吳瓊麗， 馮玉琨， 李 舸， 吳長(zhǎng)有， 楊 揚(yáng)， 彭延文

1中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究所，廣州 510080 2海南省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，?？?570311 3廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)研究所，廣州 510663 中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院 4肝臟外科 5生物治療中心，廣州 510080

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是胃腸道的慢性炎癥性疾病，臨床主要包括：克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎。多種病因被認(rèn)為與IBD有關(guān)，如環(huán)境變化、一系列易感基因變異、腸道微生物菌群異常以及異常的免疫應(yīng)答[1]。炎性小體是一組可被多種內(nèi)源性應(yīng)激信號(hào)激活的胞質(zhì)蛋白復(fù)合物，在機(jī)體免疫反應(yīng)和疾病發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。迄今為止，已經(jīng)鑒定出至少8種炎性小體亞型，其中研究最多的是核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域和富亮氨酸重復(fù)的pyrin 3結(jié)構(gòu)域(nucleotide-binding oligomerization domain，leucine-rich repeat and pyrin domain-containing 3，NLRP3)。已有的研究結(jié)果顯示，NLRP3的活化激活Caspase-1，將促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-18從其前體轉(zhuǎn)化為生物活性形式，上調(diào)促炎因子水平，導(dǎo)致炎癥[2-3]。

越來越多的研究表明，NLRP3炎癥小體的不可控激活在腸道炎癥的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用[4]。Bauer等[5]報(bào)道，NLRP3缺陷型(NLRP3-/-)小鼠的IBD嚴(yán)重程度比野生型(WT)小鼠明顯降低。而NLRP3炎性小體的特異性抑制劑MCC950，也通過抑制典型和非典型NLRP3炎性小體緩解結(jié)腸炎癥狀[6]。

目前，NLRP3的研究多集中在髓系細(xì)胞上，但最近的研究表明，小鼠和人的CD4+T淋巴細(xì)胞以及上皮細(xì)胞中均有NLRP3表達(dá)[7-9]。CD4+T細(xì)胞亞群的失衡與腸道黏膜炎癥密切相關(guān)[10]。此外，Bruchard等[11]報(bào)道NLRP3可通過炎癥小體調(diào)節(jié)Th2分化。但NLRP3對(duì)CD4+T細(xì)胞分化的影響與IBD發(fā)病機(jī)制的關(guān)系尚不十分清楚。因此，我們利用右旋糖酐硫酸鈉鹽(dextransulfatesodium，DSS)建立小鼠IBD模型，并比較WT IBD和NLRP3-/-IBD小鼠病理狀態(tài)、CD4+T細(xì)胞亞群的差異。結(jié)果表明，NLRP3的缺失減輕了DSS誘導(dǎo)的小鼠IBD癥狀，這與派伊爾結(jié)(PPs)和脾臟中Foxp3+Treg細(xì)胞的增加有關(guān)。體外分化實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了NLRP3缺失可促進(jìn)Foxp3+Treg細(xì)胞分化。提示缺失NLRP3炎性小體在DSS誘導(dǎo)的IBD中可以促進(jìn)Foxp3+Treg細(xì)胞生成，減輕腸道黏膜炎癥。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性C57BL/6小鼠24只，8～12周齡，購(gòu)自南京模型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，于中山大學(xué)無菌飼養(yǎng)。NLRP3-/-小鼠(B6.129S6-Nlrp3tm1Bhk/J)24只購(gòu)自美國(guó)杰克遜實(shí)驗(yàn)室，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)研究所飼養(yǎng)繁殖。收集尾巴活檢進(jìn)行基因分型驗(yàn)證。所有與小鼠相關(guān)的實(shí)驗(yàn)都采用年齡和體重匹配的小鼠，所有實(shí)驗(yàn)用鼠共48只。

