葛金濤，王江英，趙文靜，邵小斌，朱朋波，湯雪燕，孫明偉，劉興滿

(連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇 連云港 222000)

為了適應(yīng)復(fù)雜的外界環(huán)境，植物會通過改變器官結(jié)構(gòu)來獲取更大的生存空間，其中根系結(jié)構(gòu)的可變差異尤為顯著[1]。根據(jù)發(fā)育時期不同，根系產(chǎn)生了主根、側(cè)根和不定根[2]。為適應(yīng)不同的生長環(huán)境，產(chǎn)生了土培根系、水培根系和氣生根系的差異[3-4]。植株感受外界環(huán)境刺激產(chǎn)生生物學(xué)信號，進(jìn)而導(dǎo)致一系列激素含量產(chǎn)生變化，根系結(jié)構(gòu)隨之發(fā)生改變[5-6]。影響根系結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的因素包括外源植物激素、鹽脅迫、水脅迫、根際微生物侵染、蟲害侵襲和營養(yǎng)元素等方面[7-8]。其中，生長素被認(rèn)為是植物根系發(fā)育的最重要的調(diào)節(jié)因子之一[9]，近年來脫落酸在逆境條件下影響根系發(fā)育的研究也逐漸增多[10]。

葡萄是深根性植物，根系肉質(zhì)且發(fā)達(dá)，具有固定植株、吸收水分和營養(yǎng)物質(zhì)的作用，還可以貯藏養(yǎng)分，合成包括激素在內(nèi)的多種活性物質(zhì)以調(diào)控植株的生長發(fā)育。除此之外，葡萄在栽培過程中，如遇高溫高濕環(huán)境，會在老蔓上發(fā)育形成氣生根(圖1-A)，該類根系與栽培根系結(jié)構(gòu)不同，具有一定吸收空氣的功能[11]。在生產(chǎn)上，可利用葡萄容易產(chǎn)生氣生根的特性，采用高空壓條技術(shù)繁育葡萄植株，這表明葡萄氣生根發(fā)育程度較低[12]，具有較強(qiáng)的分化潛能。因此，葡萄氣生根是一種較好的研究根系發(fā)育過程的材料。根系的形態(tài)建成是一個復(fù)雜的調(diào)控過程，但目前關(guān)于葡萄根系發(fā)育相關(guān)基因及調(diào)控機(jī)理研究卻很少。本實驗通過高空壓條技術(shù)，利用凈水誘導(dǎo)葡萄初生根形成，通過轉(zhuǎn)錄組測序分析，研究葡萄根系在形態(tài)建成初期基因調(diào)控機(jī)理，以期為根系發(fā)育機(jī)理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料準(zhǔn)備

以5年生魏可葡萄結(jié)果枝條為材料，在當(dāng)年生結(jié)果枝上選取一個已木質(zhì)化的莖節(jié)，在其生物學(xué)下端1 cm處環(huán)割，保濕材料裹敷環(huán)割處進(jìn)行保濕催生[12]。處理20 d后，選取氣生根初步形成的莖節(jié)(圖1-B)作為實驗材料，以未環(huán)割的莖節(jié)作為實驗對照，液氮速凍后保存?zhèn)溆谩?/p>

A，在高濕環(huán)境中自然生成的氣生根；B，經(jīng)誘導(dǎo)生成的氣生根。A， Natural aerial roots in high humidity environment; B， Induced aerial roots.圖1 氣生根類型Fig.1 Aerial roots type

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA提取及處理

每個處理取混合樣品1 g，參照TaKaRa全RNA提取試劑操作說明進(jìn)行根系總RNA提取。

1.2.2 文庫構(gòu)建及測序

葡萄根系cDNA文庫構(gòu)建及測序均委托蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝及基因功能注釋

葡萄根系轉(zhuǎn)錄組測序及對獲得的數(shù)據(jù)庫Unigene的全面分析和注釋，均委托蘇州金唯智生物科技有限公司完成。數(shù)據(jù)分析流程如圖2所示。

圖2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫分析Fig.2 Data analysis of digital transcriptome

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄根系轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝

