成蒙蒙，馮正平，楊彥玲*

(1.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西 延安 716000；2.陜西師范大學(xué)，陜西 西安 710119)

神經(jīng)損傷是導(dǎo)致阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病等神經(jīng)退行性疾病及脊髓損傷、腦缺血、腦缺血再灌注損傷等病理性疾病的重要原因[1]。氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡是神經(jīng)損傷的關(guān)鍵因素。

PC12細(xì)胞是常見的研究神經(jīng)生理和神經(jīng)藥理的細(xì)胞之一[2]，過(guò)氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)細(xì)胞損傷是目前研究神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷常見的細(xì)胞模型[3]。通過(guò)該模型，可以有效的探討阿爾茲海默癥(AD)[4]、帕金森病(PD)[5]、脊髓損傷[6]和腦缺血[7]發(fā)病機(jī)制及治療手段。

去甲烏藥堿是中藥附子的提取物，現(xiàn)代研究表明，去甲烏藥堿具有正心肌、強(qiáng)心[8]、舒張支氣管[9]、免疫調(diào)節(jié)[10]、抗炎[11]、抗氧化、抗凋亡[12]等作用。臨床上主要用于強(qiáng)心和治療心律失常。目前研究表明去甲烏藥堿能有效保護(hù)由腦缺血再灌注誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷[13]，同時(shí)發(fā)現(xiàn)去甲烏藥堿能有效清除氧自由基活性[14]。本研究利用過(guò)氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)PC12細(xì)胞建立氧化應(yīng)激損傷模型，探討去甲烏藥堿對(duì)氧化應(yīng)激的保護(hù)效果及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

PC12細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，去甲烏藥堿鹽酸鹽(上海源葉生物公司)，RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青鏈霉素(雙抗)、谷氨酰胺(GLUMax)、二甲基亞砜(DMSO)均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，H2O2(陜西欣通化工公司)，PBS緩沖液(北京索萊寶公司)，丙二醛試劑盒(MDA)、超氧化物歧化酶試劑盒(SOD)均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，TUNEL試劑盒(ROCH公司)，Caspase3、Bax、Bcl-2及Tubulin一抗和HRP標(biāo)記的兔二抗(武漢三鷹公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PC12細(xì)胞培養(yǎng) 將PC12細(xì)胞培養(yǎng)于CO2恒溫(37℃)飽和濕度的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)液為含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素、1%谷氨酰胺的RPMI 1640培養(yǎng)基，每2～3 d換培養(yǎng)液，消化采用0.25%的胰蛋白酶，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 分組及處理 實(shí)驗(yàn)共設(shè)3組，對(duì)照組、H2O2組、去甲烏藥堿組，去甲烏藥堿組預(yù)先給予50 μM的去甲烏藥堿24 h，接著H2O2組和去甲烏藥堿組分別給予100 μM的H2O2處理6 h，對(duì)照組給予等體積培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.3 細(xì)胞存活率測(cè)定 用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞存活率，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞，按105個(gè)細(xì)胞/mL接種至96孔板，培養(yǎng)24 h后，棄去上清，對(duì)照組加100 μL培養(yǎng)基，H2O2處理組分別加等體積的終濃度為10、50、100和200 μM的H2O2的培養(yǎng)基溶液，去甲烏藥堿處理組分別加等體積的終濃度為5、10、50、和100 μM的去甲烏藥堿培養(yǎng)基溶液，每組做9個(gè)平行副孔。分別繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔再加入10 μL的CCK8繼續(xù)孵育1 h后，用酶標(biāo)儀對(duì)各孔在波長(zhǎng)450 nm處吸光度值進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 流式檢測(cè)ROS 在六孔板中采用1.2.3項(xiàng)下方法處理PC12細(xì)胞后，用0.25%的胰蛋白酶消化，4000 r/min，離心5 min，收集細(xì)胞，加PBS制成細(xì)胞懸液，參照ROS試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行樣品制備，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.5 MDA、SOD測(cè)定 在六孔板中采用1.2.3項(xiàng)下方法處理PC12細(xì)胞后，收集培養(yǎng)液備用，用無(wú)菌PBS洗3遍，用0.25%的胰蛋白酶消化，4000 r/min，離心5 min，收集細(xì)胞，用1 mL PBS洗1遍，然后加細(xì)胞裂解液RIPA裂解細(xì)胞，低溫(4℃)離心10 min，收集上清液，參照南京建成生物工程研究所提供的相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MDA含量及SOD活性。