1.2 試劑

純化的anti-CD3和anti-CD28購(gòu)自BD Biosciences(美國(guó))。佛波酯(PMA)和Ionomycin購(gòu)自Sigma-Aldrich公司(美國(guó))。ELISA Kit IFN-γ、IL-10、IL-17A、IL-1β和IL-6，均購(gòu)自BD Biosciences公司(美國(guó))。使用下列抗體進(jìn)行細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)染色：CD3-PE-CF594、CD4-FITC、CD4-APC-Cy7、CD19-PE-Cy7、CD25-APC、CD11b-Percp、Ly6G-APC-Cy7、NK1.1-AF700、IL-4-PE-Cy7、IFN-γ-APC、Foxp3-PE、IL-17-APC-Cy7、Zombie GreenTMFixable living Kit均來自BD Biosciences公司。重組小鼠IL-2、重組小鼠TGF-β購(gòu)自R&D公司(美國(guó))。

1.3 結(jié)腸炎的誘導(dǎo)和評(píng)估

DSS購(gòu)自MP Biomedicals公司(美國(guó))，用于誘發(fā)小鼠急性結(jié)腸炎。將2.5%(W/V)DSS溶于無菌水中，供小鼠飲水7 d。每天測(cè)量并記錄動(dòng)物體重。7 d后處死動(dòng)物，測(cè)量盲腸交界處到肛門邊緣距離即為結(jié)腸的長(zhǎng)度。疾病的嚴(yán)重程度通過體重減輕、結(jié)腸長(zhǎng)度和結(jié)腸的組織病理學(xué)評(píng)分來評(píng)估。蘇木精-伊紅染色對(duì)結(jié)腸組織進(jìn)行組織學(xué)分析。組織病理學(xué)評(píng)價(jià)：炎癥(I)(0，無；1，輕微；2，溫和；3，嚴(yán)重)；范圍(E)(0，無；1，黏膜；2，黏膜及黏膜下層；3，透壁的)；再生(R)(4，無組織修復(fù)；3，表面上皮不完整；2，損傷腺窩再生；1，幾乎完全再生；0，完全再生或組織正常)；腺窩損傷(C)(0，無；1，基底1/3受損；2，基底2/3受損；3，僅表面上皮完整；4，全隱窩和上皮丟失)；參與率(P)(1，1.1%～；2，26%～；3，51%～；4，76%～100%)，均根據(jù)先前的報(bào)道。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)細(xì)胞因子

收集小鼠血清標(biāo)本，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清中IFN-γ、IL-10、IL-17A、IL-1β和IL-6，均按照說明書進(jìn)行。96孔平底板包被捕獲抗體，4℃孵育過夜，板用0.05%吐溫20/PBS洗滌，1%牛血清白蛋白(BSA)/PBS室溫封閉1 h。血清樣本和倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品加入板中，37℃孵育2 h。加入檢測(cè)抗體孵育。0.05%吐溫20/PBS洗滌，TMB底物顯色后用10% H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(A)值。實(shí)際細(xì)胞因子濃度由標(biāo)準(zhǔn)品擬合的公式計(jì)算。

1.5 Western blot檢測(cè)蛋白含量

在距肛門邊緣0.5 cm處收集結(jié)腸樣本，將其切碎、勻漿并溶解在RIPA緩沖液(Thermo Scientific，美國(guó))中，加入蛋白酶抑制劑和苯甲基磺酰氟(PMSF)(Solarbio，中國(guó))勻漿并在冰上孵育30 min，在4℃下12000 r/min離心25 min。上清液中的總蛋白濃度由Pierce BCA蛋白檢測(cè)試劑盒(Thermo Scientific，美國(guó))測(cè)定。等量的蛋白用10% SDS-PAGE凝膠電泳(EpiZyme，中國(guó))分離，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。室溫下用5%脫脂奶粉在TBST中封膜1 h，于4℃與一抗孵育過夜。本研究的抗體包括：?jiǎn)慰寺〈笫罂剐∈驣L-10(1∶1000，Abcam，英國(guó))、單克隆兔抗小鼠Foxp3(1∶1000，Abcam，英國(guó))、多克隆兔抗小鼠IL-17A(1∶1000，Abclonal，中國(guó))、多克隆兔抗小鼠IL-6(1∶1000，Affinity，美國(guó))、單克隆兔抗小鼠GAPDH(1∶1000，Cell Signal Technology，美國(guó))。以GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照。以0.1%的TBST洗滌后，膜分別與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育(1∶1000，Cell Signaling Technology，美國(guó))。在機(jī)器上用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(ECL)(Amersham Biosciences，中國(guó))對(duì)標(biāo)記的蛋白進(jìn)行曝光處理。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)對(duì)表面標(biāo)記物和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的檢測(cè)

