潘樂(lè)， 魏濤， 孫麗莉， 吳進(jìn)， 劉華敏

（1.黃山學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院， 安徽 黃山245041； 2.安徽中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心， 安徽 合肥230088）

0 引言

節(jié)節(jié)草（Equisetum ramosissimumDesf.）為木賊科多年生草本植物，在《中國(guó)藥典》2010 版中學(xué)名為木賊，其含有多糖、黃酮及生物堿等有機(jī)活性成分［1］. 已經(jīng)報(bào)道證實(shí)其有清熱解毒、降火清淤、降血脂、保護(hù)血管等作用，是一種極有前景的天然中草藥［2］. 國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)木賊科植物的有機(jī)活性成分進(jìn)行了研究［3］. 天然多糖具有抗氧化、防衰老、降血壓、降血脂及抗腫瘤等功效，因而受到了業(yè)界人士的廣泛關(guān)注. 多糖主要來(lái)源于天然植物之中，現(xiàn)已知曉可以從貢菊［4］、南瓜［5］、筋骨草［6］等植物中提取多糖. 主要提取的方法有水熱法、酶解法、超聲波輔助提取、微波輔助提取、超臨界流體萃取等提取方法［7］.

微波輔助提取法是一種新型高效的天然產(chǎn)物提取方法，相比于傳統(tǒng)的熱水浸取法，微波輔助提取具有耗時(shí)短、效率高、能耗少等優(yōu)點(diǎn). 已有報(bào)道微波可以提取板栗淀粉［8］、芒果片多酚［9］、艾葉總黃酮［10］等天然活性物質(zhì). 然而，現(xiàn)階段還未見(jiàn)有微波輔助提取節(jié)節(jié)草中多糖的報(bào)道. 本實(shí)驗(yàn)研究采用高效的微波提取技術(shù)提取節(jié)節(jié)草中的多糖工藝. 實(shí)驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取節(jié)節(jié)草中的多糖，從而得到微波輔助提取的最優(yōu)工藝.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

2018 年9 月22 日通過(guò)“淘寶”購(gòu)于皇冠店“亳州市九林中藥材銷售公司”，經(jīng)黃山學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院吳永祥副教授鑒定為節(jié)節(jié)草樣品. 將采購(gòu)的樣品放入烘箱中干燥后放入到中藥粉碎機(jī)中粉碎，過(guò)篩（100 目）. 稱取一定量的節(jié)節(jié)草粉末，按料液比為1∶20 的比例加入無(wú)水乙醇浸泡1 h 進(jìn)行脫脂，然后將樣品抽濾，烘干至恒重. 將粉末收集到廣口瓶中密封保存，備用.

葡萄糖、無(wú)水乙醇、正丁醇、三氯甲烷為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司； 濃硫酸為分析純，購(gòu)于西隴化工股份有限公司； 苯酚為分析純，購(gòu)于宜興市化學(xué)試劑有限公司； 水為超純水. GZX－9030 MBE 電熱鼓風(fēng)干燥機(jī)，MAPADA UV－1100 紫外分光光度計(jì)，F(xiàn)A12048 電子分析天平，XH100B 微波催化合成萃取儀，XFB－1000 中藥粉碎機(jī)，RE－52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器.

1.2 節(jié)節(jié)草多糖含量的測(cè)定

移取1.00 mL 節(jié)節(jié)草多糖提取液于50 mL 燒杯中. 移取6 mL 去離子水于燒杯中進(jìn)行稀釋，攪拌均勻后移取多糖稀釋液1.00 mL 于50 mL 具塞試管中. 按次序先后加入1 mL 5%苯酚和5 mL 濃硫酸，搖勻后置于水浴鍋中，60 ℃水浴10 min. 待顯色反應(yīng)完成后，紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)為490 nm 處測(cè)試待測(cè)液體的吸光度值，該過(guò)程利用去離子水為參比溶液進(jìn)行校零. 節(jié)節(jié)草多糖的提取按公式（1）計(jì)算：

式中：S為節(jié)節(jié)草多糖提取質(zhì)量分?jǐn)?shù)／（mg／g）；ω為溶液質(zhì)量濃度／（mg／mL）；V為液體體積／mL；N為樣品稀釋倍數(shù)；m為節(jié)節(jié)草樣品質(zhì)量／g.

