馮楊英凡， 陳楷文， 王華楠， 陳 陶， 季 平△

1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，重慶 401120 2大連理工大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，大連 116000

傷口愈合過(guò)程由止血、炎癥、組織增殖和重塑4個(gè)階段組成，各階段相互交織且受到細(xì)胞、體液和分子信號(hào)等因素復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)控[1]。皮膚屏障的破壞增加了病原微生物的侵入風(fēng)險(xiǎn)，由此導(dǎo)致創(chuàng)口的局部微環(huán)境發(fā)生變化。傷口愈合過(guò)程中自身的調(diào)控受到微生物干擾后，大量炎性細(xì)胞堆積，成纖維細(xì)胞代謝和血管重建受損，最終傷口遷延不愈形成疤痕組織[1-2]。有研究表明傷口感染在住院患者中的比例高達(dá)67.5%，這不僅嚴(yán)重降低了患者的生活質(zhì)量，而且極大地消耗了醫(yī)療成本，造成了嚴(yán)重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。目前針對(duì)感染傷口等復(fù)雜愈合環(huán)境，各種傳統(tǒng)敷料如紗布、繃帶等，多為干性結(jié)合易產(chǎn)生傷口粘連，且不易攜帶藥物僅起到物理屏障的作用，因此促進(jìn)愈合及防止感染的能力有限[4]。隨著對(duì)傷口愈合研究的深入及技術(shù)的發(fā)展，各種新型的傷口修復(fù)材料不斷更新并以加快傷口皮層細(xì)胞的修復(fù)過(guò)程并恢復(fù)組織功能為目的[5]，其中，水凝膠由于其獨(dú)特的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可作為新型感染傷口修復(fù)材料而受到研究者的廣泛關(guān)注。

水凝膠是水溶性分子通過(guò)物理交聯(lián)(氫鍵、主客體作用、離子鍵等)或動(dòng)態(tài)化學(xué)鍵結(jié)合(亞胺鍵、二硫鍵等)所形成三維網(wǎng)絡(luò)[6]。這種網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中富含水分子，其內(nèi)部交錯(cuò)的孔隙通道有利于細(xì)胞物質(zhì)交換及內(nèi)部負(fù)載藥物的擴(kuò)散，使得水凝膠類材料在針對(duì)感染傷口，構(gòu)建藥用型傷口敷料上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[6-7]。此外，水凝膠具有良好的生物力學(xué)性能和可塑性，成膠前大多可流動(dòng)及注射，適用于感染、潰瘍等不規(guī)則慢性創(chuàng)口的覆蓋[6，8]。但水凝膠在傷口愈合的臨床轉(zhuǎn)化上依然存在機(jī)械性能與生物相容性難以平衡；成本高昂、合成復(fù)雜不適宜批量生產(chǎn)；對(duì)不同愈合的復(fù)雜環(huán)境缺乏針對(duì)性等問(wèn)題[5，9-10]。如何在易于生產(chǎn)的前提下，選擇一種能可控地提升水凝膠的機(jī)械性能及生物相容性的水凝膠敷料，通過(guò)負(fù)載針對(duì)性藥物來(lái)進(jìn)行抗菌及抗感染治療，對(duì)復(fù)雜病理環(huán)境下的傷口愈合具有重要的臨床意義。