用含0.1% BSA和0.05%疊氮化鈉的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞后進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)記物染色。細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色：在Brefeldin A存在的情況下，用PMA+ Ionomycin(Sigma，美國(guó))刺激細(xì)胞(2×106/mL)6 h。用PBS洗滌細(xì)胞2次，于4℃避光用表面標(biāo)記物和活/死抗體標(biāo)記30 min。用含0.1% BSA和0.05%疊氮化鈉的PBS緩沖液洗滌2次，4%多聚甲醛固定，然后在含0.1%牛血清白蛋白、0.1%皂苷和0.05%疊氮化鈉的PBS緩沖液中破膜過夜。以上染色細(xì)胞均用FACS Aria Ⅱ(Becton Dickinson，San Jose，美國(guó))檢測(cè)，用FlowJo軟件(TreeStar，San Carlos，美國(guó))分析。

1.7 Treg的體外分化

使用Naive CD4+T細(xì)胞純化試劑盒(Miltenyi Biotec，德國(guó))從小鼠脾細(xì)胞中純化初始CD4+T細(xì)胞。將純化的初始CD4+T細(xì)胞(2×106/mL)懸浮在RPMI 1640培養(yǎng)液中，在重組IL-2(20 ng/mL)和TGF-β(5 ng/mL)存在下，抗CD3抗體聯(lián)合抗CD28抗體分別刺激3 d和5 d。

1.8 蘇木精-伊紅和免疫組化染色

取出結(jié)腸組織，浸泡在4%多聚甲醛中。經(jīng)梯度脫水，石蠟包埋，蘇木精-伊紅(HE)染色。為了評(píng)估細(xì)胞凋亡，使用原位細(xì)胞死亡檢測(cè)試劑盒(Roche Applied Science)按照制造商的方案進(jìn)行TUNEL染色。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 NLRP3缺失可以抑制DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎

為了探討NLRP3在DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎中的作用，我們將WT小鼠和NLRP3-/-小鼠連續(xù)7 d飼喂含2.5% DSS的飲用水。前4 d，兩組小鼠的體重沒有差異。第5 d到第7 d，WT小鼠體重下降幅度大于NLRP3-/-小鼠，兩組間的差異隨著時(shí)間逐漸擴(kuò)大(圖1A)。在本研究中，結(jié)腸長(zhǎng)度也被記錄作為小鼠結(jié)腸炎進(jìn)展的指標(biāo)，在第8天收集并測(cè)量所有結(jié)腸組織(圖1B)，DSS處理的WT IBD小鼠和NLRP3-/-IBD小鼠的結(jié)腸組織長(zhǎng)度均短于其對(duì)照組。有趣的是，盡管兩組未經(jīng)DSS處理的小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度沒有差異，但經(jīng)DSS處理后，WT IBD組小鼠的結(jié)腸長(zhǎng)度明顯短于NLRP3-/-IBD組(圖1B和1C)。這提示NLRP3促進(jìn)了DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎。結(jié)腸組織病理學(xué)檢查證實(shí)，經(jīng)DSS處理后，與NLRP3-/-IBD組小鼠相比，WT IBD組小鼠有更多的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)黏膜結(jié)構(gòu)和黏膜下水腫(圖1D)，這些單核細(xì)胞浸潤(rùn)程度與局部組織損傷的嚴(yán)重程度相當(dāng)，WT IBD組小鼠的病理評(píng)分高于NLRP3-/-IBD組小鼠(圖1E)。

