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雷公藤內(nèi)酯醇保護(hù)脂多糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的體外研究

2020-10-12 08:32齊芳艷劉俊朝韓新利汪永紅
關(guān)鍵詞:雷公藤空白對(duì)照誘導(dǎo)

齊芳艷 劉俊朝 俞 建△ 徐 虹 韓新利 汪永紅 孫 雯

(1復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院中醫(yī)科,2腎臟科 上海 201102)

足細(xì)胞又稱為腎小球內(nèi)臟上皮細(xì)胞,是高度特化的、終末分化的上皮細(xì)胞[1],參與構(gòu)成腎小球?yàn)V過(guò)屏障,在腎小球?yàn)V過(guò)功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]。具有大量足突是足細(xì)胞的顯著特點(diǎn),這一結(jié)構(gòu)的維系由細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架承擔(dān)[3],相鄰足細(xì)胞之間的足突可互相交叉重疊形成裂孔隔膜(the slit diaphragm,SD)。各種病理因素可導(dǎo)致足細(xì)胞損傷,使細(xì)胞骨架發(fā)生重排,出現(xiàn)廣泛的足突融合[4],這是臨床上產(chǎn)生蛋白尿的重要基礎(chǔ)。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是脂質(zhì)A 與革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁寡糖的復(fù)合物,其誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷模型被廣泛應(yīng)用于腎臟疾病研究[5-6]。LPS 主要通過(guò)NFκB 信號(hào)通路導(dǎo)致足突融合及細(xì)胞骨架改變,從而造成足細(xì)胞損傷[5]。

中醫(yī)藥用于腎臟疾病的治療已有數(shù)千年歷史,雷公藤內(nèi)酯醇(triptolide,TPL)[7]是中草藥雷公藤的主要活性成分之一,TPL 生物學(xué)作用包括免疫抑制、抗炎、抗癌等[8-11]。TPL 可提高Nephrin 等足細(xì)胞保護(hù)性蛋白的表達(dá),從而對(duì)嘌呤霉素氨基核苷(purinomycin aminophenol,PAN)誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷模型起保護(hù)作用[12-13]。

經(jīng)典足細(xì)胞損傷模型中,可出現(xiàn)足細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白質(zhì)分子表達(dá)降低,如CD2-相關(guān)蛋白(CD2-associated protein,CD2AP) 、突 觸 極 蛋 白(Synaptopodin)、Palladin、黏著斑蛋白(Vinculin)等。CD2AP 表達(dá)于SD,可與Nephrin、Podocin 結(jié)合[14],SH3-1 結(jié)構(gòu)域Y10 位的酪氨酸磷酸化過(guò)程對(duì)其與Nephrin 的結(jié)合起關(guān)鍵作用[15]。Lehtonen 等[16]的研究證明,CD2AP 與足細(xì)胞細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白密切相關(guān),可參與維持細(xì)胞骨架穩(wěn)定。Synaptopodin 是一種富含脯氨酸的肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白質(zhì)分子,參與調(diào)控足細(xì)胞足突的肌動(dòng)蛋白形態(tài)及其運(yùn)動(dòng)[17]。Palladin 在參與穩(wěn)定細(xì)胞骨架和維持黏著斑功能中發(fā)揮關(guān)鍵的作用[18]。Artelt 等[19]研究表明,足細(xì)胞中Palladin 與細(xì)胞骨架關(guān)系密切,其表達(dá)降低可引起足細(xì)胞肌動(dòng)蛋白絲形成減少以及肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白質(zhì)分子的表達(dá)異常。Vinculin 是主要定位于黏著 斑 的銜接 蛋 白 質(zhì) 分子[20],Lausecker 等[21]研 究表明,Vinculin 參與維系足細(xì)胞足突結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定細(xì)胞間連接,維持腎小球?yàn)V過(guò)屏障功能完整,并參與調(diào)節(jié)腎小球?yàn)V過(guò)作用。 血管生成素樣蛋白3(angiopoietin-like protein 3,Angptl3)基 因 最 早 由Conklin 等[22]發(fā)現(xiàn),生理情況下主要表達(dá)于肝臟,腎臟表達(dá)微弱,參與脂質(zhì)代謝[23]。實(shí)驗(yàn)證明,Angptl3 可介導(dǎo)足細(xì)胞損傷[24-26]。上述蛋白質(zhì)分子與足細(xì)胞細(xì)胞骨架構(gòu)成及功能維持均有一定關(guān)系,其表達(dá)水平的高低可在一定程度上反映對(duì)細(xì)胞骨架的影響程度。

