王寧 顧利芬

【摘?要】目的：采用反相高效液相色譜法測(cè)定丁苯酞粗品中同分異構(gòu)體異丁基苯酞的含量。方法：采用RP-HPLC方法進(jìn)行測(cè)定，采用CAPCELL PAK ADME鍵合金剛烷基色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-水（40：60），流速1.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，柱溫30℃，外標(biāo)法。結(jié)果：異丁基苯酞在0.505μg/ml～2.527μg/ml濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好（r=0.9998），回收率為102.0%（n=9），RSD為4.7%。結(jié)論：經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，本方法準(zhǔn)確，簡(jiǎn)便可靠，重復(fù)性好，為進(jìn)一步提高丁苯酞制劑在臨床上使用的安全性提供參考?？勺鳛槎”教幍馁|(zhì)量控制方法之一。

【關(guān)鍵詞】丁苯酞粗品;異丁基苯酞;同分異構(gòu)體;反相高效液相色譜法

【中圖分類號(hào)】R965???【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A????【文章編號(hào)】1672-3783（2020）10-0100-02

Determination of isomer isobutylphthalide in crude butylphthalide by RP-HPLC

WANG Ning??Gulifen

（Suzhou Erye Pharmaceutical Co.， Ltd.?Suzhou 215131）

【Abstract】Objective：The content of isomer isobutylphthalide in crude butylphthalide was determined by RP-HPLC. Methods：RP-HPLC method was used for the determination，a CAPCELL PAK ADME bonded adamantance column was used，the mobile phase consisted of acetonitrile-water（40：60），the flow rate of 1.0ml·min-1，the detection wave length was at 280nm and the column remained at 30℃. Results：The standard curve was in good linearity in the range of 0.505μg/ml～2.527μg/ml，r=0.9998.The average recovery rate was 102.0%（n=9），RSD=4.7%.Conclusion：The method is accurate，simple and reliable，good repeatability.To provide reference for improving the clinical safety of butylphthalide preparation.It can be used as one of the quality control methods for butylphthalide.

【Key words】Butylphthalide crude product;Isobutylphthalide;Isomer ;RP-HPLC

正丁基苯酞（n-butylphthalide，NBP）簡(jiǎn)稱丁苯酞，俗稱芹菜甲素，是芹菜揮發(fā)油的主要成分。丁苯酞具有很強(qiáng)的抗驚厥、抗氣喘、增加血流量等多種藥理活性，是我國(guó)第三個(gè)自主研發(fā)的一類新藥，全球第一個(gè)以“缺血性腦卒中治療”為主要適應(yīng)癥的全新化學(xué)藥物。異丁基苯酞是合成過(guò)程中潛在的副產(chǎn)物，是丁苯酞的同分異構(gòu)體，它們極性相近，通常難以完全分離。為保證制劑在臨床上的用藥安全，需要對(duì)丁苯酞原藥中異丁基苯酞的含量加以控制。

1 儀器與試劑

1.1 儀器美國(guó)Waters2695高效液相色譜儀（Waters e2695分離單元包括四元梯度洗脫的溶劑輸送系統(tǒng)、柱溫箱和自動(dòng)進(jìn)樣器;二極管陣列掃描檢測(cè)器（Waters2489 PDA檢測(cè)器）;色譜工作站（Empower3）），美國(guó)Agilent 1260高效液相色譜儀（包括四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、在線脫氣機(jī)、紫外檢測(cè)器;色譜工作站OpenLab CDS2.4），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司XS3DU（百萬(wàn)分之一）和XS105DU（十萬(wàn)分之一）電子分析天平。

1.2 試藥對(duì)照品異丁基苯酞（蘇州二葉制藥有限公司自標(biāo)批號(hào)S190017），含量為99.27%;對(duì)照品丁苯酞（蘇州二葉制藥有限公司自標(biāo)批號(hào)S190001），含量為99.24%;樣品丁苯酞粗品（蘇州二葉制藥有限公司，批號(hào)XS190419-1-6、0190701、0190801、0190802）;甲醇和乙腈均為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適用性溶液的制備：稱取丁苯酞對(duì)照品和異丁基苯酞對(duì)照品適量，用甲醇溶解并稀釋制成含異丁基苯酞0.01mg/ml，和丁苯酞1mg/ml的溶液。

2.2 對(duì)照品溶液的制備：稱取異丁基苯酞對(duì)照品適量，用甲醇制成含異丁基苯酞1μg/ml的溶液。

2.3 供試品溶液的制備：取本品適量，精密稱定，用甲醇溶解并制成每1ml約含1mg的溶液。

2.4 色譜條件色譜柱：OSAKA SODA CAPCELL PAK ADME，4.6mm×250mm，5μm或效能相當(dāng)?shù)纳V柱;流動(dòng)相：乙腈-水（40：60）;流速1.0ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm;柱溫：30℃;自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣體積：20μl?？瞻兹芤阂?jiàn)圖1;系統(tǒng)適用性溶液見(jiàn)圖2。

