張英 東麗

乳腺癌是全球第二大常見的惡性腫瘤。據(jù)報道，全球每年約有167萬乳腺癌新增患者，占所有癌癥患者的11.88%[1]。然而，乳腺癌的發(fā)生發(fā)展的機制尚未完全闡明。近年來，隨著分子生物學的快速發(fā)展，基因治療已成為腫瘤研究的熱點，探討與乳腺癌相關(guān)的癌基因或抑癌基因為乳腺癌的臨床診療提供了新的方向[2]。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是一類長度大于200個核苷酸的非編碼RNA。研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA參與調(diào)控包括乳腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3,4]。線粒體RNA處理核糖核酸內(nèi)切酶RNA組分(RMRP)是一種LncRNA，其最早發(fā)現(xiàn)于常染色體隱形遺傳性疾病軟骨發(fā)育不全中[5]。研究證實，RMRP在神經(jīng)母細胞瘤和胃癌等多種惡性腫瘤中表達失調(diào)，沉默RMRP抑制神經(jīng)母細胞瘤細胞的增殖、遷移和侵襲[6,7]。Park等[8]研究發(fā)現(xiàn)，RMRP在乳腺癌患者組織中表達上調(diào)，但RMRP在乳腺癌方發(fā)生發(fā)展中的機制并未完全闡明。因此，本研究通過體外細胞實驗旨在探討RMRP對乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響，并探討其作用機制，以期為臨床乳腺癌的診療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 正常乳腺細胞HBL-100和4種乳腺癌細胞(SK-BR-3、BT-549、MCF-7和MDA-MB-231)購于美國ATCC；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素雙抗溶液購于Hyclone公司；LipofectamineTM 2000相關(guān)轉(zhuǎn)染試劑和TRIzol試劑購于Invitrogen公司；MTT細胞增殖檢測試劑盒和western blot相關(guān)試劑購于碧云天公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購于北京索萊寶公司；si-RMRP、si-con、miR-con、miR-613 mimics、pcDNA-con、pcDNA-RMRP、anti-miR-613、anti-miR-con、WT-RMRP和MUT-RMRP的構(gòu)建和測序均由北京華大基因公司提供；Cyclin D1抗體、Bcl-2抗體、Bax抗體均購于Abcam公司；Cyt-c抗體購于深圳子初生物技術(shù)有限公司；β-actin抗體購于Santa Cruz公司；HRP標記的二抗購于武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和實驗分組 采用含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基于37℃、含5% CO2、濕度飽和的細胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)HBL-100、SK-BR-3、BT-549、MCF-7和MDA-MB-231細胞。細胞轉(zhuǎn)染：按照每孔2×105個細胞的密度將對數(shù)期的MCF-7細胞接種于6孔板，當細胞匯合度約為60%時，用不含血清培養(yǎng)基同步化12 h后進行轉(zhuǎn)染。將si-RMRP或si-con(miR-613 mimics或者miR-con)溶解于Opti-MEM培養(yǎng)基，室溫孵育5 min，同時另取LipofectamineTM 2000加入到Opti-MEM培養(yǎng)基室溫條件孵育5 min，然后將兩者混合后室溫放置20 min，最后將含si-RMRP或si-con(miR-613 mimics或者miR-con)的混合物分別加入到MCF-7細胞中，培養(yǎng)6 h后，更換為DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進行后續(xù)實驗。分別命名為si-RMRP組、si-con組、miR-613組和miR-con組。NC組為正常培養(yǎng)的MCF-7細胞。為進一步證明RMRP是通過調(diào)控miR-613表達進而影響MCF-7細胞的增殖和凋亡，將si-RMRP和anti-miR-613同時轉(zhuǎn)染入MCF-7細胞，檢測MCF-7細胞的增殖和凋亡情況。命名為si-RMRP+anti-miR-con組和si-RMRP+anti-miR-613組。