因此,我們利用TPL 處理LPS 誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷模型,通過(guò)觀察細(xì)胞骨架變化及檢測(cè)不同處理組足細(xì)胞CD2AP、Synaptopodin、Palladin、Vinculin 以及Angptl3 的表達(dá)變化,從而探討TPL 是否對(duì)足細(xì)胞細(xì)胞骨架具有保護(hù)作用。

材料和方法

細(xì)胞培養(yǎng)小鼠條件永生化足細(xì)胞株(MPC5),由美國(guó)Peter Mundel教授構(gòu)建、浙江大學(xué)毛建華教授轉(zhuǎn)贈(zèng)。培養(yǎng)方法參考文獻(xiàn)[27],MPC5 復(fù)蘇后用含10%胎牛血清、100 IU/mL 青霉素、100 mg/mL 鏈霉素、10 IU/mL γ-IFN 的RPMI 1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司),于33 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng);誘導(dǎo)分化時(shí),轉(zhuǎn)移至37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi),加入不含γ-IFN的1640 培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng);分化14 天時(shí),用0.25%Trypsin-EDTA(美國(guó)Gibco 公司)消化傳代培養(yǎng)足細(xì)胞,細(xì)胞匯合達(dá)80%時(shí)進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)。LPS(美國(guó)Sigma 公司)誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷,根據(jù)給予或不給予TPL(上海融禾醫(yī)藥科技有限公司),檢測(cè)純度99.03%)處理24 h,分為空白對(duì)照組(生理鹽水)、藥物組(TPL 3 ng/mL)、模型組(LPS 25 μg/mL)及實(shí)驗(yàn)組(LPS 25 μg/mL+TPL3 ng/mL)。藥物作用濃度的選擇參考文獻(xiàn)[12],由前期預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最終濃度,結(jié)果未展示。

Western blot 檢測(cè)將收集的細(xì)胞溶解于含有蛋白酶抑制劑PMSF 的RIPA 緩沖液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)中,冰上裂解后4 ℃11 000×g離心取上清,加入加樣緩沖液(北京索萊寶科技有限公司)100 ℃加熱10 min,確定蛋白上樣量,配制8%分離膠、濃縮膠,Marker,電泳分離蛋白,轉(zhuǎn)膜,根據(jù)目的蛋白分子量裁剪條帶,5%脫脂奶粉封閉30 min,TBST 洗膜,加入針對(duì)Angptl3、Synaptopodin、CD2AP、Palladin 和GAPDH 的 一抗在4 ℃孵育過(guò)夜,洗膜后使用山羊抗兔IgG-HRP 二抗60 min,洗膜10 min×3 次,顯色、曝光(Tanon-5200)。將蛋白質(zhì)表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH 作為管家蛋白質(zhì)。

足細(xì)胞細(xì)胞骨架觀察藥物處理24 h,預(yù)冷的PBS 清 洗,4% 多 聚 甲 醛 室 溫 固 定10 min,0.2%Triton-X 100 PBS 室 溫 破 膜10 min,PBS 洗 片 后加入50 μg/mL 的FITC 標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽(美國(guó)Sigma公司),室溫避光孵育40 min,PBS 清洗后加入DAPI 染液,室溫避光孵育20 min,PBS 清洗2 次,抗淬滅封片劑封片,玻片于激光共聚焦顯微鏡(Leica SP8)下觀察并采集圖像

足細(xì)胞免疫熒光藥物處理24 h,預(yù)冷的PBS清洗,4%多聚甲醛室溫固定10 min,0.2% Triton-X 100 PBS 室 溫 破 膜10 min,PBS 洗 片 后 加 入3%BSA-PBS 室溫封閉30 min,加入3%BSA-PBS配制的Vinculin 一抗4 ℃孵育過(guò)夜,PBS 清洗后加入FITC 標(biāo)記的熒光二抗及DAPI 染液,室溫避光孵育1 h,PBS 清洗3 次,抗淬滅封片劑封片,于激光共聚焦顯微鏡(Leica SP8)下觀察并采集圖像。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7 統(tǒng)計(jì)軟件處理,多組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次。

結(jié) 果

TPL 對(duì)足細(xì)胞細(xì)胞骨架的影響足細(xì)胞骨架重排是檢測(cè)足細(xì)胞功能的重要指標(biāo)之一,因此我們檢測(cè)了各組的細(xì)胞骨架情況。如圖1 所示,通過(guò)免疫熒光染色觀察不同處理組細(xì)胞骨架排列情況,藥物組與空白對(duì)照組無(wú)明顯差異,模型組足細(xì)胞細(xì)胞骨架呈短棒狀無(wú)序排列,甚至正常的絲狀結(jié)構(gòu)消失,細(xì)胞形態(tài)改變較為明顯,而實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)足細(xì)胞細(xì)胞骨架排列趨于整齊,部分絲狀結(jié)構(gòu)完整。

