鄭毅 賀琪 李玉波

[摘要] 目的 研究肥胖基因在中國中部地區(qū)兒童中的突變情況，探究兒童肥胖與肥胖基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）的關(guān)系。方法 選取2017年5月—2018年5月湖北省中醫(yī)院肥胖科和內(nèi)科就診的5～10歲兒童100名為研究對象，依據(jù)體重指數(shù)將其分為對照組（24例）、超重組（42例）、肥胖組（34例）。所有標(biāo)本均采取靜脈血，采用改良的多重高溫連接酶檢測反應(yīng)技術(shù)（iMLDR）檢測肥胖基因上的三個SNP位點（rs9939609、rs1421085、rs8057044），測序技術(shù)檢測三組SNP位點的突變情況。 結(jié)果 三組rs9939609、rs1421085基因型分布比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）;三組rs8057044基因型分布比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）;超重組和肥胖組rs8057044位點等位基因表達(dá)頻率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 5～10歲兒童中，rs8075044位點可作為潛在的成人肥胖檢測位點。

[關(guān)鍵詞] 肥胖;兒童;單核苷酸多態(tài)性位點;測序

[中圖分類號] R723.14 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2020）08（b）-0008-05

[Abstract] Objective To study the mutation of obesity gene in children in Central China， and to explore the relationship between obesity and single nucleotide polymorphism （SNP） of obesity gene in children. Methods From May 2017 to May 2018， a total of 100 children aged five to ten were selected from the Department of Obesity and Internal Medicine of Hubei Hospital of Traditional Chinese Medicine. According to body mass index， they were divided into control group （24 cases）， overweight group （42 cases） and obesity group （34 cases）. Three SNP loci of obesity gene （rs9939609， rs1421085， rs8057044） were detected by the improved multiple high temperature ligase assay （iMLDR） and the mutations of SNP locus in three groups were detected by sequencing. Results There were no significant differences in genotype distribution of rs9939609 and rs1421085 loci among three groups （P > 0.05）. Genotype distribution of RS8057044 locus were compared among three groups， and the differences were statistically significant （P < 0.05）. There was no significant difference in allele frequency of rs8057044 locus between overweight group and obesity group （P > 0.05）. Conclusion Among the children aged five to ten， rs8075044 locus can be used as a potential detection site for adult obesity.

[Key words] Obesity; Children; Single nucleotide polymorphism loci; Sequence

肥胖是一種多基因、多環(huán)境影響的復(fù)雜疾病，吸煙、藥物、生活方式、基因等均能成為肥胖的原因。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們對肥胖癥遺傳發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識更為透徹，已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)FTO、MC4R等多種基因與肥胖癥相關(guān)[1-2]。嬰兒、兒童和青少年肥胖的流行率在全球范圍內(nèi)普遍上升。與高收入國家比較，低收入和發(fā)展中國家有更多的超重和肥胖兒童[3]。成人的脂肪堆積和心血管疾病發(fā)生與FTO基因上的SNP位點突變密切相關(guān)[4-5];有研究提出青少年時期的關(guān)鍵基因突變導(dǎo)致了成年期的肥胖，如0～6個月嬰兒期、6歲左右幼兒期等。目前，國內(nèi)外針對FTO基因上的位點突變研究較多，但結(jié)果缺乏一致性，且大多為國外報道[5-6]。本研究目的是找到我國中部地區(qū)兒童FTO基因的突變位點規(guī)律，探索兒童肥胖與FTO基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）的關(guān)系，為兒童肥胖的遺傳易感性以及及時治療提供幫助和理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年5月—2018年5月湖北省中醫(yī)院肥胖科和內(nèi)科就診的5～10歲兒童100名為研究對象。根據(jù)2017年《中國兒童肥胖報告》標(biāo)準(zhǔn)[7]，依據(jù)BMI將其分為對照組（體重正常）24例、超重組42例、肥胖組34例。三組均為中部地區(qū)漢族兒童，排除有心臟病、腦病及其他原發(fā)性疾病及有血緣關(guān)系的兒童。

