張 科，張 攀，逯瑞娟

(濮陽市人民醫(yī)院，1.放療科；2.核醫(yī)學(xué)科；3.心理咨詢科，河南 濮陽 457000)

腎細胞癌是僅次于前列腺癌和膀胱癌的第三大泌尿外科腫瘤，腎細胞癌占成人惡性腫瘤的3%左右[1]。腎細胞癌分為不同的病理亞型，包括腎透明細胞癌和轉(zhuǎn)移性腎癌，其中腎透明細胞癌占70%至80%[2]。由于腎透明細胞癌對化學(xué)療法和放射療法的高抵抗力，局部腎透明細胞癌患者的主要治療仍是根治性手術(shù)切除[3-4]。雖然腎切除術(shù)是腎透明細胞癌患者的治愈方法，但大約30%的患者會在病程中復(fù)發(fā)[5]。分子探索可能會幫助臨床醫(yī)生根據(jù)風(fēng)險分類通過獲取生物標(biāo)志物來預(yù)測復(fù)發(fā)，從而準(zhǔn)確地為腎透明細胞癌患者制定治療決策[6]。因此，探究新的分子機制對診斷腎透明細胞癌具有重要的意義。

miRNA是一類小的內(nèi)源性非編碼功能性RNA，普遍存在于大多數(shù)真核生物中[7]。miRNA和mRNA之間的相互作用形成了一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)著眾多的細胞過程，包括對先天免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)以及對組織分化、細胞凋亡、細胞增殖、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和器官發(fā)育的調(diào)節(jié)[8]。大量研究表明，miRNA的異常表達與癌癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[9]。例如，miR-21，miR-503和miR-224在內(nèi)的幾種miRNA與癌患者的預(yù)后密切相關(guān)[10-12]。其中miR-155-5p也是一種重要的腫瘤調(diào)控因子。例如miR-155通過靶向SOCS1調(diào)控STAT3信號通路影響胰腺癌細胞的侵襲和遷移[13]，通過靶向ZDHHC2抑制鼻咽癌中的細胞遷移[14]。在肝細胞癌中，miR-155-5p通過靶向CTHRC1和調(diào)節(jié)GSK-3β參與Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)來調(diào)節(jié)肝細胞癌惡性行為[15]。在結(jié)腸癌中，miR-155-5p表達顯著上調(diào)，與結(jié)腸癌患者的預(yù)后相關(guān)[16]。但是對于miR-155-5p在腎透明細胞癌中的研究較少，其分子機制有待于進一步探究。

Wnt信號通路是高度保守的細胞間信號傳導(dǎo)級聯(lián)，是各種細胞過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[17]。Wnt信號通路包含Wnt蛋白、胞質(zhì)蛋白(例如Dishevelled，Axin，糖原合酶激3(GSK3)、糖蛋白、APC和轉(zhuǎn)錄因子，例如β-catenin，T細胞因子/淋巴增強因子(TCF/LEF)[18-19]。Wnt信號輸出的特異性主要是通過多種Wnt配體和受體的差異表達來實現(xiàn)的，這些Wnt配體和受體具有重疊但非冗余的功能[20]。大量研究發(fā)現(xiàn)Wnt信號通路中組分的突變與多種癌癥有關(guān)。在小鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤模型中，持續(xù)的內(nèi)皮Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)可能導(dǎo)致血管生成減少[21]。Wnt信號通路可以調(diào)節(jié)腫瘤的進展，從而操縱Wnt途徑的分子并抑制惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長[22-23]。然而，與其它癌癥相比Wnt信號通路對腎透明細胞癌生物學(xué)功能的影響研究很少。

本文探究了miR-155-5p與Wnt信號通路作用的分子機制，并探索了miR-155-5p和Wnt信號通路對腎透明細胞癌行為的影響。希望這項研究可以為診斷腎透明細胞癌提供足夠的信息，并進一步為腎透明細胞癌患者提供另一種靶向治療方法。

1 材料與方法

1.1 生信分析

從TCGA下載腎透明細胞癌(TCGA-KIRC)的miRNA成熟體表達數(shù)據(jù)并分析得出miR-155-5p表達量數(shù)據(jù)。利用GSEA軟件對miR-155-5p進行通路富集分析。

1.2 細胞培養(yǎng)