1.3 qRT-PCR檢測 利用TRIzol試劑分別HBL-100、SK-BR-3、BT-549、MDA-MB-231細胞和各組MCF-7細胞的總RNA。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，并按照說明書以cDNA為模板進行qRT-PCR擴增。用2-ΔΔCt法計算RMRP和miR-613的相對表達量，分別以β-actin和U6為內(nèi)參。引物序列如下：RMRP上游引物5’-ACTCCAAAGTCCGCCAAGA-3’，下游引物5’-TGCGTAACT-AGAGGGAGCTGAC-3’，β-actin上游引物3’-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3’，β-actin下游引物5’-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’，miR-613上游引物5′-AGGAATGTTCCTTCT-3’，下游引物5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’，U6上游引物5’-GATTTCTCCCTCATCGCT-TACAG-3’，下游引物5’-CTGCTTCATGATCGTTGTTGCTTG-3’。

1.4 雙熒光素酶報告基因檢測 利用TargetScan進行靶基因預測發(fā)現(xiàn)，RMRP與miR-613存在連續(xù)結(jié)合位點，猜測miR-613和RMRP存在靶向關(guān)系，并利用雙熒光素酶報告基因檢測實驗進行驗證。構(gòu)建野生型WT-RMRP和突變型MUT-RMRP的RMRP-3’UTR熒光素酶報告基因載體，利用LipofectamineTM 2000將miR-613mimics和miR-con分別與WT-RMRP或MUT-RMRP同時轉(zhuǎn)染入MCF-7細胞，培養(yǎng)48 h后，測定各組細胞的熒光素酶活性。

1.5 MTT法檢測細胞活力 分別取各組對數(shù)生長期細胞，胰酶消化后按照每孔2×103個細胞數(shù)(100 μl)接種于96孔板，培養(yǎng)48 h后加入MTT試劑(20 μl/孔)，孵育4 h后，棄去孔內(nèi)上清液，向每孔加入DMSO試劑(150 μl/孔)，繼續(xù)孵育2 h直至結(jié)晶完全溶解。酶標儀測定490 nm處各孔的OD值。并按照公式計算細胞存活率，細胞存活率=(實驗組OD-空白組OD)/(對照組OD-空白組OD)×100%。

1.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 用不含EDTA的胰蛋白酶消化各組MCF-7細胞，離心收集細胞后用PBS漂洗2次，加入適量的結(jié)合緩沖液重懸細胞，使細胞濃度約為1×106個/ml。每管加入100 μl細胞，再向管中加入5 μl的Annexin V-FITC，室溫避光條件輕輕地混勻，10 min后，加入5 μl的PI，室溫避光條件孵育5 min 后，加入PBS至500 μl，輕輕混勻。在1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測。

1.7 Western blot檢測 采用預冷的RIPA裂解液提取各組MCF-7細胞的總蛋白，用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度。取30 μg蛋白樣品用SDS-PAGE凝膠電泳進行蛋白分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜后，用Western封閉液室溫封閉PVDF膜60 min，Western洗滌液洗膜后，在4℃條件下加入已稀釋的相應的Ⅰ抗搖床孵育過夜，Western洗滌液洗膜后，在室溫條件下加入相應的已稀釋的Ⅱ抗孵育1 h，化學發(fā)光顯色后拍照，用圖像處理軟件分析目的條帶的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA RMRP和miR-613在乳腺癌細胞中的表達 與正常乳腺細胞HBL-100比較，4種乳腺癌細胞中LncRNA RMRP的表達顯著上調(diào)，miR-613的表達顯著下調(diào)(P<0.05)。見表1。

2.2 沉默RMRP對乳腺癌細胞MCF-7增殖和凋亡的影響 與si-con組和NC組比較，si-RMRP組MCF-7細胞RMRP的表達顯著降低(P<0.05)，表明成功構(gòu)建穩(wěn)定沉默RMRP的MCF-7細胞株。與si-con組比較，si-RMRP組MCF-7細胞促增殖蛋白CyclinD1和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達顯著降低，促凋亡蛋白Bax和Cyt-c的表達顯著增加，細胞存活率顯著降低，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見表2，圖1。

