梁衛(wèi)勤 林智

鼻咽癌是人體內(nèi)分泌器官中最為常見的腫瘤類型，發(fā)病率逐年遞增，具有隱匿性強、進展緩慢的特點，部分患者在初次診斷時已發(fā)生轉(zhuǎn)移[1-3]。文獻報道，鼻咽癌的發(fā)生和癌基因的活化表達相關(guān)，因此揭示鼻咽癌相關(guān)的基因和調(diào)控機制對治療鼻咽癌具有極其重要的意義[4]。長鏈非編碼RNA(long-chain noncoding RNA，lnc RNA)曾被認為不發(fā)揮實際作用，近年來有研究發(fā)現(xiàn)，其在腫瘤細胞周期、腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移與化療耐藥等相關(guān)的信號通路方面均發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[5-8]。作為lnc RNA家族成員之一，非編碼RNA——NEAT1已被證實在多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中具有分化調(diào)控的作用[9-11]。鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中有諸多非編碼RNA、抑癌基因、促癌基因及蛋白因子的參與，但目前關(guān)于NEAT1在鼻咽癌中的作用研究報道甚少，其是否能夠調(diào)節(jié)鼻咽癌細胞的放療敏感性筆者尚不清楚。因此，本研究通過對鼻咽癌組織和細胞株的研究，探討NEAT1對鼻咽癌細胞輻射敏感性的分子機制，為新型靶向藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織標本 48例臨床鼻咽癌組織及對應的癌旁組織來自2018年1月至2019年1月于我院接受手術(shù)治療的鼻咽癌患者，男26例，女22例；年齡36～65歲，中位年齡52歲；病程3～15周，平均病程(7.2±1.2)周；根據(jù)美國癌癥聯(lián)合會(AJCC)中鼻咽癌病理分期：Ⅰ期16例，Ⅱ期15例，Ⅲ期10例，Ⅳ期7例；患者同意本研究并簽署知情同意書，且經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準。

1.2 實驗材料 鼻咽癌細胞株SUNE-1、5-8F、C666-1、CNE-1、CNE-2均購自美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)。siNEAT1及陰性對照siNC穩(wěn)轉(zhuǎn)干擾細胞系、NEAT1、GAPDH及miR-331引物均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計完成。DMEM/F12培養(yǎng)基(D8900)，DMEM培養(yǎng)基(D777)，1640培養(yǎng)基(R6504)， L15培養(yǎng)基(L4386)均購自Sigma；SYBR Green 熒光定量PCR 檢測試劑盒(QPK-201)于TOYOBO采購；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(RG027)采購自碧云天；X射線生物輻照儀購自Thermo；Trizol reagent(9009)采購自TaKaRa；Matrigel基質(zhì)膠(356234)采購自BD。蘇凈Airtech超凈工作臺；SANYO MCO-15AC細胞培養(yǎng)箱；Nikon Ti-U/Ti-s倒置熒光顯微鏡；5810R 型高速離心機；Roche R480實時熒光定量PCR儀。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染 調(diào)整鼻咽癌細胞株SUNE-1細胞株濃度至1×106個/ml，取2 ml接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜，采用Lipofectamine 2000將濃度均為100 nmol/L的siNEAT1和陰性對照轉(zhuǎn)染至細胞，以SUNE-1作為空白對照，得到SUNE-1-siNEAT1及SUNE-1-siNC細胞株。

1.4 qRT-PCR檢測Lnc RNA NEAT1和miR-331的表達 采用Trizol法提取各組細胞總RNA并進行反轉(zhuǎn)錄，按照PrimeScrip反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用SYBR Premix Ex Taq說明書配置PCR反應體系，反應條件為：95℃預變性10min，然后95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 10 s，40 個循環(huán)；95℃ 5 s，60℃ 1 min，95℃ 30 s。U6作為內(nèi)參(上游引物為 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物為 5’AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’)，Lnc RNA NEAT1(上游引物為 5’-ACTGTCTCCCAACCCTTGTA-3’，下游引物為5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’)，miR-331(上游引物為 5’-ACTGTCTCCCAACCCTTGTA-3’，下游引物為5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’)相對表達量用2-ΔΔCT表示。每個樣本獨立重復實驗3 次。

1.5 MTT及平板克隆實驗檢測細胞增殖 細胞SUNE-1、SUNE-1-siNC及SUNE-1-siNEAT1經(jīng)5 Gy電離輻射照射后，按照每孔500～1 000 個密度鋪至96 孔板，輕輕混勻后，置入37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，每孔加MTT溶液20 μl，37℃避光4 h 后，棄掉孔內(nèi)液體，再加DMSO各100 μl，置于37℃搖床上快速振蕩15 min，以便充分溶解結(jié)晶物，最后將96 孔板置于酶標儀上檢測 492 nm 處的OD值。將上述兩種穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞按每孔5×103個密度鋪6孔板繼續(xù)培養(yǎng)，隔周更換新鮮培養(yǎng)液，2周后用考馬斯亮藍染色，在顯微鏡下計數(shù)菌落形成數(shù)量。