1.2.6 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)加入細(xì)胞爬片，按1.2.3項(xiàng)下方法處理PC12細(xì)胞后。將各組爬片于4%多聚甲醛固定，以Streptavidin工作液覆蓋孵育樣品，DAPI復(fù)染封片。200倍顯微鏡下觀察，細(xì)胞核呈黃色為陽(yáng)性的凋亡細(xì)胞。

1.2.7 Western blot檢測(cè)細(xì)胞Bax、Bcl-2及Caspase3蛋白表達(dá) 在六孔板中采用1.2.3項(xiàng)下方法處理PC12細(xì)胞后，收集細(xì)胞，加RIPA冰上裂解，收集上清液，即是總蛋白，Bradforrd試劑盒測(cè)定總蛋白濃度，蛋白變性，電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫孵育2 h進(jìn)行封閉，一抗溶液，稀釋度皆為(1∶1000)4℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育1 h，稀釋度為(1∶2000)，顯色液A∶B液按1∶1顯色，凝膠成像系統(tǒng)中曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad 5.0統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)單因素方差分析(One-wayANOVA)表示，組間比較采用Tukey’s Multiple Comparisons Test，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 去甲烏藥堿對(duì)H2O2引起的PC12細(xì)胞活力的影響

不同濃度的H2O2(10，50，100，200 μM)處理PC12細(xì)胞6 h后，CCK8結(jié)果顯示(見圖1A)，與對(duì)照組比較，濃度為100和200 μM的H2O2能顯著降低PC12細(xì)胞的活性(P<0.001)；處理12 h后，50 μM濃度的H2O2也能顯著降低PC12細(xì)胞的活性(P<0.001)；濃度為10 μM的H2O2在處理24 h后也出現(xiàn)了降低PC12細(xì)胞的活性的現(xiàn)象(P<0.001)。因此，本研究中選擇100 μM的H2O2處理PC12細(xì)胞6 h為造模參數(shù)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

PC12細(xì)胞用不同濃度的去甲烏藥堿(5，10，50，100 μM)處理24 h后，結(jié)果顯示(見圖1B),不同濃度的去甲烏藥堿對(duì)細(xì)胞沒(méi)有顯著性差異，表明在100 μM以下的去甲烏藥堿對(duì)PC12細(xì)胞沒(méi)有明顯影響。

PC12細(xì)胞用不同濃度的去甲烏藥堿(5，10，50，100 μM)預(yù)處理24 h后，用100 μM的H2O2處理PC12細(xì)胞6h。結(jié)果顯示(見圖1C)，濃度為10，50和100 μM的去甲烏藥堿能顯著升高PC12細(xì)胞的活力(P<0.05)，然而，濃度為100 μM的去甲烏藥堿預(yù)處理后，細(xì)胞活力出現(xiàn)相對(duì)降低的趨勢(shì)。同時(shí)，如(見圖1D)顯示，濃度為50 μM的去甲烏藥堿預(yù)處理后PC12細(xì)胞在Control+Hig組和H2O2+Hig組均呈現(xiàn)較好的細(xì)胞狀態(tài)。因此，本研究中選擇50 μM的去甲烏藥堿預(yù)處理PC12細(xì)胞為給藥參數(shù)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 去甲烏藥堿對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中ROS、MDA及SOD活性的影響

采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROS水平，結(jié)果顯示(見圖2A)，與對(duì)照組比較，H2O2組峰值右移，說(shuō)明H2O2處理能誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中ROS水平增加。然而，與H2O2組比較，去甲烏藥堿預(yù)處理后峰值左移，說(shuō)明去甲烏藥堿可以減少H2O2誘導(dǎo)ROS水平增加。

采用TBA法檢測(cè)細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化程度，即MDA的含量，結(jié)果顯示(見圖2B)，與對(duì)照組比較，H2O2組MDA含量顯著升高(P<0.001)，與H2O2組比較，去甲烏藥堿組MDA含量降低(P<0.01)，說(shuō)明H2O2增加了MDA含量，去甲烏藥堿可以減少H2O2誘導(dǎo)MDA含量的升高。

采用WST法檢測(cè)超氧化物歧化酶(SOD)的活性，結(jié)果顯示(見圖2C)與對(duì)照組比較，H2O2組SOD活性顯著降低(P<0.05)，與H2O2組比較，去甲烏藥堿組SOD活性顯著升高(P<0.05)，說(shuō)明H2O2減少了MDA含量，去甲烏藥堿可以增加H2O2誘導(dǎo)SOD活性的減少。