1.2 方法

1.2.1三組基本資料的測量 ?嚴(yán)格按照人體測量標(biāo)準(zhǔn)對三組兒童的身高體重和脂肪含量（FM）進(jìn)行測量。身高體重用標(biāo)準(zhǔn)身高體重測量儀（鄭州上禾科技有限公司，SH-201）測量[8]。脂肪含量測量儀（Hologic Corporation，Waltham，MA，USA）測量精密度為1.4%，身高體重測量儀的測量精密度為0.5%。

1.2.2 DNA提取 ?采集三組兒童1～1.5 mL靜脈血，其中1 mL全血用于提取外周血單核細(xì)胞，DNA回收試劑盒（北京天根生化科技有限公司，DP219）提取DNA，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳（萊普特科學(xué)儀器有限公司，HS120）檢測，紫外分光光度儀（賽默飛世爾科技有限公司，Orion AqualMate 8000）測量吸光度（OD）260/280的比值。經(jīng)檢測合格的DNA模板，用ddH2O進(jìn)行重懸，并儲存在-70℃低溫冰箱內(nèi)[9]。

1.2.3 改良多重高溫連接酶檢測反應(yīng)（iMLDR）引物設(shè)計 ?本試驗使用的擴(kuò)增引物、連接引物等均由上海生工技術(shù)有限公司合成，上海天昊生物科技有限公司檢測突變位點。本研究前期研究中針對成人所設(shè)計的引物信息見表1[10]。

1.2.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增、光敏電阻（LDR）連接反應(yīng) ?經(jīng)優(yōu)化后的單重?zé)晒舛縋CR（美國ABI，ABI7500）體系為5 mol/L MgCl2，0.45 mol/L脫氧核糖核苷三磷酸，0.7 U Taq酶，0.30 μmol/L上游引物，0.30 μmol/L下游引物和7 μL DNA模板，加ddH2O至50 μL。優(yōu)化后的反應(yīng)條件：94℃ 3 min，94℃ 30 s，65℃ 25 s，72℃ 25 s，15個循環(huán);94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 50 s，35個循環(huán);72℃ 3 min。

擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收純化后，再進(jìn)行iMLDR的連接反應(yīng)。經(jīng)優(yōu)化后反應(yīng)體系為：PCR產(chǎn)物5 μL，高溫連接酶、5′引物混合液、3′引物混合液各1 μL、buffer 2 μL，加入無菌水至20 μL。

1.2.5 基因型的檢測 ?5 μL產(chǎn)物與10 μL甲酰胺、5 μL內(nèi)標(biāo)液充分混勻后，經(jīng)94℃變性3 min，測序儀（美國ABI，ABI3500）進(jìn)行毛細(xì)管電泳測序。數(shù)據(jù)經(jīng)A Plasmid Editor 2.0軟件處理后，在Genebank的Blast頁面進(jìn)行比對，直接判讀其突變類型。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗;計數(shù)資料用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。Hardy-Weinberg平衡吻合度分析采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組一般資料比較

三組年齡、身高比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），三組性別、體重、體重指數(shù)（BMI）、FM、體脂百分比（PBF）比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P < 0.05）。見表2。

2.2 Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗

三組基因型分布頻率符合隨機(jī)性原則，可認(rèn)為本研究的對象具有人群代表性[11]。

2.2.1 rs9939609位點Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗 ?三組rs9939609位點的等位基因及基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。見表3。

2.2.2 rs1421085位點Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗 ?三組rs1421085位點的等位基因及基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。見表4。

2.2.3 rs8057044位點Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗 ?三組rs8057044位點的等位基因及基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。見表5。

2.3 三組基因型分布比較

2.3.1 三組rs9939609位點基因型分布比較 ?三組rs9939609位點純和野生型、雜合突變型、純和突變型比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表6。