對照莖節(jié)(CK)和有初生根生成莖節(jié)(WK)轉(zhuǎn)錄組測序后，分別得到53 773 228，53 318 244條Raw reads，去除接頭(adapter)序列、5′或3′末端質(zhì)量值低于20或者含N堿基、去除trim后reads長度低于750 bp的序列，分別得到53 458 342，53 001 586條Clean reads，Q20的百分率(計算Phred數(shù)值大于20的堿基占總體堿基的百分比)分別為97.43%和97.37%，Q30的百分率分別為93.50%和93.33%，均大于90%，質(zhì)量合格。GC(計算堿基G和C的數(shù)量占總堿基數(shù)量的百分比)分別為46.12%和47.78%，N百分率(不確定堿基的比例)分別為0.001 033%和0.001 010%，上述數(shù)據(jù)表明，本次測序質(zhì)量較好，符合后續(xù)分析要求(表1)。

表1 測序質(zhì)量統(tǒng)計Table 1 Quality statistics of sequencing

2.2 參考基因組對比

將過濾后的測序Clean data與參考基因組進(jìn)行比對分析發(fā)現(xiàn)，對照莖節(jié)(CK)和有初生根生成莖節(jié)(WK)的Clean reads中能定位到基因組上的序列(total mapped)分別為45 194 093和44 004 355，占Clean reads比率為84.540 8%和83.024 6%(表2)，其中對照組和實驗組有多個比對位置的測序序列(multiple mapped)分別為2 985 501(占比5.58472%)和2 499 067(占比4.715 08%)，在參考基因組序列上有唯一對比位置的測序序列分別為42 208 592(占比78.956%)和41 505 288(78.310%)，測序序列分段比對到參考序列兩個外顯子的序列(splice reads)分別為16 445 551和16 014 719，測序序列整段比對到外顯子的序列(non_splice reads)分別為25 763 041和25 490 569。

表2 Clean reads 比對到參考基因組上情況Table 2 Clean reads aligned to the reference genome

2.3 可變剪切分析

用ASprofile(V1.0.4)軟件對StringTie (v1.0.4)[13]預(yù)測出的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行可變剪切事件分類和表達(dá)量統(tǒng)計(圖3)。其中實驗組WK可變剪切最多的是TSS(最后一個外顯子可變剪切，16 689個可變剪切位點(diǎn))、TTS(第一個外顯子可變剪切，15 125個可變剪切位點(diǎn))和AE(可變5′或3′端剪切，6 179個可變剪切位點(diǎn))，對照組CK也表現(xiàn)相似的分布，TSS、TTS和AE分別為16 486、14 968和7 176個可變剪切位點(diǎn)(表3)。

圖3 可變剪切分析Fig.3 Variable shear analysis

表3 可變剪切統(tǒng)計Table 3 Variable shear statistics

2.4 基因表達(dá)分析

對檢測結(jié)果按照差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)(差異基因表達(dá)變化2倍以上且FDR≤0.05)進(jìn)行篩選，在誘導(dǎo)葡萄初生根發(fā)育過程中，有3 989個基因表達(dá)量上調(diào)，2 830個基因表達(dá)量下調(diào)(圖4)。

2.5 基因功能注釋

根系差異表達(dá)基因根據(jù)GO功能分類，可分為分子功能(molecular function)、細(xì)胞組分(cellular component)及生物學(xué)過程(biological process)3大類(圖5)，涉及40條功能分支，其中，參與催化活性(catalytic activity)與結(jié)合(binding)的樣本基因數(shù)量最多，都在2 000條以上。其次參與代謝過程(metabolic process)的基因數(shù)超過1 500條，其余功能分支基因數(shù)都不超過1 000條。

2.6 差異基因KEGG富集分析

為進(jìn)一步分析差異表達(dá)基因的生物學(xué)行為，結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫，對葡萄氣生根發(fā)育表達(dá)基因的Pathway注釋進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，WK所富集的植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中色氨酸代謝ARF下調(diào)表達(dá)；二萜生物合成途徑TF基因家族下調(diào)表達(dá)；類胡蘿卜素合成中PP2C 、SnRK2和ABF上調(diào)表達(dá)；半胱氨酸和蛋氨酸代謝中ETR和ERF1/2下調(diào)表達(dá)；油菜素內(nèi)酯生物合成中BAK1下調(diào)表達(dá)，BSK、TCH4和CYCD3上調(diào)表達(dá)；α-亞麻酸代謝中JAZ上調(diào)表達(dá)，MYC2下調(diào)表達(dá)(圖6)。