TPL 對(duì)足細(xì)胞CD2AP 和Synaptopodin 表 達(dá)的影響應(yīng)用Western blot 分別檢測(cè)空白對(duì)照組、藥物組、模型組及實(shí)驗(yàn)組足細(xì)胞CD2AP 和Synaptopodin的表達(dá)情況(圖2)。與空白對(duì)照組相比,藥物組CD2AP 及Synaptopodin 表達(dá)無(wú)明顯差異,模型組表達(dá)明顯降低(P<0.01);與模型組相比,實(shí)驗(yàn)組足細(xì)胞CD2AP(P<0.05)及Synaptopodin(P<0.001)的表達(dá)明顯增高。

TPL 對(duì)足細(xì)胞Palladin 及Angptl3 表達(dá) 的 影 響應(yīng)用Western blot 分別檢測(cè)空白對(duì)照組、藥物組、模型組及實(shí)驗(yàn)組足細(xì)胞Palladin 及Angptl3 的表達(dá)情況(圖2)。與空白對(duì)照組相比,藥物組Palladin 表達(dá)無(wú)明顯差異,模型組足細(xì)胞Palladin 表達(dá)明顯降低(P<0.05);與模型組相比,實(shí)驗(yàn)組Palladin 的表達(dá)明顯增高(P<0.05)。與空白對(duì)照組相比,藥物組Angptl3 表達(dá)無(wú)明顯差異,模型組Angptl3 的表達(dá)明顯增高(P<0.001);與模型組相比,實(shí)驗(yàn)組Angptl3的表達(dá)明顯降低(P<0.05)。

TPL 對(duì)足細(xì)胞黏著斑蛋白Vinculin 表達(dá)的影響足細(xì)胞失黏附是其功能損傷的另一個(gè)重要表現(xiàn),黏著斑蛋白Vinculin 的表達(dá)情況可以反映足細(xì)胞的黏附功能。應(yīng)用免疫熒光法檢測(cè)不同組Vinculin 的表達(dá)情況(圖3)。與空白對(duì)照組相比,藥物組Vinculin 表達(dá)無(wú)明顯降低,模型組的Vinculin 表達(dá)明顯降低;與模型組相比,實(shí)驗(yàn)組Vinculin 表達(dá)相對(duì)較高。

討 論

足細(xì)胞足突融合是產(chǎn)生蛋白尿的重要病理生理基礎(chǔ)之一,與足細(xì)胞細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)損傷及細(xì)胞-細(xì)胞連接缺失密切相關(guān)[28-29]。CD2AP 作為足細(xì)胞重要的固有蛋白質(zhì)分子之一[30],與足細(xì)胞細(xì)胞骨架的維系關(guān)系密切[16];Synaptopodin 在參與調(diào)節(jié)足細(xì)胞骨架重排及足細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[17,31],Huber 等[32]研 究 表 明,Synaptopodin 與CD2AP 之間有直接的相互作用。本實(shí)驗(yàn)探究TPL對(duì)LPS 誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷模型的保護(hù)作用,藥物作用濃度參考Zheng 等[12]的研究,最終濃度由前期預(yù)實(shí)驗(yàn)確定,研究結(jié)果提示TPL 可緩解LPS 誘導(dǎo)的足細(xì)胞骨架損傷,保持足細(xì)胞細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的相對(duì)完整,并使足細(xì)胞CD2AP、Synaptopodin 的表達(dá)增高,所以我們認(rèn)為TPL 對(duì)足細(xì)胞骨架的保護(hù)作用與其使CD2AP 和Synaptopodin 的表達(dá)增高有一定的關(guān)系。

Artelt 等[19]研究提示,Palladin 的表達(dá)降低與肌動(dòng)蛋白纖維的減少有關(guān),同時(shí)也與足細(xì)胞特異性的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白Synaptopodin 和α-actinin-4 的表達(dá)降低有關(guān)。Atherton 等[33]的研究表明,Vinculin 在整合素介導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白絲與細(xì)胞外基質(zhì)的連接中發(fā)揮重要作用,有研究證明[34-35]Vinculin 對(duì)維持足突正常結(jié)構(gòu)十分重要;Palladin 對(duì)足細(xì)胞的影響可能與Vinculin 有 關(guān)[19]。我 們 的 研 究 證 明,TPL 不 僅 可 以減輕LPS 造成的足細(xì)胞Palladin 表達(dá)降低,同時(shí)可以有效保護(hù)Vinculin 的表達(dá)。Palladin 及Vinculin 的表達(dá)增高與保護(hù)足細(xì)胞細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)完整性有一定的關(guān)系,但TPL 與上述兩種蛋白質(zhì)分子的表達(dá)有無(wú)直接聯(lián)系,尚需進(jìn)一步試驗(yàn)證明。