1.6 Transwell實驗檢測細胞侵襲 實驗前12 h更換為無血清培養(yǎng)基，細胞SUNE-1、SUNE-1-siNC及SUNE-1-siNEAT1經(jīng)10 Gy電離輻射照射后，將40 μl matrigel基質(zhì)膠鋪于Transwell小室中，消化細胞并用1×PBS清洗2遍，將500 μl完全培養(yǎng)基加入24 孔板，細胞計數(shù)，取5×105細胞重懸，向Transwell小室中加200～250 μl細胞懸液，保證下層完全培養(yǎng)基與Transwell小室間無氣泡。置于培養(yǎng)箱內(nèi)正常培養(yǎng)24 h，加用甲醇配制、PBS 稀釋的0.1%結(jié)晶紫染液500 μl進行染色，室溫避光15 min，PBS 漂洗后用棉棒擦Transwell小室內(nèi)部，倒置晾干，置于倒置熒光顯微鏡下觀察顯穿過膜的細胞并拍照計數(shù)。

1.7 免疫熒光標記 細胞SUNE-1、SUNE-1-siNC及SUNE-1-siNEAT1經(jīng)10 Gy電離輻射照射后，分別于0 h、6 h進行免疫熒光檢測，將細胞貼附于載玻片上，PBS清洗后，4%多聚甲醛固定室溫下固定 15 min，再經(jīng)0.1 Triton X-100室溫通透細胞20 min，2%羊血清室溫封閉1 h，加入γ-H2AX一抗，4℃下孵育過夜，再加入二抗室溫孵育1 h，經(jīng)DAPI核染色后共聚焦顯微鏡拍照并記錄細胞中綠色γ-H2AX foci數(shù)量。

1.8 生物信息學預測和熒光素酶報告基因分析 通過檢索生物信息學網(wǎng)站starBase預測NEAT1與miRNA-331的靶向結(jié)合情況。在此基礎(chǔ)上，用 PCR從大鼠星形膠質(zhì)細胞基因組 DNA中擴增 PI3K的 3’-非翻譯區(qū)(3’-untranslated region，3’-UTR)序列，構(gòu)建至熒光素酶報告基因載體 pGL3(pGL3-miR-331-WT)中，同時構(gòu)建突變型重組質(zhì)粒(pGL3-miR-331-MUT)，將HEK293T 細胞按30%左右密度鋪25孔板，將miRNA-331 mimic及mimic control分別與空載質(zhì)粒及上述質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK293T 細胞。轉(zhuǎn)染后25 h，根據(jù)雙熒光素酶測定試劑盒說明書檢測熒光素酶活性，螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶活性值即為報告基因活性。

1.9 Western blotting檢測 細胞SUNE-1、SUNE-1-siNC及SUNE-1-siNEAT1經(jīng)10 Gy電離輻射照射后培養(yǎng)48 h，加入適量的RIPA裂解液，裂解30 min，12 000/min 4℃離心10min，收集上清，采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，將蛋白樣品和Loading buffer混合，100℃水域變性5 min，然后加入至制備好的SDS-PAGE凝膠(5%濃縮膠，10%分離膠)上樣孔中，每孔25 μl，濃縮膠時調(diào)整電壓為60 V，分離膠電壓為120 V，結(jié)束后取出凝膠，4℃轉(zhuǎn)膜1.5 h，采用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，加入TGF-β、Smad一抗，4℃過夜，TBST洗膜后加入辣根過氧化物標記的羊抗兔IgG，37℃孕育2 h后加入ECL顯影，采用自動凝膠成像系統(tǒng)采集Fig.像，以GAPDH作為內(nèi)參，分析蛋白水平。

2 結(jié)果

2.1 Lnc RNA NEAT1在不同組織及細胞中的表達 RTFQ-qPCR結(jié)果顯示，鼻咽癌組織中 Lnc RNA NEAT1的表達水平高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)； Lnc RNA NEAT1在SUNE-1細胞中表達量最高，與其他細胞株相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。適合使用RNA干擾的方法進行后續(xù)Lnc RNA NEAT1基因功能的研究。見表1、2。

2.2 細胞系構(gòu)建 qRT-PCR結(jié)果顯示SUNE-1組和SUNE-1-siNC組Lnc RNA NEAT1的表達無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，SUNE-1-siNEAT1組細胞中Lnc RNA NEAT1的表達量明顯低于空白對照組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。提示成功構(gòu)建NEAT1沉默細胞系。見表3。