A，樣品差異表達(dá)基因的上下調(diào)情況；B，差異基因火山圖，紅色點(diǎn)表示上調(diào)，藍(lán)色點(diǎn)表示下調(diào)；橫坐標(biāo)代表基因在不同樣本中表達(dá)倍數(shù)變化， 縱坐標(biāo)代表基因表達(dá)量變化差異的統(tǒng)計學(xué)顯著性；C，差異基因聚類圖，以log10(FPKM+1)值進(jìn)行聚類，紅色表示高表達(dá)基因，藍(lán)色表示低表達(dá)基因， 顏色從藍(lán)到紅，表示基因表達(dá)量越高。A， Up-down regulation of differentially expressed genes in samples; B， Differential gene volcanic map， red points were up-regulated， blue points were down-regulated， The abscissa represented the multiple changes of gene expression in different samples.The ordinate represented the statistical significance of the difference in gene expression; C， The differentially expressed genes were clustered according to log10 (FPKM+1) value. Red was high expressed genes， blue was low expressed genes， from blue to red gene expression increased.圖4 氣生根發(fā)育過程差異表達(dá)基因分析Fig.4 Analysis of differentially expressed genes during the development of aerial roots

Catalytic activity，催化活性；Binding，結(jié)合；Transporter activity，轉(zhuǎn)運(yùn)活性；Electron carrier activity，電子載體活性；Nucleic acid binding transcription factor activity，核酸結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子活性；Antioxidant activity，抗氧化劑活性；Molecular function regulator，分子功能調(diào)節(jié)劑；Structural molecule activity，結(jié)構(gòu)分子活性；Signal transducer activity，信號傳感器活性Nutrient reservoir activity，營養(yǎng)庫活性；Transcription factor activity，protrin binding，蛋白結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子活性；metallochaperone activity，金屬伴侶蛋白活性；Cell part，細(xì)胞組分；Organelle，細(xì)胞器；Membrane part，隔膜部分；Membrane，隔膜；Extracellular region，胞外區(qū)；Organelle part，細(xì)胞器部分；Macromolecular complex，高分子復(fù)合物；Supramolecular complex，超分子復(fù)合物；Extracellular region part，胞外區(qū)部分；Cell junction，細(xì)胞連接；Nucleoid，擬核；Metabolic process，代謝過程；Cellular process，細(xì)胞過程；Response to stimulus，應(yīng)激反應(yīng)；Single-organism process，單生物過程；Biological regulation，生物調(diào)節(jié)；Localization，定位；Multi-organism process，多-有機(jī)體過程；Developmental process，發(fā)育過程；Cellular component organization or biogenesis，細(xì)胞組分組織或生物形成；Reproductive process，生殖過程；Multicellular organismal process，多細(xì)胞生物過程；Growth，生長；Immune system process，免疫系統(tǒng)過程；Reproduction，復(fù)制；Locomotion，運(yùn)動力；Rhythmic process，節(jié)律過程；Biological adhesion，生物黏附。圖5 差異表達(dá)基因的GO富集分析Fig.5 GO enrichment analysis of differentially expressed genes

圖6 植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)Fig.6 Plant hormone signal transduction