2.5?專屬性試驗(yàn) 取同一批樣品適量（批號(hào)XS190419-1-6），在各破壞條件下進(jìn)行破壞，再按“2.4”項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣20μl進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算結(jié)果，結(jié)果見(jiàn)表1。

結(jié)果表明，丁苯酞粗品在堿破壞下較不穩(wěn)定，在各破壞條件下均未檢出異丁基苯酞，不干擾異丁基苯酞的檢測(cè)。

2.6 線性關(guān)系考察 稱取異丁基苯酞對(duì)照品適量，用甲醇稀釋制成約0.5μg/ml、1.0μg/ml、1.5μg/ml、2.0μg/ml、2.5μg/ml的溶液，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，以濃度C為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得線性回歸：Y=11.066X-0.2588，r=0.9998，Y軸截距與100%響應(yīng)值的比值為2.4%。結(jié)果表明異丁基苯酞在0.505μg/ml～2.527μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7 定量限和檢測(cè)限 精密吸取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，用甲醇逐級(jí)稀釋，進(jìn)行測(cè)定;以信噪比（S/N） 10：1時(shí)確定定量限濃度為0.227μg/ml，相當(dāng)于供試品濃度的0.02%，以信噪比（S/N）3：1時(shí)確定檢測(cè)限濃度為0.034μg/ml，相當(dāng)于供試品濃度的0.003%。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品（批號(hào)XS190419-1-6），用甲醇稀釋制成每1ml約含丁苯酞1mg和異丁基苯酞1μg的溶液，平行制備6份加標(biāo)混合溶液，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果樣品中異丁基苯酞的平均含量為0.09%，RSD為5.5%（n=6），最大絕對(duì)差值為0.01%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 中間精密度試驗(yàn) 換人換儀器換日期取同一批樣品（批號(hào)XS190419-1-6），用甲醇稀釋制成每1ml約含丁苯酞1mg和異丁基苯酞1μg的溶液，平行制備6份加標(biāo)混合溶液，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果樣品中異丁基苯酞的日間平均含量為0.09%，日間RSD為4.9%（n=12），日間最大絕對(duì)差值為0.01%，表明本方法中間精密度良好。

2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批樣品（批號(hào)XS190419-1-6），用甲醇稀釋制成每1ml約含丁苯酞1mg和異丁基苯酞1μg的溶液1份，分別在0、2、4、6、8、10、24小時(shí)按“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果樣品中異丁基苯酞峰面積的RSD為0.84%，表明供試品溶液24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.11 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批樣品（批號(hào)XS190419-1-6）約20mg，置20ml量瓶，共9份，3份為一組，分別按照異丁基苯酞限度含有量的50%、100%、200%加入異丁基苯酞對(duì)照品母液，用甲醇溶解并稀釋制備成供試溶液，每份溶液按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率（n=9）為102.0%，RSD為4.7%。

2.12 樣品測(cè)定 取3批丁苯酞粗品，分別按“2.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，再按“2.4”項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣20μl進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算結(jié)果，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.13 結(jié)論

通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果表明該方法精密度、準(zhǔn)確度高，線性關(guān)系良好，能滿足丁苯酞粗品中異丁基苯酞含量測(cè)定的要求。

3 討論

3.1 異丁基苯酞的控制策略

異丁基苯酞，是制備丁苯酞過(guò)程中可能產(chǎn)生的副產(chǎn)物。它是由于起始物料正丁基氯化鎂可能含有少量的異丁基基氯化鎂，與鄰羧基苯甲醛反應(yīng)就會(huì)生成異丁基苯酞，反應(yīng)式如下：

本公司擬定的質(zhì)量控制策略是控制在丁苯酞粗品中雜質(zhì)異丁基苯酞不得過(guò)0.1%，并且對(duì)多批次樣品進(jìn)行測(cè)定，符合要求。雜質(zhì)異丁基苯酞屬于工藝雜質(zhì)，從粗品到成品的制備過(guò)程中不會(huì)在產(chǎn)生，因此，只要控制了粗品中的異丁基苯酞含量，就可以控制住丁苯酞成品中異丁基苯酞的含量。

3.2 分離度試驗(yàn)

我們嘗試了CAPCELL PAK PFP五氟苯基色譜柱未能分離丁苯酞和異丁基苯酞，使用CAPCELL PAK C18 MG和CAPCELL PAK ADME色譜柱均能夠得到丁苯酞和異丁基苯酞良好的分離結(jié)果，對(duì)比之下，ADME色譜柱可在相對(duì)較短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)更好地分離結(jié)果。我們也嘗試柱溫由40℃降低到30℃，兩化合物的保留時(shí)間延長(zhǎng)了約4分鐘，但分離度由1.6提高至1.7;同時(shí)在30℃條件下，嘗試了在流動(dòng)相中添加了100mM磷酸二氫銨，發(fā)現(xiàn)分離度為1.6，并無(wú)明顯改善，添加緩沖鹽對(duì)分離度無(wú)明顯影響。最終得出“2.4”項(xiàng)下的色譜條件是最佳的檢測(cè)方法。

3.3 結(jié)論：本法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可作為丁苯酞質(zhì)量控制的方法。

參考文獻(xiàn)

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