龐麗君 劉道潔 林明華

[摘要] 目的 構(gòu)建血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）原核表達(dá)載體并誘導(dǎo)其表達(dá)蛋白，為后續(xù)進(jìn)行VEGF相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。 方法 通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）擴(kuò)增得到目的片段，將DNA片段克隆至帶組氨酸標(biāo)簽的pET-30a（+）載體上;構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)過菌液聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）及測(cè)序方法鑒定;利用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)重組質(zhì)粒表達(dá)，通過蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）進(jìn)行鑒定。 結(jié)果 以HepG2細(xì)胞為模板擴(kuò)增出大小正確的片段;構(gòu)建的pET-30a-VEGF重組質(zhì)粒經(jīng)菌液PCR及DNA測(cè)序證實(shí)序列正確;考馬斯亮藍(lán)染膠和Western blot結(jié)果顯示IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白分子量正確且條帶單一。 結(jié)論 成功構(gòu)建pET-30a-VEGF原核表達(dá)質(zhì)粒，后續(xù)可進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)用于肝癌的診療相關(guān)研究。

[關(guān)鍵詞] 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子;肝細(xì)胞癌;基因克隆;原核表達(dá)

[中圖分類號(hào)] R735.7 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-7210（2020）08（b）-0004-04

[Abstract] Objective To construct a prokaryotic expression vector containing vascular endothelial growth factor （VEGF） and induce to express protein， it may lay a foundation for the follow-up study of VEGF. Methods Amplified The target fragment was amplified by reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR） and the DNA fragment was cloned into pET-30a（+） vector with histidine tag. The recombinant plasmid was identified by polymerase chain reaction （PCR） and sequencing. The expression of recombinant plasmid was induced by isopropylthio-β-D-galactoside （IPTG） and identified by Western blot. Results The right size of the fragment was amplified from HepG2 cells. The recombinant plasmid pET-30a-VEGF was confirmed by PCR and DNA sequencing. Coomassie brilliant blue staining and Western blot results showed that the molecular weight of the fusion protein induced by IPTG was correct and the band was single. Conclusion The prokaryotic expression plasmid of pET-30a-VEGF is successfully constructed， in addition， it might lay the foundation for development of HCC diagnostic and treatment research.

[Key words] Vascular endothelial growth factor; Hepatocellular carcinoma; Gene cloning; Prokaryotic expression

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我國(guó)腫瘤發(fā)病率排第2位的惡性腫瘤，是全世界第4大癌癥死亡原因[1]。在肝癌早期，臨床治療效果尚佳，然而70%～80%的患者被發(fā)現(xiàn)時(shí)已發(fā)展為晚期[2]。盡管開發(fā)了有效的抗病毒藥物[3-5]，但肝癌的發(fā)病率仍然呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，對(duì)人類健康的影響非常大。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在肝癌患者中高表達(dá)，能誘導(dǎo)腫瘤，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，而在正常肝組織中穩(wěn)定低表達(dá)[6]。VEGF是腫瘤血管生成的重要標(biāo)志物，直接參與肝癌的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及擴(kuò)散[7]。研究表明，VEGF可以更好地預(yù)測(cè)肝癌的預(yù)后、血管的侵犯，并可能指導(dǎo)肝臟的靶向治療[7-9]。本研究進(jìn)行了VEGF的克隆、表達(dá)載體的構(gòu)建，并誘導(dǎo)表達(dá)VEGF重組蛋白，為后續(xù)的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞株與主要儀器 ?HepG2肝癌細(xì)胞系和pET-30a（+）載體由北京市肝病研究所實(shí)驗(yàn)室提供。T100 PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)Bio-Rad公司）;Tanon-1600凝膠成像系統(tǒng);MaxQ HP481EPS 搖床（Thermo Scientific公司）;EF-C5高壓細(xì)胞破碎儀（加拿大Avestin公司）;EPS-300電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）;Bio-Rad ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.1.2 主要試劑 ?氨芐青霉素和硫酸卡那霉素（Solarbio，A7490、K8020）;IPTG（GPC Biotech，AC367-5G）;胰蛋白胨和酵母提取物（OXOID，LP0042、LP0021）;考馬斯亮藍(lán)R250（北京鼎國(guó)，C061）;PCR Taq mix（Takara，RR902A）;DNA marker、藍(lán)色預(yù)染蛋白質(zhì)marker和感受態(tài)細(xì)胞DH5α和Rosetta（DE3）（Biomed，MD102、PM202、BC102、BC204）;Ni-NTA Agarose、化學(xué)發(fā)光底物、限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI（Thermo Fisher Scientific，R901-01、34580、FD0583、FD0694）;硝酸纖維素膜（NC膜）（Life Sciences，PALL 66485）;RNA提取試劑盒（Qiagen，74004）。