課題組前期成功構(gòu)建了基于“纏結(jié)效應(yīng)”的新型合成策略，通過(guò)將分散性聚合物鏈引入初級(jí)共價(jià)網(wǎng)絡(luò)促進(jìn)網(wǎng)絡(luò)物理纏結(jié)，形成雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠(DN)。該水凝膠選用簡(jiǎn)單而低毒性的聚乙二醇(PEG)作為模型，具有可調(diào)節(jié)的機(jī)械性能和理想的生物相容性，易于制備，可批量生產(chǎn)，具有臨床運(yùn)用的潛力[11]。但對(duì)于臨床常見(jiàn)的感染傷口，該水凝膠未負(fù)載針對(duì)性藥物，對(duì)細(xì)菌及炎癥的控制能力有限；加之PEG本身缺乏粘附位點(diǎn)，不利于成纖維細(xì)胞、表皮細(xì)胞等長(zhǎng)入[12-13]，在感染傷口等復(fù)雜病理環(huán)境下的促愈合能力有限。因此，本研究擬在DN水凝膠中增加甲基丙烯酸酐化明膠(GelMA)，進(jìn)一步改善DN水凝膠的生物相容性，構(gòu)建利于傷口愈合的微環(huán)境，同時(shí)加載抗菌藥物慶大霉素以控制感染，促進(jìn)復(fù)雜病理環(huán)境下傷口愈合過(guò)程，為后期水凝膠的臨床應(yīng)用及建立藥用型水凝膠傷口敷料提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

所有化學(xué)品均至少采用分析試劑級(jí)。PEG(分子量：6000，35000 D)、丙烯酰氯(99%)、乙醚、二氯甲烷、2-羥基-4-(2-羥基乙氧基)-2甲基丙哌酮(Irgacure 2959)和明膠A(取自豬皮，300 Bloom)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。以丙烯酰三乙胺(99%)、碳酸鉀(95%)、甲氧基酸酐為原料，采用加料法生產(chǎn)制備實(shí)驗(yàn)所需水凝膠。

1.2 聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)的制備

PEGDA的合成方式參照文獻(xiàn)進(jìn)行[11]。將不同分子量的PEG溶于100 mL二氯甲烷，獲得澄清溶液后，在氮?dú)鈼l件下緩慢加入過(guò)量丙烯酰氯和三乙胺，置于冰浴條件下充分反應(yīng)24 h。過(guò)濾沉淀并加入碳酸鹽溶液以除去氯酸。收集濾液后加入乙醚結(jié)晶，真空干燥24 h以獲得PEGDA。將所得PEGDA溶于去離子水，透析3 d純化(透析袋分子量3 500 D)，所得終產(chǎn)物真空干燥24 h備用。

1.3 甲基丙烯酸酐化明膠(GelMA)的制備

稱取10 g明膠加入100 mL磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)，60℃攪拌至完全溶解。取2 mL甲基丙烯酸酐單體緩慢加入緩沖液，連續(xù)攪拌1 h后，加入200 mL磷酸鹽緩沖液猝滅反應(yīng)。將所得產(chǎn)物置于37℃透析純化3 d(透析袋分子量14000 D)，冷凍干燥24 h后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 合成DN-G復(fù)合水凝膠

稱取400 mg PEGDA溶于1 mL去離子水，40℃下攪拌溶解以制備40%(W/V)PEGDA溶液，加入400 mg PEG溶液(分子量按前期篩選，采用35 000D以構(gòu)建雙網(wǎng)絡(luò)體系)，制備DN水凝膠預(yù)聚液[11]。向DN水凝膠預(yù)聚液中添加GelMA進(jìn)行初篩(1%、2%、5%，W/V)，40℃下充分混合溶解。最后，加入光引發(fā)劑I-2959使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%。將混合均勻的復(fù)合物預(yù)聚液放置在紫外燈(365 nm，100 mW/cm2)下光照1 min后成膠(DN-G-1或DN-G-2)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中充分混合5%GelMA的DN水凝膠成膠時(shí)間延長(zhǎng)至3 min，為排除紫外光照時(shí)間對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響，添加的GelMA濃度選用1%及2%。純PEGDA水凝膠以相同步驟加入GelMA作為對(duì)照(PEG-G-1或PEG-G-2)。

1.5 水凝膠的微觀形態(tài)

通過(guò)掃描電子顯微鏡SEM觀察水凝膠形態(tài)及微觀結(jié)構(gòu)。將成膠后的水凝膠樣本置于真空干燥機(jī)中凍干48 h。切成薄片后的凍干水凝膠噴金后掃描檢測(cè)觀察。利用Image J軟件對(duì)水凝膠的孔徑進(jìn)行分析。

