王舒琪，忻曉東，頓佳穎，李春花，3*

(1.河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室，河北 石家莊 050090； 2.涿州市醫(yī)院，河北 保定 072750;3.河北省高校中藥組方制劑應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，河北 石家莊 050090)

溶解度是影響藥物有效成分溶出的關(guān)鍵因素，中藥材中存在很多藥理活性強但因溶解度小而限制了其臨床應(yīng)用，影響臨床效果的成分[1]。有研究表明中藥復(fù)方配伍以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，可利用特定藥材如甘草自身成分具有增溶的性質(zhì)增加難溶性成分溶解度。李鳴[2]曾以四君子湯為例，比較藥材單煎液、藥材與甘草合煎液中水溶出物的量，表明甘草具有增溶作用。甘草作為中醫(yī)常用藥物之一，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有補脾益氣、緩急止痛、清熱解毒、祛痰止咳、調(diào)和諸藥等功效，主要有效成分為甘草酸，屬于三萜皂苷，具有表面活性劑的性質(zhì)[3]能夠增強合煎液中其它藥材難容性成分的溶解度。研究表明，甘草的增溶原理基于甘草酸可形成膠束[4]。

桃核承氣湯原方出自《傷寒論》，作為活血祛瘀的代表方及經(jīng)典名方之一，主治下焦蓄血癥，可逐瘀瀉熱，其臨床應(yīng)用廣泛，具有確實的療效，可用于治療急性腦卒中、多發(fā)性腦梗塞、腦出血術(shù)后并發(fā)癥、糖尿病并發(fā)腦梗死、肝性腦病等由瘀熱互結(jié)所致疾病[5]。該方組方精簡，由桃仁、大黃、桂枝、甘草、芒硝組成?，F(xiàn)代研究及臨床應(yīng)用研究表明[6-9]，桃核承氣湯中發(fā)揮其藥理作用的成分主要為苦杏仁苷、桂皮醛、甘草酸、大黃酸、大黃素及大黃酚等蒽醌類成分。本實驗為驗證甘草增溶原理，以桃核承氣湯為例，分別計算桃仁(S1)、大黃(S2)、桂枝(S3)、甘草(S4)單煎液；桃仁+甘草(S5)、大黃+甘草(S6)、桂枝+甘草(S7)合煎液；桃仁+大黃+桂枝(S8)合煎液；桃仁+大黃+桂枝+甘草(S9)合煎液的油水分配系數(shù)，并采用高效液相色譜法對藥材的單煎液與合煎液進行有效成分含量測定。

1 儀器與試藥

LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司)；TG328B型電子分析天平(上海精科儀器廠)；KQ-100E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；FD-1-50冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)。

苦杏仁苷(批號：Z1709131，成都草源康生物科技有限公司，純度：98.00%)；大黃酸(批號：MUST-11032801，成都曼斯特生物科技有限公司，純度：98.00%)；大黃素(批號：MUST-12022715，成都曼斯特生物科技有限公司，純度：98.00%)；大黃酚(批號：20120320，上海源葉生物科技有限公司，純度：98.00%)；蘆薈大黃素(批號：20120412，上海源葉生物科技有限公司，純度：98.00%)；大黃素甲醚(批號：PF0223SA13，上海源葉生物科技有限公司，純度：98.00%)；桂皮醛(批號：H02M6Q1，上海源葉生物科技有限公司，純度≧98.00%)；甘草酸(批號：MUST-17032205，成都曼斯特生物科技有限公司，純度：99.55%)； SAS 67120型超純水系統(tǒng)(法國Millipore公司)；正辛醇(分析純，天津市津東天正精細化學(xué)試劑廠)；乙腈(色譜純，天津市康科德科技有限公司)；甲醇(色譜純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；磷酸(分析純，天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司)。

藥材均購于河北省石家莊市樂仁堂藥店，經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院侯芳潔老師鑒定桃仁為薔薇科植物桃Prunuspersica(L.) Batsch 的干燥成熟種子，大黃為廖科植物掌葉大黃RheumpalmatumL.的干燥根及根莖，桂枝為樟科植物肉桂CinnamomumcassiaPresl的干燥嫩枝，甘草為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根及根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 油水分配系數(shù)的測定

2.1.1 單味藥材的提取與浸出物的測定

按處方比例分別稱取桃仁1.5 g(S1)、大黃6 g(S2)、桂枝3 g(S3)、甘草3 g(S4)，置于250 mL圓底燒瓶中，加10倍量的水，回流提取3次，時間為65 min、32.5 min、32.5 min，過濾[10]，收集濾液。合并3次收集的濾液，將濾液濃縮至30 mL。取濃縮液10 mL，置于80 ℃水浴鍋蒸發(fā)至稠浸膏狀態(tài)，放入冰箱中，于-25 ℃預(yù)凍10 h，冷凍干燥成干浸膏，稱重。另取10 mL濃縮液，加10 mL正辛醇萃取，分離油相與水相，同法制成干浸膏，稱重。