2.7 生長素響應(yīng)基因分析

生長素作為調(diào)控植株生長發(fā)育最重要的激素，在葡萄氣生根發(fā)育過程中也起到重要調(diào)控作用，其中生長素輸入載體AUX1家族基因顯著上調(diào)，Auxin transporter-like protein 2與Auxin transporter-like protein 3基因分別上調(diào)表達(dá)10.40倍和4.65倍。生長素輸出載體是一種復(fù)合物，由調(diào)節(jié)亞基-NPA結(jié)合蛋白和催化亞基-PIN(Pin-formed)蛋白組成[14]。PIN(auxin efflux carrier component)蛋白家族有8個成員，本研究中發(fā)現(xiàn)PIN2與PIN1b顯著上調(diào)，而PIN3，PIN5和PIN8蛋白基因顯著下調(diào)(表4)。而早期響應(yīng)生長素的基因分為Aux/IAA(auxin/indole-3-acetic)[15]、GH3(gretchen hagen 3)[16]和SAUR(small auxin up RNA)[17]三大家族。在本實驗中，SAUR基因家族有30個基因表達(dá)發(fā)生顯著變化(表5)，其中包含13個具有SAUR基因家族類似功能的基因，將剩余17個SAUR家族基因進(jìn)行同源序列分析(圖7)，發(fā)現(xiàn)除SAUR15A-1與SAUR21-4基因同源性為77%，但表達(dá)上下調(diào)變化相反，其余上調(diào)基因與下調(diào)基因分別歸為一類。其中，SAUR71和SAUR72同屬SUAR41亞家族，屬于CLADEⅢ，在本研究中SAUR71基因表達(dá)下調(diào)，SAUR72基因表達(dá)上調(diào)。由此說明，生長素在氣生根發(fā)育過程中調(diào)控機(jī)理較為復(fù)雜，生長素響應(yīng)基因調(diào)控不同的代謝途徑，即使調(diào)控同一代謝途徑，同一基因家族會存在正向調(diào)控與負(fù)向調(diào)控的區(qū)別。

圖7 SAUR基因同源性分析Fig.7 Analysis of SAUR gene homology

表4 PIN家族差異表達(dá)基因Table 4 PIN gene family differentially expressed genes

表5 SAUR家族差異表達(dá)基因Table 5 SAUR gene family differentially expressed genes

2.8 脫落酸代謝調(diào)控

脫落酸是一種具有倍半萜結(jié)構(gòu)的植物激素，目前越來越多研究表明，ABA可以通過調(diào)控主根和側(cè)根的生長發(fā)育使植物適應(yīng)各種環(huán)境[18-19]。在本文轉(zhuǎn)錄組測序研究中，脫落酸受體PYR/PYL基因家族中PYL1、PYL4和PYL11顯著上調(diào)，而PYL9基因顯著下調(diào)(表6)。PP2C(絲氨酸/蘇氨酸殘基蛋白磷酸酶)是一種脫落酸負(fù)調(diào)控因子，該基因家族中Probable protein phosphatase 2C 24和Probable protein phosphatase 2C 75基因表達(dá)顯著上調(diào)。SnRK2基因家族中Serine/threonine-protein kinaseSAPK2基因表達(dá)顯著上調(diào)，ABF基因家族中的Protein ABSCISIC ACID-INSENSITIVE 5基因表達(dá)顯著上調(diào)，都表明脫落酸密切參與了氣生根發(fā)育調(diào)控。

表6 脫落酸響應(yīng)基因差異表達(dá)Table 6 Differential expression of abscisic acid response genes

2.9 高表達(dá)基因分析

內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶(endo-β-1，4-D-glucanohydrolase)能催化水解纖維素等含有1，4-β-葡聚糖主鏈的多聚糖，降解成糊精或寡聚糖。研究發(fā)現(xiàn)，植物的生長發(fā)育過程中內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶發(fā)揮了廣泛的作用，如細(xì)胞伸長、果實成熟軟化和組織器官脫落。本研究中內(nèi)切葡聚糖酶1、3、5、6、10、11、17、24、25表達(dá)量顯著上升，只有內(nèi)切葡聚糖酶12表達(dá)量下調(diào)(表7)。內(nèi)切葡聚糖酶17上調(diào)表達(dá)量最高，可能有側(cè)根從莖節(jié)處萌發(fā)有關(guān)，內(nèi)切葡聚糖酶17降解了該處細(xì)胞壁[20]。

表7 內(nèi)切葡聚糖酶家族基因差異表達(dá)Table 7 Differential expression of endoglucanase family genes

基本螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)轉(zhuǎn)錄因子(TF) PRE3/ATBS1/bHLH135/TMO7(以下簡稱PRE3)基因也發(fā)生了顯著上調(diào)表達(dá)(log2FC值為13.40)。此外，在本研究中3個高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體NRT2.1a(high-affinity nitrate transporter 2.1-1 LOC100253304)、NRT2.1b(LOC100253304)和NRT2.4(LOC100263699)分別上調(diào)表達(dá)3 248、231和120倍。表明在葡萄氣生根發(fā)育過程中，通過硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體使硝酸鹽在莖節(jié)處大量富集，可顯著提高莖節(jié)處側(cè)根伸長[21]。