1.6 力學(xué)性能檢測(cè)

通過(guò)壓縮測(cè)試檢測(cè)DN-G復(fù)合水凝膠的力學(xué)性能。按照1.4所述方法制備復(fù)合水凝膠預(yù)聚液并置于直徑1 cm，高度為1 cm的圓柱型模具中，紫外燈(365 nm，100 mW/cm2)下光照1 min成膠(DN-G)。室溫下，采用MTS-E43設(shè)備測(cè)試其壓縮性能，加載速度為10 mm/min，每種凝膠測(cè)試4個(gè)平行樣品，計(jì)算平均值和方差，并繪制應(yīng)力-應(yīng)變曲線。

1.7 復(fù)合水凝膠的生物相容性驗(yàn)證

通過(guò)以下2種方式檢測(cè)水凝膠的細(xì)胞毒性：①將小鼠成纖維細(xì)胞L929于水凝膠上二維培養(yǎng)并進(jìn)行CCK-8分析：將200 μL DN-G(或PEG-G)預(yù)聚液加入48孔板，按照1.4的方式成膠，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液中浸沒(méi)預(yù)處理DN-G(或PEG-G)水凝膠24 h。采用純GelMA水凝膠作為陽(yáng)性對(duì)照(濃度為5%)。將L929培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，胰酶消化后培養(yǎng)液中和并計(jì)數(shù)，在48孔板中以8000個(gè)/孔的密度接種。每2天更換培養(yǎng)液，動(dòng)作輕柔以保證孔板底部水凝膠保持完整。在培養(yǎng)后不同時(shí)間點(diǎn)(1、4、7、10 d)進(jìn)行CCK-8分析測(cè)定，并于450 nm下測(cè)量吸光度(A)值。細(xì)胞存活率(cell viability)通過(guò)如下公式進(jìn)行計(jì)算：細(xì)胞存活率(%)=(A樣本-A空白/A對(duì)照-A空白)× 100%，式中：A樣本和A對(duì)照分別為樣品組和對(duì)照組的吸光度，A空白為單純基礎(chǔ)培養(yǎng)液即空白組的吸光度。每組實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行3次，取平均值。②將L929細(xì)胞置于水凝膠上進(jìn)行二維培養(yǎng)并通過(guò)Live/Dead染色后置于熒光顯微鏡下觀察。將水凝膠成膠后用直徑為8 mm打孔器制作成圓形薄膜塊，厚度均為1.5 mm，48孔板中紫外滅菌處理2 h后，置于基礎(chǔ)培養(yǎng)液中37℃過(guò)夜預(yù)處理。將L929以1×104個(gè)/孔的密度接種。培養(yǎng)24 h進(jìn)行Live/Dead染色，按照說(shuō)明書(shū)中A液(Calcein AM)、B液(PI)均按1 μL/mL的濃度與Live/Dead染色工作液均勻混合，將種植了細(xì)胞的支架材料用PBS清洗3遍，隨后用Live/Dead染液37℃避光孵育30 min，并于熒光顯微鏡下觀察拍照，計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)目。每組隨機(jī)選取3個(gè)視野，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 體外藥物釋放實(shí)驗(yàn)及抗菌實(shí)驗(yàn)

按照上述方式合成DN-G或PEG-G水凝膠后，使用10 mm打孔器打孔，制作大小均一，厚度為1 mm的水凝膠片。將水凝膠片置于5 mL 20 mg/mL的慶大霉素溶液中24 h以加載藥物，濾紙吸干水分并真空干燥。將載藥水凝膠片置于10 mL PBS(pH=7.2)緩沖液中，37℃溫箱中以60 r/min進(jìn)行釋放實(shí)驗(yàn)。在預(yù)先設(shè)置的時(shí)間間隔內(nèi)取出1 mL的釋放液，并補(bǔ)充相同體積的新鮮釋放液。釋放液中慶大霉素的含量通過(guò)衍生物反應(yīng)及紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定[14]，以鄰苯二醛為衍生劑，檢測(cè)波長(zhǎng)為332 nm。