人腎透明細胞癌細胞系786-0(BNCC338472)、CAKI-1(BNCC100682)、CAKI-2(BNCC101647)、A498(BNCC338630)和人腎小管上皮細胞系HK-2(BNCC338012)均購自北納生物。將細胞系放在含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基(PANBiotech，Aidenbach，Germany)中培養(yǎng)，且放置于37°C下5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染

miR-155-5pmimics及其陰性對照均購自RiboBioCo.，Ltd.(中國，廣州)。根據(jù)Lipofectamine 2000 Reagent(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)的說明書進行細胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后將細胞放置于37°C下5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24～48 h后進行后續(xù)實驗。

1.4 實時熒光定量PCR檢測

利用TRIzol試劑(Life Technologies，Grand Island，NY，USA)從細胞中提取總RNA。采用紫外可見分光光度計(Thermo Scientific，MA，USA)測量260和280 nm處的吸光度，以確定總RNA的質(zhì)量并調(diào)整RNA的濃度。miRNA使用M-MLV Reverse Transcriptase Kit(Promega，USA)反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Green qPCR Super MixKit(Invitrogen，USA)進行定量PCR實驗。其中miR-155-5p以U6為內(nèi)參，引物序列如表1。結(jié)果用2-ΔΔCt值來比較對照組和實驗組miRNA相對表達量，實驗重復(fù)3次。

表1 qRT-PCR引物列表

1.5 Western blot實驗

用RIPA裂解液(R0010，Solarbio)提取細胞中的總蛋白，冰上孵育30 min，12000 r/min，4℃離心10 min，去上清液。使用BCA試劑盒(23225，Pierce)測定每個樣品的蛋白濃度。高溫變形后使用SDS-PAGE凝膠(P0012A，碧云天生物技術(shù)研究所，上海，中國)將蛋白質(zhì)從樣品緩沖液中分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜(ISEQ00010，Millipore，Billerica，MA，USA)上，電壓110 V，轉(zhuǎn)膜2 h，含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉PVDF膜2 h。棄去封閉液，TBST洗一次，加入一抗。本文的一抗有兔抗β-catenin(1∶4000，ab6302，Abcam，China)、GSK-3β(1：5000，ab32391，Abcam，China)、p-GSK-3β(1∶5000，ab131097，Abcam，China)和GAPDH(1∶2500，ab9485，Abcam，China)。然后與二抗山羊抗兔IgG(1∶5000，ab6721，Abcam，China)在室溫下?lián)u床孵育2 h，TBST洗膜3次，每次5min。使用增強的化學(xué)發(fā)光試劑盒(GEHealthcare，Chicago，IL，USA)檢測蛋白質(zhì)信號。

1.6 細胞增殖實驗

利用MTT實驗檢測細胞增殖能力。將細胞接種到96孔板中，在37℃下培養(yǎng)不同時間段(24 h、48 h、72 h、96 h)。然后，將含有0.5 mg/mL MTT(SigmaAldrich，St.Louis，Mo，USA)的100 μL全培養(yǎng)基添加到每個孔中，并繼續(xù)培養(yǎng)4 h。添加150 μL DMSO溶解液后孵育過夜。利用酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀(Vircell，Spain)，在450 nm波長下測定各孔光吸收值。各組實驗均重復(fù)三次。

1.7 細胞劃痕實驗

不同細胞處理48 h后，收集細胞接種于6孔板中，細胞密度為1×105個/孔。當(dāng)細胞融合率達到90%時，用200 μL的移液管尖端輕輕刮擦穿過孔中心的單層。加入新鮮培養(yǎng)基，細胞再生長24 h，后用顯微鏡觀察劃痕并拍照以分析細胞遷移情況。分別在0 h和24 h后用顯微鏡觀察劃痕距離并拍照，實驗重復(fù)3次。

1.8 細胞侵襲實驗

細胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集細胞制備細胞懸液。分別將各處理組細胞的濃度調(diào)整至5×104個細胞/mL懸液接種于Transwell(8 μmpores，BD Biosciences，USA)的上室內(nèi)，下室加600～800 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，在37°C下，用5%的CO2將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中。孵育48 h后，用棉簽輕輕擦拭根尖室中未穿透的細胞。將膜固定在95%乙醇中15～20 min，用PBS沖洗2遍，然后用1%結(jié)晶紫染色10 min，用PBS再次沖洗，并在顯微鏡下拍照觀察。實驗重復(fù)三次。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22(IBM Corp.，Armonk，NY，USA)對不同組的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，兩組間比較為t檢驗。P<0.05為差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-155-5p在腎透明細胞癌細胞中高表達