1.3 節(jié)節(jié)草多糖提取最優(yōu)條件的確定

在單一變量的條件下分別研究提取溫度（30、40、50、60、70、80 ℃），料液比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1 ∶60 g／mL），微波時(shí)間（5、10、15、20、25 min），微波功率（200、300、400、500、600、700 W）對(duì)節(jié)節(jié)草多糖提取率的影響. 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上對(duì)節(jié)節(jié)草多糖提取率的3 個(gè)因素料液比、微波時(shí)間和微波功率進(jìn)行編碼. 通過(guò)Design－Expert 10 軟件進(jìn)行分析和優(yōu)化.

1.4 紅外光譜表征

將微波輔助提取得到的節(jié)節(jié)草多糖溶液加入到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，加熱濃縮至一定量后倒入分液漏斗中，按體積比為（1∶4）的比例加入Sevage 試劑，劇烈振蕩后除去2 層液體中間物質(zhì)，重復(fù)多次完成除蛋白. 按1∶1 的比例往除去蛋白質(zhì)后的節(jié)節(jié)草多糖溶液加入無(wú)水乙醇，然后將樣品液進(jìn)行過(guò)濾后放入鼓風(fēng)干燥箱烘干至恒重. 取少量處理后得到的節(jié)節(jié)草多糖，與干燥的溴化鉀粉末混合，在瑪瑙研缽中研磨均勻，壓片后使用紅外光譜儀掃描32 次，得到微波提取節(jié)節(jié)草多糖的紅外光譜圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 微波輔助提取條件的確定

預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)于微波輔助提取節(jié)節(jié)草中的多糖影響因素有料液比、微波溫度、微波時(shí)間等. 對(duì)料液比、微波溫度、微波時(shí)間分別進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，獲得最佳單因素提取條件為料液比1∶50 g／mL，提取時(shí)間15 min，溫度60 ℃. 由于節(jié)節(jié)草多糖的提取會(huì)受到這些因素的相互影響，因此根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化方法，利用單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果和Box－Benhnken 的中心組合設(shè)計(jì)原理［10］，確定節(jié)節(jié)草多糖提取工藝響應(yīng)面分析的變量因素編碼和水平如表1.

表1 響應(yīng)面分析因素和水平

按表1 的分析因素和水平，利用Design－Expert 10 軟件進(jìn)行節(jié)節(jié)草多糖提取工藝實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，共設(shè)計(jì)17 個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，得到實(shí)際結(jié)果如表2 所示.

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.2 模型方程的建立與顯著性檢驗(yàn)

利用Design－Expert 10 軟件將表2 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析：以節(jié)節(jié)草多糖提取率（Y）為效應(yīng)值，分別對(duì)微波溫度為（A），微波時(shí)間為（B），料液比為（C）3 個(gè)因素進(jìn)行多元回歸擬合，發(fā)現(xiàn)用二次階多項(xiàng)式回歸最優(yōu)，軟件得到的二次回歸方程模型為

對(duì)擬合方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 回歸模型方差分析結(jié)果

由表3 可以看出，該模型F＝30.18，P＜0.000 1，表明模型極顯著. 模型的決定系數(shù)R2＝0.974 9，說(shuō)明該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合較好，各個(gè)自變量與提取率響應(yīng)值之間線性系顯著. 因此，該回歸方程對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合情況較好，實(shí)驗(yàn)誤差小，可以較好地描述各因素和響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系.

從系數(shù)項(xiàng)P值來(lái)分析，方程的一次項(xiàng)C、交互項(xiàng)AC、二次項(xiàng)A2和B2都達(dá)到極顯著水平，說(shuō)明試驗(yàn)各個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的影響并非簡(jiǎn)單的線性關(guān)系［11］.