實(shí)驗(yàn)采用金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)檢測(cè)載藥水凝膠的抗菌性能，將含有或不含慶大霉素的DN-G(或PEG-G)水凝膠片置于2 mL金黃色葡萄球菌菌液中，菌液濃度采用梯度稀釋法稀釋至1×106CFU/mL，24 h后拍照記錄并取適量測(cè)定吸光度值，檢測(cè)波長(zhǎng)600 nm，每組3個(gè)樣本并計(jì)算平均值。

1.9 感染傷口模型建立

選擇SPF級(jí)體質(zhì)量約250 g的Sprague Dawley雄性大鼠，背部脫毛，1%戊巴比妥麻醉并消毒后，用打孔器制造10 mm×10 mm的圓形皮膚全層缺損創(chuàng)面。傷口涂濃度為2×108CFU/mL的金黃色葡萄球菌50 μL，利用槍頭輕輕涂抹均勻，2 h后同樣操作再次接種1次，觀察傷口愈合情況。24 h后有淡黃色膿液滲出，創(chuàng)面邊緣出現(xiàn)炎癥反應(yīng)證明造模成功。

選擇12只SD雄性大鼠，按上述造模同法操作，在金黃色葡萄球菌傷口感染后，給予水凝膠敷料覆蓋傷口。將大鼠隨機(jī)分成3組，感染傷口未處理組(對(duì)照組)、DN-G組、DN-G+慶大霉素組(將慶大霉素溶于DN-G水凝膠預(yù)聚液中，藥物濃度為2%，GS/DN-G組)；每組4只小鼠，每天拍照記錄并觀察傷口愈合情況，隔天給予傷口換藥，以制造傷口時(shí)間為起點(diǎn)，21 d后處死取材，4%多聚甲醛固定后用于后續(xù)組織學(xué)評(píng)價(jià)。利用Image J軟件計(jì)算小鼠傷口愈合面積并統(tǒng)計(jì)傷口愈合率。

1.10 組織學(xué)評(píng)價(jià)

以形成傷口時(shí)間為1 d，在21 d后按照重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理標(biāo)準(zhǔn)處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，取傷口皮膚標(biāo)本并放于4%多聚甲醛中固定24 h后，制作石蠟切片，常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察傷口的組織學(xué)變化。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有定量結(jié)果均使用Image J(v.1.8.0-172)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)并采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DN-G水凝膠的微觀形態(tài)及力學(xué)性能

實(shí)驗(yàn)以初步探究GelMA在雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠DN中的最低有效濃度為目的。在DN水凝膠中加入5%的GelMA時(shí)，成膠時(shí)間延長(zhǎng)至3 min，考慮紫外光照時(shí)間會(huì)影響水凝膠的交聯(lián)度及細(xì)胞毒性[13]，為保證實(shí)驗(yàn)的一致性及DN水凝膠的性質(zhì)，實(shí)驗(yàn)中在DN中加入GelMA的濃度選用1%及2%進(jìn)行(成膠時(shí)間與DN水凝膠一致)。DN-G水凝膠的掃描電鏡觀察如圖1A所示。圖中可見(jiàn)DN-G水凝膠樣品均呈現(xiàn)出均勻的多孔結(jié)構(gòu)，1%及2%GelMA的加入均可將水凝膠的孔徑大小維持在16～24 μm(圖1B)。

通過(guò)壓縮實(shí)驗(yàn)評(píng)估GelMA改性的復(fù)合DN水凝膠(DN-G)的機(jī)械性能。如圖2中所示，GelMA加入后DN水凝膠的壓縮模量及壓縮強(qiáng)度無(wú)明顯改變，形變量50%時(shí)壓縮強(qiáng)度在1500 Pa左右。

