特異性。保守結構域分析發(fā)現(xiàn)，雜交蘭ChUROD 蛋白質屬于URO-D- CIMS - like 家族。qRT-PCR 結果表明，ChUROD基因在葉片中的相對表達量最高是根和莖的21 倍和13 倍，與在墨蘭[13]中的表達情況一致；本試驗還檢測了ChUROD基因在不同品種葉片中的表達情況，發(fā)現(xiàn)ChUROD基因在K21 中的表達量顯著高于K21-1；推測該基因在雜交蘭中主要參與葉綠素的合成。

圖4 雜交蘭不同組織中ChUROD 基因的相對表達量Fig.4 Relative expression levels of ChUROD in different tissues of Cymbidium hybrid

圖5 雜交蘭不同葉片中ChUROD 基因的相對表達量Fig.5 Relative expression levels of ChUROD in different leaves of Cymbidium hybrid

圖6 雜交蘭不同葉片中UROD 酶濃度Fig.6 Concentration of UROD enzyme in different leaves of in Cymbidium hybrid

圖7 雜交蘭不同葉片中UrogenⅢ(A)和CoprogenⅢ(B)含量Fig.7 Contents of UrogenⅢ(A) and CoprogenⅢ(B) in different leaves of Cymbidium hybrid

圖8 雜交蘭不同葉片中葉綠素a(A)和葉綠素b(B)含量Fig.8 Contents of chlorophyll a (A) and chlorophyll b (B) in different leaves of Cymbidium hybrid

在玉米黃化突變體[25]、黃瓜黃綠葉突變體C777[26]及墨蘭達摩葉藝品系[27]葉片中光合色素含量均低于其相應的野生型，但類胡蘿卜素/總葉綠素顯著高于野生型，由此推測這類突變體為總葉綠素缺乏型突變[25]；相較于野生型，孕穗期的水稻白條紋葉突變體wsl1 葉片中葉綠素b 含量極顯著下降，葉綠素a 和類胡蘿卜素含量則無明顯差異[28]，說明不同物種葉色突變體中，光合色素含量、比例等變化趨勢不同?；ㄈ~矢竹葉色變異機理研究報道中，推測白葉和條紋白葉中原卟啉Ⅸ(ProtoⅨ)至葉綠素a 過程發(fā)生障礙[6]；甜瓜葉色黃化突變體在膽色素原(porphobilinogen，PBG)與UrogenⅢ的反應步驟受阻[29]；文心蘭黃綠條紋突變體Y4 在ProtoⅨ到鎂原卟啉Ⅸ(Mg-ProtoⅨ)的位點受阻；完全黃化突變體(Y7 ～Y10)和黃綠條紋突變體(Y2、Y3、Y5 和Y6)在CoprogenⅢ到ProtoⅨ的位點受阻[30]；說明不同植物葉色突變體葉綠素合成代謝受限步驟存在差異。因此，本研究進一步對UROD 酶濃度、UrogenⅢ含量、CoprogenⅢ含量、葉綠素a 和葉綠素b 含量進行測定，結果發(fā)現(xiàn)UROD 酶濃度在品種間的分布趨勢與ChUROD基因的表達量相似，在K21 綠色葉片中表現(xiàn)為高水平，在K21-1 葉片中的含量相對較低；在K21 葉片中，UROD 酶催化UrogenⅢ脫羧產(chǎn)生CoprogenⅢ，但在K21-1 葉片中，UrogenⅢ脫羧產(chǎn)生CoprogenⅢ的過程受阻，特別是導致黃葉區(qū)中UrogenⅢ大量積累。在K21-1 黃葉區(qū)葉片葉綠素a 和葉綠素b 的含量明顯低于K21 綠色葉片和K21-1 綠葉區(qū)葉片，說明在黃葉區(qū)葉片中葉綠素的合成同樣受阻；同時，在K21-1 黃葉區(qū)葉片中Chla/b 顯著低于綠葉區(qū)葉片，與文心蘭黃綠條紋突變體Y4[30]的研究結果一致，推測葉藝品種K21-1 屬于葉綠素a 缺乏型突變。該葉藝品種葉藝形成的原因主要是葉綠素合成受阻，受阻位點可能在由UrogenⅢ脫羧產(chǎn)生Coprogen Ⅲ及之后的步驟，說明ChUROD基因可能和其他基因協(xié)調作用，在雜交蘭葉藝形成中起重要作用。

目前有關葉色變異的研究多集中于模式植物擬南芥和水稻，而蘭科植物葉藝形成機制的研究還較滯后。本研究獲得了雜交蘭ChUROD基因序列，對其編碼蛋白的結構特征、基因表達模式、相關生理指標進行分析，為今后ChUROD的功能驗證提供了基因資源，也為進一步研究雜交蘭葉藝形成機制提供了重要線索。

4 結論

本研究在雜交蘭紫妍氏K21 及其葉藝品系爪藝紫研氏K21-1 葉片中克隆獲得了ChUROD基因，ChUROD基因ORF 序列長1 191 bp，編碼396 個氨基酸。ChUROD基因在葉中表達量最高，且在K21 葉片中的表達量高于K21-1。此外，K21-1 黃葉區(qū)葉片的UROD 酶濃度、CoprogenⅢ含量及葉綠素含量均低于K21 葉片，但UrogenⅢ含量卻顯著高于K21 葉片，推測葉藝品系K21-1 的葉綠素合成在由UrogenⅢ脫羧產(chǎn)生CoprogenⅢ及之后的步驟中受阻，ChUROD基因可能與其他基因協(xié)調作用，在葉藝形成過程中發(fā)揮重要作用。本研究為進一步探討ChUROD基因在雜交蘭中的作用機制奠定了基礎。