表1 Lnc RNA NEAT1在不同組織中的表達

表2 Lnc RNA NEAT1在不同鼻咽癌細胞系中的表達

表3 Lnc RNA NEAT1在SUNE-1細胞中的表達

2.3 Lnc RNA NEAT1對鼻咽癌細胞株SUNE-1輻射敏感性的影響 MTT實驗結(jié)果顯示，與SUNE-1組和SUNE-1-siNC組相比，SUNE-1-siNEAT1組經(jīng)電離輻照后OD492 nm值明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。平板克隆實驗結(jié)果顯示，電離輻照后，SUNE-1-siNEAT1細胞克隆數(shù)顯著減少(P<0.05)。說明Lnc RNA NEAT1被沉默后，能增強鼻咽癌細胞SUNE-1的輻照敏感性。見表4、5，圖1。

表4 平板克隆實驗Lnc RNA NEAT1對SUN-1輻射敏感性的影響

2.4 Lnc RNA NEAT1對電離輻照誘導的鼻咽癌細胞株SUNE-1侵襲能力的影響 Transwell實驗顯示，與空白對照組和SUNE-1-siNC組比較，電離輻照后，SUNE-1-siNEAT1細胞通過matrigel基質(zhì)膠的數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。該結(jié)果表明沉默lnc RNA NEAT1后，抑制鼻咽癌細胞電離輻射后的侵襲能力。見圖2，表6。

表5 MTT檢測Lnc RNA NEAT1對SUN-1輻射敏感性的影響

圖1 平板克隆實驗Lnc RNA NEAT1對SUN-1輻射敏感性的影響

圖2 Lnc RNA NEAT1對電離輻照誘導的SUNE-1細胞侵襲能力的影響(結(jié)晶紫染色×200)

表6 Lnc RNA NEAT1對電離輻照誘導的SUNE-1細胞侵襲能力的影響

2.5 Lnc RNA NEAT1與miR-331的作用關(guān)系 經(jīng)starbase數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)NEAT1和miR-331之間有互補結(jié)合序列，推測兩者可能具有靶向調(diào)控關(guān)系。雙熒光素酶報告基因結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-331后，野生型NEAT1的熒光素酶活性被抑制(P<0.05)，突變型NEAT1的熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)，說明NEAT1和miR-331具有靶向調(diào)控關(guān)系。見表7，圖3。

表7 熒光素酶報告基因檢測結(jié)果

圖3 熒光素酶報告基因檢測結(jié)果

2.6 Lnc RNA NEAT1對鼻咽癌細胞株SUNE-1電離輻射誘導DNA 損傷的影響 免疫熒光結(jié)果顯示，相比空白對照組SUNE-1和陰性對照組SUNE-1-siNC，SUNE-1-siNEAT1組細胞γ-H2AX的熒光強度更高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。該結(jié)果表明沉默lnc RNA NEAT1后，抑制鼻咽癌細胞電離輻射后的DNA損傷的修復作用。見表8，圖4。

表8 Lnc RNA NEAT1對電離輻射致SUNE-1 DNA損傷的影響

圖4 Lnc RNA NEAT1對電離輻射致SUNE-1 DNA損傷的影響

2.7 miR-331在不同細胞中的表達 qRT-PCR檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)干擾細胞系和空白細胞對照中miR-331結(jié)果表明，lnc RNA ANCR被沉默后，miR-331表達水平顯著上調(diào)(P<0.05)，證實lnc RNA ANCR可以特異性結(jié)合miR-331并發(fā)揮負向調(diào)控作用。見表9。

表9 miR-331在不同細胞中的表達情況

3 討論

鼻咽癌因其發(fā)病位置比較隱蔽，不容易檢查，且早期癥狀復雜，缺少明顯的特征，所以往往被忽視，導致患者治療時已發(fā)生轉(zhuǎn)移。大多數(shù)晚期鼻咽癌患者經(jīng)放射治療后仍會復發(fā)或轉(zhuǎn)移，是治療失敗的主要原因[12,13]，因此研究鼻咽癌的分子機制對于尋找治療靶點具有重要意義。