1.2 方法

1.2.1 目的片段的擴(kuò)增 ?提取HepG2細(xì)胞總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA作為擴(kuò)增的模板。設(shè)計(jì)引物如下，VEGF-upper：5′-CATATGATGGTTGTTAAA-TTCATGGAC-3′，VEGF-lower：5′-CTCGAGGCACAA-CAAATGCGAATGCCGT-3′，兩端加入酶切位點(diǎn)NdeI和XhoI，片段長(zhǎng)度為279 bp。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s，56℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定后膠回收。

1.2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 ?PCR擴(kuò)增時(shí)保留C端的組氨酸（His）標(biāo)簽用于后續(xù)純化和鑒定。將上述擴(kuò)增片段和pET-30a（+）載體用NdeI和XhoI內(nèi)切酶分別在37℃水浴鍋中酶切后膠回收，兩者在連接酶的作用下常溫連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α細(xì)胞，37℃孵育過夜。次日挑取單克隆，搖菌過夜后通過菌液PCR鑒定，片段大小正確的克隆提取質(zhì)粒DNA，并送北京博邁德基因技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) ?將重組質(zhì)粒pET-30a-VEGF轉(zhuǎn)入Rosetta（DE3）細(xì)胞，37℃培養(yǎng)過夜后挑單克隆于含有50 mg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，在37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)12 h后按1∶50比例擴(kuò)大培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，菌體生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期后先留取5 mL菌液作為對(duì)照，剩余菌液加入誘導(dǎo)劑IPTG（0.1、0.5、1 mmol/L）后繼續(xù)培養(yǎng)4 h。

1.2.4 裂解重組蛋白并用SDS-PAGE電泳鑒定 ?離心收集誘導(dǎo)后的菌體，用PBS重懸菌體沉淀之后加入終濃度為1 μg/mL的溶酶菌，冰上靜置30 min;再加入1% NP40、終濃度1 mmol/L的蛋白酶抑制劑PMSF，冰上靜置30 min;利用高壓均質(zhì)機(jī)破碎菌體;12 000 g，離心30 min收集上清。向裂解后的液體加入蛋白上樣緩沖液，98℃加熱10 min后吸取上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳。用考馬斯亮藍(lán)過夜染SDS-PAGE膠，脫色后拍照觀察蛋白誘導(dǎo)情況。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法鑒定重組質(zhì)粒 ?向上述上清液中加入適量Ni-NTA，4 ℃孵育過夜，2000 g離心1 min，Ni-NTA清洗3次，離心棄上清液;向沉淀的Ni-NTA中加入適量洗脫液，競(jìng)爭(zhēng)洗脫目的蛋白。蛋白樣品加入上樣緩沖液，98℃加熱10 min后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后對(duì)NC膜進(jìn)行封閉、洗膜、孵育抗體，最后進(jìn)行曝光。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增目的片段

以HepG2細(xì)胞為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，擴(kuò)增出大小正確的DNA片段。見圖1。