F值可以反映各實(shí)驗(yàn)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的重要性，F(xiàn)值越大，表明對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的影響越大； 從表3 可知，C＞A＞B，所以各個(gè)單因素對(duì)節(jié)節(jié)草多糖提取率的影響為料液比＞溫度＞時(shí)間.

2.3 微波輔助提取工藝的響應(yīng)面交互作用分析

節(jié)節(jié)草多糖提取率（Y）與自變量三維響應(yīng)曲線面，如圖1 所示. 微波溫度（A）與微波時(shí)間（B）的底面等高線密度相差不大，表明AB的交互作用對(duì)微波提取節(jié)節(jié)草多糖的影響不夠顯著； 微波溫度（A）與料液比（C）之間底面等高線密度最大，表明AC的交互作用對(duì)節(jié)節(jié)草多糖提取率的影響顯著； 料液比（C）與微波時(shí)間（B）的底面等高線密度相差不大，表明BC的交互作用對(duì)節(jié)節(jié)草多糖提取率影響不夠顯著. 這與表3 中方差分析結(jié)果一致. 對(duì)模型方程求一階偏導(dǎo)可得模型的最佳提取條件為：微波溫度49.70℃，料液比1∶46.65 g／mL，提取時(shí)間15.55 min，微波提取節(jié)節(jié)草多糖的理論提取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.188 98 mg／g.

圖1 節(jié)節(jié)草多糖提取的三維響應(yīng)面曲線面

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化的最優(yōu)提取條件的驗(yàn)證

根據(jù)Design－Expert 8.0.6.1 軟件得到的數(shù)據(jù)回歸方程結(jié)合實(shí)際情況可以得到的最佳提取工藝條件為：料液比1∶46.65 g／mL、微波溫度49.70 ℃，微波時(shí)間15.55 min. 在上述的條件下多糖的理論提取率為4.19%，考慮到實(shí)際操作的便利，將提取最佳條件修正為料液比為1∶47 g／mL，提取時(shí)間為15 min，微波溫度為50 ℃，平行實(shí)驗(yàn)3 次，多糖提取率為4.16%. 與預(yù)測(cè)值為4.19%相比，得到的實(shí)際測(cè)量值與理論值之間相對(duì)誤差為－0.72%，表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果與軟件模擬給出的預(yù)測(cè)相一致.

圖2 微波提取節(jié)節(jié)草多糖的紅外光譜圖

2.5 紅外光譜分析

最佳條件提取的節(jié)節(jié)草多糖，經(jīng)過(guò)除蛋白和醇沉進(jìn)行純化處理，獲得的樣品干燥后測(cè)得其紅外光譜如圖2.從圖2 可以看出3 450 cm－1和2 930 cm－1應(yīng)該分別屬于節(jié)節(jié)草多糖－OH和C－H的伸縮振動(dòng)吸收峰.1 732 cm－1、1 630 cm－1的吸收峰應(yīng)歸屬于節(jié)節(jié)草多糖的羧基（COO－）的伸縮振動(dòng). 紅外光譜的結(jié)果與多糖的主要官能團(tuán)特征一致，結(jié)合節(jié)節(jié)草微波提取物可以采取苯酚－硫酸法進(jìn)行顯色的特征，可以確定微波提取的節(jié)節(jié)草成分應(yīng)為多糖類物質(zhì).

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用微波輔助提取節(jié)節(jié)草中的多糖，選取料液比、微波時(shí)間、微波溫度3 個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn).根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，利用計(jì)算機(jī)軟件Design－Expert 進(jìn)行響應(yīng)面法設(shè)計(jì)，優(yōu)化了節(jié)節(jié)草多糖提取工藝. 模型的決定系數(shù)R2＝0.974 9，說(shuō)明該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合較好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著. 通過(guò)模型設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)探討，確立了微波輔助節(jié)節(jié)草中多糖的最佳提取工藝：料液比為1∶47 g／mL，提取時(shí)間為16 min，微波溫度為50 ℃. 該方法對(duì)節(jié)節(jié)草中多糖成分的提取和在食品、藥品領(lǐng)域的應(yīng)用研究具有一定的借鑒作用.