2.1.2 單味藥材加甘草提取與浸出物的測定

按處方比例分別稱取桃仁1.5 g+甘草3 g(S5)、大黃6 g+甘草3 g(S6)、桂枝3 g+甘草3 g(S7)進行提取與浸出物的測定，提取與測定方法同上述“2.1.1”項單味藥材的提取與測定。

2.1.3 復(fù)方提取與浸出物的測定

按處方比例稱取全方藥材一付(不含芒硝與甘草)即：桃仁1.5 g,大黃6 g,桂枝3 g(S8) ，另取一付藥材(不含甘草)即：桃仁1.5 g,大黃6 g,桂枝3 g,甘草3 g(S9)，分別對以上兩個復(fù)方進行提取與浸出物的測定，提取與測定方法同上述“2.1.1”項單味藥材的提取與測定。

2.1.4 油水分配系數(shù)的計算

依據(jù)油水分配系數(shù)的公式即logP=log(W油/W水)，其中W油為油相浸膏質(zhì)量，W水為水相浸膏質(zhì)量，對實驗所得數(shù)據(jù)進行計算，結(jié)果見表1。結(jié)果表明不含甘草藥材的油水分配系數(shù)均大于含甘草藥材的油水分配系數(shù)，說明了桃核承氣湯中甘草能夠增加其它藥物成分在水中溶解度。

表1 油水分配系數(shù)結(jié)果

2.2 指標成分含量測定

2.2.1 液相條件

色譜柱為 Diamonsil C18(5 μm,250 mm×4.6 mm)，流動相為乙腈和0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～5 min，15%乙腈；5～10 min，15%～20%乙腈；10～30 min，20%乙腈；30～55 min，20%～50%乙腈；55～70 min，50%乙腈；70～85 min，50%～80%乙腈；85～90 min，80%～100%乙腈；90～95 min，100%乙腈；體積流量1.0 mL/min ；進樣量10 μL；柱溫30 ℃；苦杏仁苷檢測波長為210 nm，大黃素、大黃素甲醚、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、甘草酸檢測波長為250 nm，桂皮醛檢測波長為290 nm。

2.2.2 供試品溶液制備

精密吸取“2.1.1”項下剩余濃縮液1 mL置于5 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容，搖勻靜置，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得單味藥材供試品溶液。同理，取“2.2.2”項和“2.2.3”項的濃縮液，按上述操作，即得單味藥材加甘草、復(fù)方的供試品溶液。

2.2.3 對照品溶液制備

分別稱取苦杏仁苷、桂皮醛、甘草酸、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素適量，各置于5 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為0.278、0.554、1.234、0.236、0.264、0.258、0.244、0.242 mg/mL的對照品儲備液。依次取上述對照品儲備液2、1、2、1、1、1、1、1 mL，置于同一10 mL容量瓶中，即得混合對照品溶液。

2.2.4 專屬性試驗

精密吸取“2.2.2”項供試品溶液及“2.2.3”項混合對照品溶液各 10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件測定，結(jié)果顯示，各成分分離度良好，理論塔板數(shù)以苦杏仁苷峰計不低于3 000，說明該方法專屬性強。色譜圖見圖1。

注：A.桃仁;B.桃仁+甘草;C.大黃;D.大黃+甘草;E.桂枝;F.桂枝+甘草;G.甘草;H.混標;1.苦杏仁苷;2.蘆薈大黃素;3.大黃酸;4.大黃素;5.大黃酚;6.大黃素甲醚;7.甘草酸;8.桂皮醛

2.2.5 線性關(guān)系的考察

精密量取混合對照品溶液1、5、10、15、20 μL，按“2.2.1”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積。以進樣量(x，μg)為橫坐標，峰面積(y)為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程與線性范圍見表2。

表2 回歸方程與線性范圍(n=5)

2.2.6 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液，分別在確定的色譜條件下重復(fù)進樣6次，記錄峰面積?？嘈尤受?、桂皮醛、甘草酸、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素峰面積的RSD分別為0.390 9%、0.258 5%、0.119 2%、0.416 2%、0.307 2%、0.337 0%、0.455 0%、0.236 9%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，分別于室溫放置0、2、4、6、8、12 h，按所確定的色譜條件進樣，記錄峰面積。結(jié)果苦杏仁苷、桂皮醛、甘草酸、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素峰面積的RSD分別為0.276 6%、0.246 0%、0.225 0%、0.203 0%、0.858 4%、0.262 4%、0.857 3%、0.591 2%，表明供試品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗

取同一供試品溶液，按所確定的方法平行制備6份，在“2.2.1”項色譜條件下進樣，記錄峰面積并計算含量。結(jié)果苦杏仁苷、桂皮醛、甘草酸、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素含量的RSD分別為0.326 7%、0.562 1%、0.232 8%、0.323 8%、0.471 8%、0.172 3%、0.399 3%、0.271 3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗

精密量取已知含量供試品溶液6份，每份0.1 mL，按照100%分別加入 8 種化合物對照品，制備供試品溶液，再按上述色譜條件進行測定，記錄峰面積，并計算各成分的加樣回收率，結(jié)果苦杏仁苷、桂皮醛、甘草酸、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素的平均加樣回收率范圍在99.21%～100.60%，RSD均小于3%，表明該方法準確可靠。

2.2.10 樣品含量測定

按上述“2.1.1”項下條件進行提取，“2.2.2”項制備供試品溶液，“2.2.1”項色譜條件進行測定，記錄峰面積并計算含量，結(jié)果見表3。由表3可知，單味藥材加甘草后的和煎液中除甘草酸外指標成分含量均高于單味藥材煎液中指標成分的含量，甘草酸的含量降低，進而說明甘草酸可以通過形成膠束來增大其他成分在水中的溶解度[4]。

表3 樣品含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 甘草增溶原理

查閱參考文獻可知[11-13]，甘草中的甘草酸可通過形成膠束來發(fā)揮增溶作用，甘草酸具有表面活性劑的性質(zhì)，存在親水親油兩親性結(jié)構(gòu)，當(dāng)其濃度達到臨界膠束濃度時，親水基團向外與水相相連，疏水基團則相互吸引、締合在一起，向內(nèi)形成球狀體即為膠束，能顯著提高其他成分在水中的溶解度。

3.2 油水分配系數(shù)測定

油水分配系數(shù)(logP)是指物質(zhì)在正辛醇和水中分配系數(shù)比值的對數(shù)值，反映了物質(zhì)在油水兩相中的分配情況，logP值越小，說明該物質(zhì)越親水，水溶性越好，反之logP值越大越親油。本實驗以桃核承氣湯為例，測定了除芒硝外單味藥材、單味藥材加甘草、桃仁+大黃+桂枝及桃仁+大黃+桂枝+甘草的油水分配系數(shù)，結(jié)果顯示，無論是單味藥材還是除甘草外的藥材合煎液加甘草后油水分配系數(shù)均降低，說明加甘草后的藥液水溶性成分增多，進而驗證了甘草可以增加其他成分在水中的溶解度。

3.3 指標成分的確定及其溶解度

基于桃核承氣湯方中組成藥物的藥理作用與此方的主要臨床應(yīng)用，可得出本方中主要指標成分有苦杏仁苷、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素、桂皮醛及甘草酸。其中大黃的指標成分為游離蒽醌，桂枝的指標成分為揮發(fā)油，此類成分極性較小，幾乎不溶于水，故為驗證甘草增溶的原理，本實驗選取以上成分為指標成分，采用HPLC測定藥材單煎液、藥材與甘草合煎液、桃仁+大黃+桂枝及桃仁+大黃+桂枝+甘草中成分含量，并進行方法學(xué)研究，結(jié)果顯示，加甘草后的合煎液中指標成分含量除甘草酸外均增加，從而驗證了甘草酸能夠增大其他成分在水中的溶解度。

4 結(jié)論

在臨床應(yīng)用的常用經(jīng)方中，大部分方劑組成中含有甘草這味藥。甘草在方劑的組成中多起著調(diào)和諸藥、增強療效的作用，其功兼佐使之用。而本文通過對桃核承氣湯中基于油水分配系數(shù)與指標成分含量的甘草增溶作用研究，實驗結(jié)果得出甘草具有增溶的作用，且主要通過甘草酸形成膠束來實現(xiàn)[14]。從而在理論上對甘草調(diào)和諸藥、增強療效的作用做出了相對科學(xué)的解釋。因此，對于甘草增溶作用的研究對以桃核承氣湯為代表的經(jīng)典名方的臨床應(yīng)用更具現(xiàn)實與理論意義，可助其充分發(fā)揮其作為經(jīng)典名方的臨床治療優(yōu)勢。為完善甘草增溶作用相關(guān)研究，后期研究將進一步探索甘草酸膠束的具體參數(shù)。