2.2 重組質(zhì)粒pET-30a-VEGF的構(gòu)建及鑒定

上述PCR產(chǎn)物克隆至pET-30a載體中，重組轉(zhuǎn)化后挑單克隆進(jìn)行菌液PCR，瓊脂糖電泳顯示條帶大小正確，見圖2。將驗(yàn)證的重組質(zhì)粒送北京博邁德基因技術(shù)有限公司測(cè)序，序列完全正確，顯示該質(zhì)粒構(gòu)建成功，見圖3（封三）。

2.3 誘導(dǎo)表達(dá)VEGF融合蛋白

測(cè)序正確的質(zhì)粒pET-30a-VEGF轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞，用不同濃度IPTG誘導(dǎo)，裂解菌液后經(jīng)過考馬斯亮藍(lán)染SDS-PAGE膠。與未誘導(dǎo)組比較，在11 kD位置有明顯的蛋白條帶，且3個(gè)誘導(dǎo)濃度的蛋白表達(dá)量沒有明顯差別。見圖4。

2.4 蛋白質(zhì)印跡法鑒定重組載體表達(dá)情況

由于pET-30a-VEGF質(zhì)粒有His標(biāo)簽，純化后的融合蛋白可以用His抗體進(jìn)行鑒定，可以看到一條明顯的蛋白條帶，大小和目的蛋白一致，提示所構(gòu)建的重組載體可以正確表達(dá)。見圖5。

3 討論

肝細(xì)胞癌是最常見的癌癥之一，由感染引起的肝硬化是其主要病因，其他因素如酒精、藥物、自身免疫性肝炎和非酒精性脂肪肝也與肝癌的發(fā)生有關(guān)[10-11]。大部分肝癌患者確診時(shí)已屬晚期，失去了最佳手術(shù)時(shí)期，并且放化療對(duì)肝癌幾乎無(wú)效[12]。索拉非尼作為治療晚期肝癌的一線治療藥物，被報(bào)道可以延長(zhǎng)患者的整體生存期2～3個(gè)月[13-14]，它是一種多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑，靶向多種信號(hào)通路，其中就包括以VEGF為中心的通路[15]。有研究報(bào)道索拉非尼和其他VEGF抑制劑能明顯影響肝癌血管生成和血管通透性[16-17]。VEGF信號(hào)通路調(diào)控血管形態(tài)對(duì)肝細(xì)胞構(gòu)筑和腫瘤生長(zhǎng)都很重要，VEGF的濃度決定血管生成的方向和血管的延伸以及增長(zhǎng)[18]。除了促進(jìn)血管生成和血管通透性，VEGF還可以在腫瘤中發(fā)揮免疫抑制作用，例如VEGF能抑制樹突狀細(xì)胞的成熟并誘導(dǎo)免疫抑制性炎癥細(xì)胞的積聚[19-20]。此外，在缺氧的腫瘤環(huán)境中，VEGF能通過缺氧誘導(dǎo)因子使依賴性途徑上調(diào)，通過表達(dá)更高水平的促炎細(xì)胞因子和免疫抑制介質(zhì)影響腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制功能[21]。腫瘤微環(huán)境中過量的VEGF產(chǎn)生可能有助于癌細(xì)胞以多種直接和間接的方式逃避免疫系統(tǒng)，正如相關(guān)基礎(chǔ)和臨床研究所示，抗VEGF治療在某些情況下可促進(jìn)抗腫瘤的免疫反應(yīng)[22-23]。

在免疫微環(huán)境中，阻斷VEGF是一把雙刃劍，它可以增加或減少免疫抑制。因此，聯(lián)合使用抗血管生成靶向藥物和免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療肝癌和其他惡性腫瘤時(shí)，對(duì)于提高療效至關(guān)重要[24-25]。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的VEGF表達(dá)載體能夠誘導(dǎo)表達(dá)VEGF融合蛋白，無(wú)論是將其作為抗原應(yīng)用或作為后續(xù)制備VEGF單克隆抗體，對(duì)于肝癌診療的相關(guān)研究都奠定了一定的基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2020-05-26）