圖1 DN-G復(fù)合水凝膠掃描電鏡圖(A)及通過(guò)Image J軟件定量測(cè)量水凝膠孔徑大小(B)Fig.1 Representative scanning microscopic images of the lyophilized hydrogels of DN-G(A)and Corresponding evaluation of the porosity of the hydrogels using Image J software(B)

圖2 DN-G水凝膠的壓縮應(yīng)力-應(yīng)變曲線Fig.2 Compression stress-strain curves of the DN-G hydrogel

2.2 DN-G水凝膠的細(xì)胞相容性

實(shí)驗(yàn)中常以細(xì)胞毒性作為材料生物應(yīng)用毒性評(píng)估的前期基礎(chǔ)，可檢測(cè)水凝膠在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用中的潛在危害。我們將小鼠成纖維細(xì)胞L929二維培養(yǎng)于DN-G及其相應(yīng)組分的水凝膠上，通過(guò)CCK-8法測(cè)定成纖維細(xì)胞(L929)的存活率，評(píng)估材料的毒性大小。圖3為L(zhǎng)929細(xì)胞在水凝膠上培養(yǎng)不同時(shí)間后CCK-8所測(cè)得的細(xì)胞活性?？梢钥闯觯? d后各組間細(xì)胞活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，PEG-G及DN-G的細(xì)胞相對(duì)生長(zhǎng)率均大于90%，可見(jiàn)材料用于細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)無(wú)明顯細(xì)胞毒性。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至14 d時(shí)，PEG基水凝膠上的細(xì)胞增殖相對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照純GelMA組有所減慢，但DN-G水凝膠的細(xì)胞增殖趨勢(shì)好于PEG-G，其中DN-G-2的增殖好于其他PEG基水凝膠組及DN-G-1組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

同時(shí)，為了更為直觀地觀察細(xì)胞存活狀態(tài)及形態(tài)，通過(guò)Live/Dead染色觀察二維培養(yǎng)于水凝膠上的L929細(xì)胞。圖4是L929在不同水凝膠上培養(yǎng)24 h后的共聚焦顯微鏡成像。如圖所見(jiàn)，細(xì)胞存活狀態(tài)良好，無(wú)明顯細(xì)胞死亡，在陽(yáng)性對(duì)照純GelMA水凝膠上細(xì)胞基本呈現(xiàn)梭型或多邊形，PEG-G及DN-G水凝膠上均可見(jiàn)部分細(xì)胞聚集并多為球形，GelMA的加入對(duì)成纖維細(xì)胞的鋪展有所改善，其中DN-G-2中細(xì)胞鋪展呈梭型的情況較多。根據(jù)細(xì)胞增殖及鋪展情況，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中DN-G均采用2%GelMA進(jìn)一步驗(yàn)證。

與DN-G-2組比較，*P<0.05圖3 L929細(xì)胞在不同水凝膠表面隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)的增殖變化Fig.3 The proliferation of L929 cells cultured on the surface of the different gels as a function of culture time

2.3 DN-G水凝膠加載慶大霉素后的體外釋放及抗菌實(shí)驗(yàn)

水凝膠本身的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可作為藥物緩釋系統(tǒng)，在感染傷口釋放藥物抑制細(xì)菌增殖。實(shí)驗(yàn)采用水凝膠吸收硫酸慶大霉素并監(jiān)測(cè)其對(duì)藥物釋放的影響，結(jié)果如圖5A所示。在pH=7.4緩沖溶液中，3種水凝膠聚合物在前2 h時(shí)釋放相對(duì)較快，均達(dá)到近30%，這主要來(lái)源于水凝膠表面負(fù)載藥物的擴(kuò)散；隨后藥物的釋放呈緩慢上升趨勢(shì)，DN-G水凝膠相對(duì)更為平穩(wěn)，72 h的藥物釋放量為63%，藥物釋放性能良好。載藥水凝膠的抑菌實(shí)驗(yàn)如圖5B，與未負(fù)載藥物的水凝膠對(duì)比，負(fù)載慶大霉素的DN-G水凝膠(GS/DN-G)72 h后培養(yǎng)液相對(duì)于其他組較為澄清，細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制，具有良好的抗菌能力。