表1 qRT-PCR檢測乳腺癌細胞和正常乳腺細胞中LncRNA RMRP和miR-613表達量

表2 LncRNA RMRP對乳腺癌細胞MCF-7增殖和凋亡的影響

圖1 LncRNA RMRP對乳腺癌細胞MCF-7增殖和凋亡的影響研究；A 流式細胞儀檢測細胞凋亡；B Western Blot檢測CyclinD1、Cyt-c、Bax、Bcl-2蛋白的表達

2.3 過表達miR-613對乳腺癌細胞MCF-7增殖和凋亡的影響 與miR-con組和NC組比較，miR-613組MCF-7細胞miR-613的表達水平顯著升高(P<0.05)，表明成功構(gòu)建穩(wěn)定過表達miR-613的MCF-7細胞株。與miR-con組和NC組比較，miR-613組MCF-7細胞促增殖蛋白CyclinD1和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達顯著降低，促凋亡蛋白Bax和Cyt-c的表達顯著增加，細胞存活率顯著降低，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見表3，圖2。

表3 過表達miR-613對乳腺癌細胞MCF-7增殖和凋亡的影響

圖2 Western Blot檢測CyclinD1、Cyt-c、Bax、Bcl-2蛋白的表達

2.4 RMRP靶向miR-613的表達 利用TargetScan進行靶基因預測顯示，RMRP與miR-613存在部分連續(xù)結(jié)合位點，當上調(diào)miR-613表達后，轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-RMRP的3’-UTR的熒光素酶報告基因載體的MCF-7細胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染MUT-RMRP的3’-UTR的熒光素酶報告基因載體的MCF-7細胞的熒光素酶活性無顯著變化(P>0.05)。與si-con組比較，si-RMRP組MCF-7細胞miR-613的表達水平顯著升高；與pcDNA-con組比較，pcDNA-RMRP組MCF-7細胞miR-613的表達水平顯著降低(P<0.05)。見表4、5，圖3。

2.5 抑制miR-613表達可部分逆轉(zhuǎn)沉默RMRP對MCF-7細胞增殖和凋亡的影響 與si-con組比較，si-RMRP組MCF-7細胞RMRP、CyclinD1蛋白及Bcl-2蛋白的表達水平顯著降低(P<0.05)，Cyt-c和Bax蛋白的表達水平顯著升高，細胞存活率顯著降低，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與si-RMRP+anti-miR-con組比較，si-RMRP+anti-miR-613組MCF-7細胞RMRP、CyclinD1蛋白及Bcl-2蛋白的表達水平顯著升高(P<0.05)，Cyt-c和Bax蛋白的表達水平顯著降低(P<0.05)，細胞存活率顯著升高(P<0.05)，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見表6,圖4。

表4 miR-con或LncRNA RMRP與報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染MCF-7細胞后雙熒光素酶活性檢測

表5 qRT-PCR檢測miR-613的表達

圖3 TargetScan對LncRNA RMRP和miR-613結(jié)合進行預測示意圖

表6 miR-613高表達可以部分逆轉(zhuǎn)LncRNA RMRP高表達對MCF-7的增殖和凋亡的影響

圖4 Western Blot檢測CyclinD1、Cyt-c、Bax、Bcl-2蛋白表達

3 討論

研究證實，LncRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[9,10]。Meng等[11]研究發(fā)現(xiàn)RMRP在肺腺癌組織和細胞中的表達明顯上調(diào)，并且RMRP異常表達增強了肺腺癌細胞增殖、集落形成和侵襲能力；Cao等[12]在膀胱癌的研究中闡明，RMRP在膀胱癌組織中也呈高表達，RMRP的表達與患者的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和生存時間密切相關(guān)，RMRP還可通過調(diào)控miR-206表達促進膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲。此外，Wang等[13]研究表明，RMRP在非小細胞肺癌中也具有調(diào)節(jié)功能，沉默RMRP抑制細胞增殖、遷移和侵襲，并誘導G0/G1期細胞周期阻滯，且RMRP對非小細胞肺癌進展的作用是通過抑制miR-1-3p表達實現(xiàn)的。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，與正常乳腺細胞相比，4種乳腺細胞中RMRP的表達顯著上調(diào)，這與Park等[8]的研究結(jié)果相吻合。同時我們發(fā)現(xiàn)沉默RMRP可抑制MCF-7細胞增殖，促進細胞凋亡。此外，我們通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)miR-613是RMRP的潛在靶基因。