2.3 去甲烏藥堿對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的影響

采用Tunel/DAPI熒光雙染來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果見封二圖3A，藍(lán)色熒光為DAPI陽(yáng)性細(xì)胞，綠色為Tunel陽(yáng)性細(xì)胞，Merge后黃色為凋亡細(xì)胞。Tunel/DAPI雙染的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果見封二圖3B，與對(duì)照組比較，H2O2組細(xì)胞凋亡率顯著提高(P<0.01)；與H2O2組比較，去甲烏藥堿組細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。

2.4 去甲烏藥堿對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中Caspase3、Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

采用Western blot法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白，即Caspase3、Bax及Bcl-2蛋白，結(jié)果見圖4，與對(duì)照組比較，H2O2組Caspase3、Bax/Bcl-2表達(dá)量增加，與H2O2組比較，去甲烏藥堿組中Caspase3、Bax/Bcl-2表達(dá)量顯著減少。

3 討論

神經(jīng)系統(tǒng)受到外傷，缺氧缺血及病理性有害刺激時(shí)，誘導(dǎo)氧自由基如ROS的大量生成，可能通過(guò)破壞脂質(zhì)過(guò)氧化和共價(jià)鍵引起神經(jīng)細(xì)胞的損傷，凋亡，進(jìn)而誘發(fā)或加重疾病的進(jìn)程。自由基清除劑，例如SOD和GSH，可以清除過(guò)量的氧自由基，有效保護(hù)細(xì)胞免受損傷。本研究中，與對(duì)照組比較，100 μMH2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞6 h后，ROS活性顯著升高(P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.001)。表明H2O2誘導(dǎo)PC12發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化。然而，50 μM去甲烏藥堿預(yù)處理PC12細(xì)胞2 h后，顯著降低MDA含量(P<0.05)，ROS活性(P<0.05)，并增加SOD活性(P<0.05)。暗示去甲烏藥堿可以降低H2O2誘導(dǎo)的PC12的脂質(zhì)過(guò)氧化和提高自由基清除能力。學(xué)者在大鼠原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞[11]、C6細(xì)胞[12]中也得到類似結(jié)果。

過(guò)量的氧化應(yīng)激可以引起細(xì)胞凋亡。本研究也證實(shí)去甲烏藥堿預(yù)處理后能明顯提高PC12的活性(P<0.05)，同時(shí)Tunel染色也進(jìn)一步驗(yàn)證其能有效保護(hù)PC12細(xì)胞。凋亡途徑又分為兩種，一是細(xì)胞外途徑即死亡受體通路(或腫瘤壞死因子通路)，通過(guò)細(xì)胞表面的死亡受體與其相應(yīng)的配體(如Fas和TNFα)結(jié)合導(dǎo)致caspase-8、10激活，以至激活caspase-3、6、7[15]。另一途徑是細(xì)胞內(nèi)途徑即為線粒體依賴的凋亡途徑，各種凋亡誘導(dǎo)信號(hào)，特別是氧化應(yīng)激和DNA損傷，直接或者間接改變線粒體膜通透性，導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放入胞漿，作用于caspase-9以至下游caspase-3[16]。兩途徑均可使caspase-3激活，caspase-3是通路樞紐,活化的caspase-3將被剪切成多個(gè)片段，這些剪切片段可以導(dǎo)致DNA的斷裂和細(xì)胞凋亡的一系列特征的形成。H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞發(fā)生凋亡,即氧化應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，啟動(dòng)了第二條凋亡途徑，Bcl-2家族在線粒體參與的凋亡途徑中起重要的調(diào)控作用，而caspase-3又是兩條途徑的樞紐，因此我們檢測(cè)了這幾個(gè)標(biāo)志性蛋白bax、Bcl-2和Caspase3。有研究證實(shí)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中Caspase3活性提高，Bax表達(dá)量上調(diào)，Bcl-2表達(dá)量下調(diào)[17]。本研究結(jié)果表明，去甲烏藥堿能預(yù)處理后顯著上調(diào)Bcl-2表達(dá)，下調(diào)Caspase3和Bax表達(dá)。表明去甲烏藥堿可能通過(guò)激活Bcl-2蛋白活性，進(jìn)而抑制Caspase3的活性，最終抑制H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞發(fā)生凋亡。

因此，去甲烏藥堿能夠抑制H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷，與去甲烏藥堿的抗氧化及抗細(xì)胞凋亡有關(guān)，但其具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。