圖4 L929細(xì)胞在不同水凝膠表面培養(yǎng)24 h時(shí)Live/Dead細(xì)胞染色情況(標(biāo)尺=100 μm)Fig.4 Representative fluorescence microscopic images of Live/Dead staining for L929 cells cultured on different hydrogels for 24 h(Scale bar=100 μm)

圖5 不同水凝膠負(fù)載慶大霉素的藥物累計(jì)釋放(A)及負(fù)載或不負(fù)載慶大霉素的不同水凝膠的抗菌活性及72 h細(xì)菌培養(yǎng)的宏觀圖片(B)Fig.5 Cumulative release of hydrogels loading gentamicin(A).Antimicrobial activity evaluation of various hydrogels loading gentamicin or not against S.aureus after 1 and 3 day(s) of culture；Representative photographs showing bacterial culture with different hydrogels after 3 days(B)

2.4 DN-G水凝膠加載慶大霉素用于感染傷口的治療作用

選擇SD大鼠構(gòu)建的感染傷口模型評(píng)價(jià)復(fù)合水凝膠作為傷口敷料的治療作用，實(shí)驗(yàn)分別設(shè)置DN-G組，GS/DN-G組和感染傷口未處理組(對(duì)照組)。由圖6A可見(jiàn)，GS/DN-G組相對(duì)于其他兩組傷口愈合速度較快，21 d后傷口基本痊愈。傷口愈合面積的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示(圖6B)：DN-G組與對(duì)照組傷口愈合速率相似，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第4 天，傷口愈合在GS/DN-G組出現(xiàn)改善趨勢(shì)(無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異)，第7天后GS/DN-G組傷口愈合面積明顯減小，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，第21天后感染傷口基本愈合。

圖6 SD大鼠背部感染傷口愈合圖片(A)及不同時(shí)間SD大鼠背部感染傷口愈合面積(B)Fig.6 Representative photographs showing the healing process of the skin wounds at different time points after treatments using the different treatments(A)and quantitative analysis of wound size of gradually healing wounds on day 21 after treatments(B)

2.5 組織學(xué)評(píng)價(jià)

通過(guò)HE染色對(duì)傷口進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)，如圖7所示：對(duì)照組仍可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞，肉芽組織形成較厚的瘢痕，幾乎無(wú)上皮組織向傷口中心長(zhǎng)入；DN-G組仍存在一定程度的炎性浸潤(rùn)，可見(jiàn)瘢痕組織；GS/DN-G組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)聚集相對(duì)于前兩組明顯減輕，可見(jiàn)纖維細(xì)胞及血管等結(jié)構(gòu)，上皮向傷口中心長(zhǎng)入使得傷口間隙減小，疤痕增生不明顯。

A：GS/DN-G組；B：DN-G組；C：對(duì)照組；下圖為黑色方框的放大圖圖7 不同處理組小鼠傷口愈合21 d后組織HE染色Fig.7 Representative HE staining of the skin wounds after 21 days of treatment