miR-613是一種新發(fā)現(xiàn)的在多種惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌基因作用的小RNA。Ding等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-613在胃癌組織中表達下調(diào)，miR-613的低表達與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，且miR-613通過靶向抑制腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達抑制胃癌的發(fā)生發(fā)展；研究表明，上調(diào)miR-613表達可抑制乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲，下調(diào)miR-613則產(chǎn)生相反的作用。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，miR-613在乳腺癌細胞中表達下調(diào)，過表達miR-613可抑制MCF-7細胞增殖，促進MCF-7細胞凋亡，miR-613在乳腺癌中發(fā)揮抑癌基因作用。LncRNA通過調(diào)控miRNA表達發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用已被廣泛報道[15]。Dong等[16]研究發(fā)現(xiàn)，HULC通過靶向miR-613可促進結(jié)腸癌細胞生長；Cai等[17]發(fā)現(xiàn)HOTAIR通過發(fā)揮內(nèi)源性miRNA分子海綿作用抑制miR-613表達促進胰腺癌的發(fā)生發(fā)展；此外，Jiang等[18]通過體內(nèi)實驗證實敲減HOTAIR通過上調(diào)miR-613抑制腫瘤的生長和侵襲，促進細胞凋亡，影響非小細胞肺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。本研究中，我們通過雙熒光素酶報告實驗和Western blot檢測證實，miR-613是RMRP的靶基因，RMRP可負性調(diào)控miR-613的表達。因此，我們猜測RMRP/miR-613分子軸參與對乳腺癌細胞增殖和凋亡的調(diào)控，把si-RMRP和anti-miR-613同時轉(zhuǎn)染入MCF-7細胞進行驗證，發(fā)現(xiàn)抑制miR-613表達可逆轉(zhuǎn)沉默RMRP對MCF-7細胞增殖和凋亡的影響。表明沉默RMRP通過上調(diào)miR-613抑制乳腺癌細胞增殖，促進細胞凋亡，遏制乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。

線粒體作為細胞生命活動的控制中心，在對細胞凋亡的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。其中，Cyt-c從線粒體的釋放是線粒體誘導的細胞凋亡的關(guān)鍵步驟，當細胞接收到Bax蛋白調(diào)控分子信號后，Cyt-c經(jīng)線粒體轉(zhuǎn)換孔釋放到細胞質(zhì)，與凋亡相關(guān)因子1結(jié)合形成多聚體，促進一些列Caspase活化，進而誘導細胞凋亡[19]。Bcl-2則對線粒體誘導的細胞凋亡發(fā)揮負性調(diào)控作用。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)沉默RMRP或過表達miR-613均可抑制Bcl-2蛋白表達，促進Bax和Cyt-c蛋白的表達，抑制miR-613表達可逆轉(zhuǎn)沉默RMRP對Bcl-2、Bax和Cyt-c蛋白表達的影響。提示沉默RMRP通過上調(diào)miR-613對乳腺癌細胞增殖抑制和凋亡促進作用與線粒體誘導的細胞凋亡途徑的激活有關(guān)。

綜上所述，RMRP在乳腺癌細胞中表達上調(diào)，miR-613表達下調(diào)。沉默RMRP通過靶向調(diào)控miR-613表達激活線粒體凋亡途徑進而促進乳腺癌細胞凋亡，抑制細胞增殖。因此，RMRP/miR-613分子軸有望成為乳腺癌的分子診療靶點，本研究的發(fā)現(xiàn)為乳腺癌的臨床診療提供新的思路。