3 討論與結(jié)論

本實驗選擇葡萄氣生根作為實驗材料，研究葡萄側(cè)根發(fā)育相關(guān)基因的調(diào)控機(jī)理，通過高通量分析，對照莖節(jié)(CK)和有初生根生成莖節(jié)(WK)的Clean reads中能定位到基因組上的序列(total mapped)分別為45 194 093和44 004 355條。GO富集分析和KEGG富集分析，闡明了氣生根的發(fā)育調(diào)控過程中，包括生長素、赤霉素、脫落酸在內(nèi)的所有植物激素都參與了調(diào)控過程，闡明了參與氣生根發(fā)育調(diào)控的信號傳導(dǎo)、激素調(diào)控等相關(guān)基因的表達(dá)差異，尤其在生長素代謝調(diào)控通路和脫落酸代謝調(diào)控通路中，差異表達(dá)基因富集顯著，且表達(dá)變化較大，說明在氣生根發(fā)育過程中生長素和脫落酸起到主要激素調(diào)控作用。

在植物根系發(fā)育過程中，生長素(主要為吲哚乙酸)起到重要的調(diào)控作用[22]。生長素在植物組織間的運(yùn)輸方式有被動擴(kuò)散和極性運(yùn)輸兩種方式[23]。其中極性運(yùn)輸使生長素在植株體內(nèi)形成以器官頂端為中心濃度梯度，并維持植物不同組織中的生長素梯度差，從而調(diào)控根的發(fā)育過程。生長素極性運(yùn)輸由生長素輸入載體(auxun influx carrier)和生長素輸出載體(auxin efflux carrier)調(diào)控。生長素輸入載體介導(dǎo)生長素逆濃度梯度運(yùn)輸，維持生長素濃度梯度差[24]。在本次實驗中，生長素輸入載體AUX1家族基因顯著上調(diào)，Auxin transporter-like protein 2與Auxin transporter-like protein 3基因分別上調(diào)表達(dá)10.40倍和4.65倍，表明生長素被主動運(yùn)輸?shù)搅饲o節(jié)處促進(jìn)根系萌發(fā)，生長素輸出蛋白基因PIN2與PIN1b顯著上調(diào)，而PIN3、PIN5和PIN8蛋白基因顯著下調(diào)，表明生長素輸出蛋白在植物生長發(fā)育過程中具有不同的生理功能。

在本次轉(zhuǎn)錄組測序中，脫落酸響應(yīng)基因顯著表達(dá)，表明脫落酸參與調(diào)控葡萄植株抵抗高溫高濕環(huán)境，并誘導(dǎo)葡萄植株莖稈萌發(fā)氣生根來適應(yīng)外界環(huán)境。而生長素響應(yīng)基因的顯著下調(diào)，表明生長素表達(dá)量降低，可能與脫落酸抑制生長素表達(dá)有關(guān)。結(jié)合生長素下游相應(yīng)基因分析，內(nèi)切葡聚糖酶基因、PRE基因和高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體基因在氣生根發(fā)育過程中顯著上調(diào)表達(dá)，內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶主要作用為催化水解纖維素，這與氣生根從莖稈處細(xì)胞萌發(fā)有關(guān)，而PRE3基因是參與多種發(fā)育機(jī)制的轉(zhuǎn)錄因子，包括光信號和激素穩(wěn)定，在本實驗中，PRE3顯著上調(diào)，可能參與了赤霉酸或油菜素內(nèi)酯調(diào)節(jié)初生根發(fā)育過程，這與Castelain等[25]研究結(jié)果一致。此外，NRT2.1a、NRT2.1b和NRT2.4三個高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)基因均為極顯著上調(diào)表達(dá)，表明利用硝酸鹽在莖節(jié)處富集，刺激根芽萌發(fā)是氣生根生長發(fā)育調(diào)控機(jī)理之一。