2.3.2 三組rs1421085位點基因型分布比較 ?三組rs1421085位點純和野生型、雜合突變型、純和突變型比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表7。

2.3.3 三組rs8057044位點基因型分布比較 ?三組rs8057044位點純和野生型、雜合突變型、純和突變型比較，差異有統(tǒng)計統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表8。

2.4 超重組和肥胖組rs8057044位點等位基因表達(dá)頻率比較

超重組和肥胖組rs8057044位點等位基因表達(dá)頻率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表9。

3 討論

本研究通過現(xiàn)代分子生物學(xué)方法分析FTO基因上的3個位點（rs9939609、rs1421085、rs8057044）與兒童肥胖的關(guān)系[12-15]。結(jié)果顯示，三組rs9939609、rs1421085位點基因型分布及等位基因頻率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）;rs8057044位點基因型分布及等位基因頻率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），但超重組和肥胖組rs8057044位點等位基因表達(dá)頻率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三組男童的比例高于女童，這與Almeida等[15]研究結(jié)果基本一致，在收集病例的過程中，發(fā)現(xiàn)超重組和肥胖組的男童或多或少的存在飲食方面的問題，如嗜飲碳酸飲料、嗜睡等，這可能也是導(dǎo)致其肥胖的另一原因。研究顯示[16-17]，男童更容易表現(xiàn)出進(jìn)餐速度快、對內(nèi)部飽食反應(yīng)不足、對外部食物反應(yīng)水平和對食物喜好程度增高等飲食行為特征，提示家長和學(xué)校相關(guān)機(jī)構(gòu)應(yīng)更注重學(xué)齡男童的飲食習(xí)慣培養(yǎng)。

本研究結(jié)果顯示，rs9939609、rs1421085位點在肥胖和健康兒童中分布基本一致，這與其他研究結(jié)果基本相同[15-16]。國外研究顯示[19]，在5歲半的兒童體內(nèi)，F(xiàn)TO基因rs9939609的A基因攜帶者腰圍、腰臀比和BMI指數(shù)較高，本研究也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果，在青少年時期較早的開始進(jìn)行脂肪堆積與成年后的代謝紊亂性疾病、心血管疾病密切相關(guān)。一方面，說明rs9939609、rs1421085的SNP位點不推薦作為我國中部兒童的肥胖檢測位點;另一方面，本研究發(fā)現(xiàn)rs8057044位點在肥胖組、超重組的突變頻率明顯高于對照組，即rs8057044的多態(tài)性與青少年肥胖有關(guān)。前期研究發(fā)現(xiàn)成人rs8057044位點也存在差異，與其他針對哈薩克族的研究結(jié)果不同[20]。這可能是由于種族和地域的差異導(dǎo)致的。同時也說明rs8057044位點極可能從青少年時期即開始突變從而導(dǎo)致成人時期的肥胖，其可作為檢測成人潛在性肥胖的檢驗位點，但需要更多的臨床標(biāo)本和研究加以驗證。

本研究采用BMI，有研究采用腰圍、腰臀比、腰圍身高比等指數(shù)[21]。BMI的優(yōu)勢在于操作簡單，計算方便，但腰圍更能反映腹型肥胖，同時也是糖尿病和心血管疾病發(fā)生發(fā)展的危險因素，腰臀比能準(zhǔn)確地反映脂肪的分布，這些指標(biāo)在評價心血管疾病方面均優(yōu)于BMI。此外有研究顯示[21-22]，腰圍身高比是反映FTO基因遺傳易感性的最佳指標(biāo)。隨著生活水平和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，肥胖特別是兒童肥胖的發(fā)生呈逐年遞增的趨勢。但總的來說在我國兒童中的FTO基因多態(tài)性的研究并不多，樣本量也偏少，結(jié)論不盡相同[22-23]。因此，盡快找到我國兒童肥胖基因上的SNP位點突變顯得尤為關(guān)鍵。

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