3 討論

傷口的愈合過(guò)程易受到一系列因素如年齡、全身基礎(chǔ)性疾病、感染及異物等的影響，其中微生物定植帶來(lái)的感染是如今導(dǎo)致傷口遷延不愈最為重要的因素[2]。細(xì)菌在傷口定居并繁殖，與應(yīng)激產(chǎn)生的炎癥細(xì)胞共同消耗大量氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)而成纖維細(xì)胞代謝及增殖受損，導(dǎo)致傷口愈合的炎癥期延長(zhǎng)，增殖和重塑期推遲[15]。此外，機(jī)體免疫細(xì)胞吞噬細(xì)菌后釋放蛋白酶和氧自由基，破壞膠原沉積形成大量疤痕組織[15-16]。對(duì)于慢性感染傷口，現(xiàn)有的傷口敷料總體治療效果不佳且治療費(fèi)用較高，因此，開(kāi)發(fā)能夠早期抑菌、控制炎癥、加快皮層細(xì)胞增生的針對(duì)性敷料一直是傷口愈合的研究重點(diǎn)及熱點(diǎn)。近年來(lái)水凝膠類材料所構(gòu)建的三維網(wǎng)絡(luò)體系使其柔軟且含水量高，與軟組織及細(xì)胞外基質(zhì)的性能匹配的同時(shí)可作為藥物輸送系統(tǒng)，因而受到研究者的廣泛關(guān)注[7，17]。事實(shí)上，目前已有部分研究將水凝膠材料用于治療感染傷口，以自身抗菌類水凝膠及負(fù)載抗菌劑的水凝膠最為常見(jiàn)，前者以殼聚糖及其衍生物為代表，通過(guò)聚合物分子自身實(shí)現(xiàn)廣譜抗菌但其作用非常有限[18]；后者則形式多樣，通過(guò)負(fù)載無(wú)機(jī)或有機(jī)抗菌劑抑制感染，構(gòu)建利于促進(jìn)愈合的微環(huán)境，但水凝膠的成膠時(shí)間、機(jī)械性能及藥物釋放等仍需進(jìn)一步的精確控制[18-19]。

本課題組前期基于“網(wǎng)絡(luò)纏結(jié)效應(yīng)”，選用低毒性、低免疫原性PEG構(gòu)建了機(jī)械性能可控的雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠(DN)，但對(duì)于感染等復(fù)雜的病理性傷口愈合環(huán)境，DN水凝膠缺乏對(duì)細(xì)菌感染的有效控制，且PEG缺乏粘附位點(diǎn)不利于引導(dǎo)成纖維細(xì)胞等宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)[11-12]。因此，本實(shí)驗(yàn)在DN水凝膠中增加了GelMA以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖及鋪展，以改善愈合環(huán)境，促進(jìn)傷口增殖及重塑的發(fā)生；同時(shí)，為減少細(xì)菌定植、控制早期炎癥，實(shí)驗(yàn)在DN-G水凝膠內(nèi)負(fù)載了慶大霉素，通過(guò)局部緩釋作用達(dá)到早期抑菌，減少炎癥細(xì)胞的產(chǎn)生，進(jìn)而有效地促進(jìn)了感染傷口的愈合。

事實(shí)上，水凝膠作為良好的細(xì)胞外基質(zhì)類似物，具有適宜的機(jī)械性能，能夠維持細(xì)胞所需微環(huán)境進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的行為[20]，這也為研究者通過(guò)改善水凝膠的性能，構(gòu)建感染等病理狀態(tài)下傷口愈合所需微環(huán)境提供了新的思路。如Zhu等[21]在PPCN溫敏性水凝膠上修飾了特征性短肽A5G81，增強(qiáng)整合素β3的作用以促進(jìn)細(xì)胞遷移及增殖，從而改善了糖尿病慢性感染情況下的傷口愈合。現(xiàn)已有大量研究驗(yàn)證了細(xì)胞外基質(zhì)的機(jī)械性能如剛度、應(yīng)力松弛、粘附受體濃度等均可顯著調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、鋪展及分化[22-24]。但眾所周知，PEG作為人工合成類水凝膠缺乏粘附位點(diǎn)而對(duì)細(xì)胞的調(diào)控作用有限[12-13]，在感染等本就存在成纖維細(xì)胞功能受限的慢性傷口愈合的環(huán)境中，PEG基水凝膠的應(yīng)用受到限制?？紤]GelMA來(lái)源于天然細(xì)胞外基質(zhì)，簡(jiǎn)單易得且保留了天然的細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)如RGD及基質(zhì)金屬蛋白酶解位點(diǎn)等[24]，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在雙網(wǎng)絡(luò)纏結(jié)水凝膠DN中加入GelMA，初步篩選改善成纖維細(xì)胞增殖及鋪展的最小有效濃度，使水凝膠可進(jìn)一步模擬細(xì)胞外基質(zhì)的自然狀態(tài)從而推動(dòng)機(jī)體自身愈合進(jìn)程。同時(shí)，DN-G水凝膠維持了DN雙網(wǎng)絡(luò)纏結(jié)水凝膠的孔徑大小及機(jī)械性能，允許物質(zhì)擴(kuò)散及細(xì)胞長(zhǎng)入，使得DN-G具有作為三維細(xì)胞支架的潛能，有利于后續(xù)進(jìn)一步探究粘附位點(diǎn)的調(diào)控機(jī)制及作用。但值得注意的是直接物理共混高濃度的GelMA可能影響水凝膠的成膠效能(在DN水凝膠中加入5%GelMA使得成膠時(shí)間延長(zhǎng))，這可能是由于GelMA與PEGDA發(fā)生共價(jià)交聯(lián)，影響次級(jí)物理纏結(jié)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建有關(guān)，這提示后續(xù)研究可采用如接枝RGD短肽等方式提供粘附位點(diǎn)，保證纏結(jié)發(fā)生的同時(shí)精確調(diào)控細(xì)胞行為。