首先，利用生物信息學(xué)手段分析了TCGA數(shù)據(jù)庫中腎透明細胞癌患者miR-155-5p的表達量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-155-5p在腎透明細胞癌中呈現(xiàn)極顯著的高表達(見圖1A)。然后，利用qRT-PCR檢測腎透明細胞癌細胞系786-0、CAKI-1、CAKI-2、A498和人腎小管上皮細胞系HK-2中miR-155-5p的表達，結(jié)果顯示與人腎小管上皮細胞相比，腎透明細胞癌細胞系中miR-155-5p的表達水平顯著上調(diào)(見圖1B)。之后，選擇腎透明細胞癌細胞系786-0和CAKI-1進行后面的功能實驗。

2.2 過表達miR-155-5p促進腎透明細胞癌細胞增殖、遷移和侵襲

為了檢測miR-155-5p對腎透明細胞癌細胞的生物學(xué)功能，我們過表達了腎透明細胞癌細胞中的miR-155-5p。首先，通過qRT-PCR檢測空白組和過表達miR-155-5p組中的miR-155-5p表達情況，發(fā)現(xiàn)腎透明細胞癌細胞中過表達miR-155-5p后miR-155-5p的表達量明顯升高(見圖2A)。之后利用MTT實驗檢測各組細胞的增殖情況，結(jié)果表明，相比于對照組過表達miR-155-5p后腎透明細胞癌細胞增殖能力更強(見圖2B)。通過細胞劃痕實驗檢測腎透明細胞癌細胞的遷移能力，結(jié)果顯示過表達miR-155-5p后腎透明細胞癌細胞的遷移能力明顯高于對照組(見圖2C)。同樣，利用Transwell實驗檢測細胞的侵襲能力，我們發(fā)現(xiàn)腎透明細胞癌細胞系786-0和CAKI-1中過表達miR-155-5p后，細胞的遷移能力與對照相比顯著上調(diào)(見圖2D)。這些實驗結(jié)果表明，過表達miR-155-5p會促進腎透明細胞癌細胞增殖、遷移和侵襲。

2.3 miR-155-5p通過調(diào)控Wnt信號通路促進腎透明細胞癌細胞的增殖與轉(zhuǎn)移

為了進一步研究miR-155-5p的下游調(diào)控機制，我們首先通過生信分析對miR-155-5p進行GSEA通路富集分析，發(fā)現(xiàn)miR-155-5p顯著富集在Wnt信號通路上(見圖3A)。然后通過過表達腎透明細胞癌細胞系786-0和CAKI-1中的miR-155-5p或添加Wnt信號通路抑制劑來探究miR-155-5p與Wnt信號通路的相關(guān)性。首先，利用WB檢測不同處理組Wnt相關(guān)蛋白的磷酸化水平及蛋白表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)786-0和CAKI-1細胞中過表達miR-155-5p后Wnt相關(guān)蛋白β-catenin蛋白水平以及磷酸化GSK-3β蛋白水平顯著上調(diào)，GSK-3β蛋白水平無顯著變化，而同時加入抑制劑后會減弱過表達miR-155-5p對磷酸化GSK-3β蛋白以及β-catenin蛋白的促進作用(見圖3B)。然后利用MTT實驗檢測各組細胞增殖情況，結(jié)果表明，過表達miR-155-5p會顯著增強癌細胞的生存活性，但同時加入蛋白抑制劑后腎透明細胞癌細胞的生存活性與單獨過表達miR-155-5p相比下調(diào)，并與對照組無明顯差異(見圖3C)。通過細胞劃痕實驗分析發(fā)現(xiàn)過表達miR-155-5p可以促進癌細胞的遷移能力，但同時加入蛋白抑制劑后癌細胞的遷移能力降低與對照組沒有顯著差異(見圖3D)。同樣，利用Transwell實驗檢測細胞的侵襲能力，我們發(fā)現(xiàn)單獨過表達miR-155-5p后癌細胞的侵襲能力顯著上 調(diào)，但同時加入蛋白抑制劑后會使過表達miR-155-5p對細胞遷移能力的促進效果減弱(見圖3E)。這些實驗結(jié)果表明miR-155-5p可以通過調(diào)控Wnt信號通路促進腎透明細胞癌細胞的增殖與轉(zhuǎn)移。