徐虹課題組對(duì)Angptl3 基因在腎臟疾病中的作用做了大量研究。在足細(xì)胞損害嚴(yán)重的病理類型中,如微小病變型腎?。╩inimal change disease,MCD)和膜性腎?。╩embranous nephropathy,MN)腎臟組織中Angptl3 的表達(dá)明顯增高[36]。腎病損傷動(dòng)物模型中Angptl3 主要在腎小球足細(xì)胞足突部位表達(dá)增高[37]。進(jìn)一步的體外研究表明,Angptl3 可與足細(xì)胞表面的整合素αVβ3 結(jié)合,最終通過(guò)αVβ3/FAK/PI3K 信號(hào)通路導(dǎo)致足細(xì)胞骨架重排和足細(xì)胞遷移增加[25]。最新研究表明,抗ANGPTL3-CCD抗體可以改善小鼠阿霉素模型中的蛋白尿及足細(xì)胞功能損傷[38]。本研究中,空白對(duì)照組及藥物組足細(xì)胞Angptl3 幾乎不表達(dá),模型組中Angptl3 的表達(dá)明顯增高,實(shí)驗(yàn)組Angptl3 的表達(dá)顯著降低,說(shuō)明TPL 可以降低足細(xì)胞Angptl3 的表達(dá)。目前尚無(wú)關(guān)于通過(guò)降低Angptl3 的表達(dá)而保護(hù)足細(xì)胞藥物的報(bào)道,我們推測(cè)TPL 對(duì)足細(xì)胞的保護(hù)與影響Angptl3的表達(dá)可能有一定的聯(lián)系。

傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療腎病歷史悠久,雷公藤在腎臟疾病及免疫性疾病的治療中應(yīng)用頗為廣泛。Zheng等[12]研究發(fā)現(xiàn),TPL 可以保護(hù)足細(xì)胞減輕嘌呤霉素導(dǎo)致的細(xì)胞骨架損傷以及Nephrin 和Podocin 的異常表達(dá),作用機(jī)制主要與影響p38 MAPK 信號(hào)通路、參與抑制ROS 的產(chǎn)生以及RhoA 活性恢復(fù)等有關(guān)。在被動(dòng)性Heymann 腎炎(PHN)膜性腎病大鼠模型中,TPL 可以明顯減少蛋白尿,減輕免疫介導(dǎo)的腎臟損傷[13]。體外膜攻擊復(fù)合物C5b-9 誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷模型中,TPL 可以減輕C5b-9 介導(dǎo)的足細(xì)胞損傷,其中可能涉及與MAPK 相關(guān)的多條信號(hào)通路。上述圍繞TPL 的實(shí)驗(yàn)研究主要涉及嘌呤霉素、阿霉素以及C5b-9 誘導(dǎo)的損傷模型。本研究以LPS誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷模型為研究對(duì)象,探究TPL 對(duì)足細(xì)胞細(xì)胞骨架的保護(hù)作用,結(jié)果提示TPL 對(duì)足細(xì)胞骨架有一定的保護(hù)作用,可通過(guò)調(diào)節(jié)重要蛋白質(zhì)分子的表達(dá),在一定程度上緩解LPS 造成的足細(xì)胞損傷。臨床上應(yīng)用較多的雷公藤多苷是從植物雷公藤中提取的含多種成分的混合物,減輕了部分雷公藤的毒性作用,其主要不良反應(yīng)包括肝腎功能損害和消化系統(tǒng)癥狀等。本研究中所用TPL 試劑是從中藥雷公藤中提取的高純度的單一物質(zhì)。文獻(xiàn)表明TPL 有一定的細(xì)胞毒性[39],目前臨床中尚無(wú)應(yīng)用,其毒副作用研究尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

足細(xì)胞損傷是多數(shù)腎臟疾病發(fā)生、發(fā)展的重要病理生理機(jī)制,探究如何保護(hù)足細(xì)胞功能結(jié)構(gòu)的完整已成為研究治療腎臟疾病藥物的重要方向之一。足細(xì)胞正常細(xì)胞骨架的維持、足細(xì)胞骨架異常重排過(guò)程涉及眾多分子間的相互作用及多條信號(hào)通路調(diào)控[40]。我們的研究初步提示,TPL 對(duì)LPS 造成的足細(xì)胞損傷有較好的保護(hù)作用,可能與其提高CD2AP、Synatopodin、Palladin、Vinculin 表達(dá)以及降低Angptl3 表達(dá)有一定的關(guān)系,但具體機(jī)制有待進(jìn)一步探究,特別是明確相關(guān)分子之間的相互關(guān)系,將有助于更好地探討足細(xì)胞的保護(hù)作用。

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