此外，水凝膠的三維網(wǎng)絡(luò)及貫穿通道在運(yùn)載藥物及生物活性分子上具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)。DN-G水凝膠負(fù)載慶大霉素后有效抑制了感染傷口的炎癥，加速愈合，這可歸功于水凝膠良好的載藥能力，其局部緩釋作用使藥物持續(xù)維持一定濃度從而在早期抑制細(xì)菌增殖，避免大量炎性細(xì)胞堆積，改善了感染傷口愈合的環(huán)境，成纖維細(xì)胞得以進(jìn)入傷口床觸發(fā)后續(xù)愈合過(guò)程[25-26]。此外，使用水凝膠局部運(yùn)載藥物治療感染傷口，可降低全身用藥所帶來(lái)的不良反應(yīng)，在局部維持藥物的治療濃度，這對(duì)于局部感染性傷口的治療具有重要意義[25]?，F(xiàn)已有部分研究關(guān)注水凝膠自身材料的改性或?qū)Χ喾N藥物聯(lián)合應(yīng)用釋放策略的調(diào)整，以使水凝膠得以適應(yīng)感染傷口愈合的復(fù)雜環(huán)境[26-27]，但在水凝膠類材料作為感染傷口愈合敷料的臨床轉(zhuǎn)化上，仍然需要進(jìn)一步建立精確的控制策略，實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物釋放的靶向及時(shí)空控制，通過(guò)建立針對(duì)復(fù)雜環(huán)境的控釋體系以應(yīng)對(duì)感染等病態(tài)條件下的愈合延遲。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)基于前期“纏結(jié)效應(yīng)”合成的PEG基雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠(DN)，通過(guò)GelMA生物功能化改性形成復(fù)合水凝膠DN-G，可維持穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)及良好的機(jī)械性能，GelMA的加入為細(xì)胞提供了DN水凝膠缺乏的細(xì)胞粘附位點(diǎn)，可有效促進(jìn)成纖維細(xì)胞在水凝膠網(wǎng)絡(luò)中的增殖及鋪展；另外，我們利用水凝膠良好的載藥性能，將負(fù)載慶大霉素的復(fù)合水凝膠DN-G用于感染傷口，達(dá)到持續(xù)抗菌及促進(jìn)愈合的作用，驗(yàn)證了DN-G水凝膠搭載藥物用于病理狀態(tài)下復(fù)雜環(huán)境傷口愈合的潛力?？傊珼N-G水凝膠提供了一種成本低廉且操作簡(jiǎn)單的生物材料策略，可以作為一種新型的水凝膠敷料用于感染創(chuàng)面的保護(hù)及治療。