3 討論

近三分之一的腎透明細胞癌患者在初診時已被診斷出有轉(zhuǎn)移[24]。此外，約40%的腎透明細胞癌患者在短期緩解接受根治性切除手術(shù)后復(fù)發(fā)或發(fā)生轉(zhuǎn)移[25]。因此，有必要探究腎透明細胞癌進展中潛在的分子機制，并開發(fā)更有效的靶向治療方法。研究表明，miRNA可以充當(dāng)腫瘤抑制因子或致癌基因，以驅(qū)動腎透明細胞癌的發(fā)生和發(fā)展[26]。其中miR-155-5p在腫瘤的發(fā)展發(fā)生中也是一種重要的miRNA。例如，He，等[27]人發(fā)現(xiàn)miR-155通過靶向HDAC2來抑制ErbB2的轉(zhuǎn)錄從而誘導(dǎo)人乳腺上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化。Ji，等[28]的研究顯示，miR-155在腎透明細胞癌中過表達并且通過靶向FOXO3a促進腫瘤的生長。這與我們的研究結(jié)果一致。此外，Li，等[29]人研究發(fā)現(xiàn)過表達miR-155-5p促進了宮頸癌細胞的增殖，遷移和侵襲。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在腎透明細胞癌細胞中，miR-155-5p呈顯著性高表達，并且過表達miR-155-5p促進腎透明細胞癌細胞增殖、遷移和侵襲。該結(jié)果表明，在腎透明細胞癌細胞中miR-155-5p發(fā)揮促癌基因的作用，與之前研究一致。

Wnt信號通路具有細胞極性，可以調(diào)控細胞的生物學(xué)功能[30]。許多研究表明Wnt信號傳導(dǎo)的失調(diào)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著重要的關(guān)系。Wnt信號的觸發(fā)可能阻止GSK-3β和β-catenin等蛋白的活化和穩(wěn)定，這與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[31]。Lv，等[32]人研究發(fā)現(xiàn)miR-31調(diào)節(jié)多種信號通路，包括Prlr/Stat5、TGFβ和Wnt/β-catenin，從而調(diào)控乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。此外，Hirata，等[33]人發(fā)現(xiàn)腎癌中Wnt信號通路蛋白DKK1的表達在表觀遺傳學(xué)上是沉默的，它的再表達誘導(dǎo)腎癌細胞凋亡和細胞停滯周期。Chen，等[15]人的研究表明在肝癌細胞中miR-155-5p通過靶向CTHRC1調(diào)控GSK-3β相關(guān)的Wnt/β-catenin信號通路抑制細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，并促進細胞凋亡。在腎癌細胞中，Chen，等[34]人發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-543后β-catenin的蛋白水平和GSK-3β的磷酸化蛋白水平明顯升高并且過表達miR-543促進腎癌細胞的增殖，遷移和侵襲。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)過表達miR-155-5p促進Wnt信號通路蛋白磷酸化水平，同時加入通道蛋白抑制劑后能降低過表達miR-155-5p對Wnt信號通路蛋白磷酸化表達的促進效果。通過功能實驗發(fā)現(xiàn)miR-155-5p可以通過調(diào)控Wnt信號通路促進腎透明細胞癌細胞的增殖與轉(zhuǎn)移。說明Wnt信號通路在腎透明細胞癌的生長過程中也同樣發(fā)揮重要作用。

綜上所述，本實驗證明了過表達miR-155-5p促進腎透明細胞癌細胞的增殖、遷移和侵襲。此外我們驗證了腎透明細胞癌細胞中miR-155-5p與Wnt信號通路的關(guān)系，而這些實驗結(jié)果暗示了miR-155-5p可能通過調(diào)控Wnt信號通路來調(diào)節(jié)腎透明細胞癌細胞的生物學(xué)功能。這一結(jié)果使人們更為深入地了解了miR-155-5p在腎透明細胞癌中的作用機制，也為腎透明細胞癌找到新的靶向治療途徑。