Lnc RNA NEAT1包含855個核苷酸，位于人類USP46基因上游的4號染色體上，在其基因組2個內(nèi)含子中間分別產(chǎn)生一個miR4449和一個SNORNA26，但最終成熟的轉(zhuǎn)錄本中卻并不包含[14，15]。研究發(fā)現(xiàn)，在成骨細胞分化過程中，NEAT1可結(jié)合EZH2以增加Runx2 基因啟動子區(qū)的H3K27me3，進而抑制Runx2的轉(zhuǎn)錄[16，17]。有研究表明，Lnc RNA NEAT1是一種與癌癥相關(guān)的基因，且在多種腫瘤中表達量顯著升高[18]。與正常組織相比，Lnc RNA NEAT1在鼻咽癌組織中的表達明顯升高，研究證實Lnc RNA NEAT1在鼻咽癌細胞中表達量均高于人鼻黏膜上皮細胞，表明Lnc RNA NEAT1的異常表達與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。羅泳林等[19]發(fā)現(xiàn)Lnc RNA NEAT1在鼻咽癌中表達水平明顯升高，與本研究結(jié)果相符。

有研究表明，乳腺癌細胞中沉默Lnc RNA NEAT1可促進 CDK1激酶與 EZH2 結(jié)合，使EZH2的蘇氨酸Thr-345和Thr-487處磷酸化增加，最終導致EZH2的泛素化降解[20，21]。據(jù)報道，在輻射誘導的癌細胞模型中，Lnc RNA NEAT1的表達水平出現(xiàn)異常升高，提示Lnc RNA NEAT1的表達與癌細胞經(jīng)電離輻射后的應激反應有關(guān)[22-24]。本研究結(jié)果顯示，電離輻射照射后，沉默Lnc RNA NEAT1的鼻咽癌細胞株SUNE-1增殖和遷移能力明顯受到抑制，提示沉默Lnc RNA NEAT1能夠增強鼻咽癌輻射敏感性。電離輻射可引起腫瘤細胞DNA雙鏈斷裂，不能修復的DNA損傷會介導細胞凋亡而被清除，γH2AX作為DNA雙鏈斷裂的標志物，可有效反映DNA損傷程度[25，26]。本研究結(jié)果中，沉默Lnc RNA NEAT1后腫瘤細胞γH2AX表達明顯高于對照組，提示抑制Lnc RNA NEAT1的表達可加劇DNA損傷或降低DNA損傷的修復能力。以上結(jié)果表明，lnc RNA NEAT1在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，有望作為該病的治療及預后的標志因子。

微小RNA(MicroRNA，miRNA) 是存在于真核生物中一類長度為18～25 nt的非編碼單鏈小分子RNA，其作用機制主要是直接結(jié)合在特定的靶信使RNA的3’非轉(zhuǎn)錄區(qū)，促使靶RNA發(fā)生降解或者翻譯被抑制，從而調(diào)控目的基因的表達。越來越多研究發(fā)現(xiàn)，種類繁多的miRNA家族成員與人類多種疾病及腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)[27，28]。miR-331基因位于人類染色體的12q22n上，相關(guān)研究證實，miR-331對前列腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌及宮頸癌均發(fā)揮抑制作用，但在肝癌中促進細胞增殖及轉(zhuǎn)移進而起到促癌作用，在淋巴細胞白血病中，miR-331表達異常且參與細胞增殖及遷移[29]。lnc RNA NEAT1調(diào)控鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展過程中是否有miR-331參與鮮有報道。lnc RNA對不同細胞具有多向調(diào)節(jié)功能，因而在諸多人類疾病中發(fā)揮重要作用，有研究證實了mRNA和lnc RNA之間一種新的調(diào)控機制，即兩者的相互影響跟它們競爭共同的miRNA反應元件有關(guān)，此時lnc RNA可能發(fā)揮了競爭性內(nèi)源性RNA的作用，對miRNA進行吸附并調(diào)控其靶標，從而使轉(zhuǎn)錄后調(diào)控水平進一步增加[30，31]。本研究同時采用starbase數(shù)據(jù)庫對lnc RNA NEAT1的靶基因進行預測，分析發(fā)現(xiàn)lnc RNA NEAT1和 miR-331之間存在一定的結(jié)合位點，由此推測miR-331可作為lnc RNA NEAT1的下游靶基因。此外采用熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR-331與全lnc RNA NEAT1轉(zhuǎn)錄本的結(jié)合能力，發(fā)現(xiàn)兩者能形成一定的互補堿基對，進一步證實了兩者的靶向關(guān)系。RTFQ-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌細胞中沉默lnc RNA NEAT1后，miR-331表達水平顯著上調(diào)，證實lnc RNA NEAT1對miR-331發(fā)揮負向調(diào)控作用。以上結(jié)果表明，在鼻咽癌中l(wèi)nc RNA NEAT1可能通過特異性結(jié)合并抑制miR-331的表達進而發(fā)揮抑癌作用。

綜上所述，lnc RNA NEAT1在鼻咽癌中呈高表達，沉默Lnc RNA NEAT1表達可能通過上調(diào)miR-331水平抑制鼻咽癌細胞增殖、侵襲能力，增加鼻咽癌細胞輻射敏感性。