已有文獻(xiàn)報(bào)道DSS誘導(dǎo)的IBD與結(jié)腸上皮細(xì)胞的凋亡有關(guān)。為了驗(yàn)證NLRP3在結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡中的作用，而不僅是DSS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。我們對(duì)WT和NLRP3-/-小鼠的正常結(jié)腸組織中進(jìn)行TUNEL染色，WT對(duì)照組和NLRP3-/-對(duì)照組小鼠的凋亡細(xì)胞數(shù)量相當(dāng)，說明僅NLRP3缺乏不能導(dǎo)致上皮細(xì)胞凋亡。然而，飼喂DSS后，WT IBD組小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的凋亡細(xì)胞，而NLRP3-/-IBD組小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞的凋亡情況較WT IBD小鼠明顯減輕(圖2)。這表明NLRP3參與了DSS誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞凋亡。

1：WT Control；2：WT IBD；3：NLRP3-/-Control；4：NLRP3-/-IBD；A：體重變化，數(shù)值以減重后的百分比表示；B、C：4組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度；D；遠(yuǎn)端結(jié)腸HE染色，標(biāo)尺=100 μm，放大倍數(shù)為40倍和100倍；E：小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分，單因素方差分析；n=6，*P< 0.05，**P< 0.01圖1 在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中NLRP3-/-小鼠的結(jié)腸炎癥進(jìn)展減緩Fig.1 Alleviation of colon inflammation in NLRP3-/- mice with DSS-induced colitis

箭頭所示為TUNEL染色陽(yáng)性的凋亡上皮細(xì)胞，標(biāo)尺=100 μm，放大40倍和100倍圖2 在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中NLRP3-/-小鼠細(xì)胞凋亡較少Fig.2 Fewer apoptotic cells in NLRP3-/- mice with DSS-induced colitis

2.2 在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中NLRP3的缺失會(huì)增加Treg細(xì)胞的比例

為了探討NLRP3在DSS所致結(jié)腸炎中的潛在免疫機(jī)制，我們采用流式細(xì)胞術(shù)分析了WT和NLRP3-/-小鼠的腸系膜淋巴結(jié)(mesenteric lymph node，mLN)、派伊爾結(jié)(Peyer’s patches，PPs)以及脾臟中B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的比例。結(jié)果顯示，mLN、PPs以及脾臟中的B細(xì)胞和T細(xì)胞比例在WT和NLRP3-/-小鼠中差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明NLRP3在T細(xì)胞和B細(xì)胞的發(fā)育和分布中并不起關(guān)鍵作用。然而，經(jīng)DSS飼喂后，NLRP3-/-IBD組小鼠PPs中B細(xì)胞的比例從(82.07±4.82)%降低到(68.9±4.05)%(圖3A)。WT IBD組和NLRP3-/-IBD組小鼠mLN中T細(xì)胞也發(fā)生了類似的變化，經(jīng)DSS處理后，WT IBD組和NLRP3-/-IBD組小鼠mLN中T細(xì)胞減少(圖3B)。與B細(xì)胞相比，經(jīng)DSS處理后NLRP3-/-IBD組小鼠PPs中T細(xì)胞比例略有增加，而NLRP3-/-IBD組小鼠mLN和WT IBD組小鼠脾臟的CD4+T細(xì)胞百分比顯著升高(圖3C)。

1：WT Control；2：WT IBD；3：NLRP3-/-Control；4：NLRP3-/-IBD；A：mLN、PPs和脾臟中CD19+ B細(xì)胞的百分比；B：mLN、PPs和脾臟中CD3+ T細(xì)胞的百分比；C：mLN、PPs和脾臟T細(xì)胞中CD4+ T淋巴細(xì)胞的百分比；n=6，*P< 0.05，**P< 0.01圖3 WT對(duì)照組、WT IBD、NLRP3-/-對(duì)照組和NLRP3-/- IBD小鼠中mLN、PPs及脾臟T細(xì)胞和B細(xì)胞亞群比例Fig.3 The proportion of T- and B-cell subsets from mLN，PPs and spleen among WT control，WT IBD，NLRP3-/- control and NLRP3-/- IBD mice

既往報(bào)道提示CD4+T輔助細(xì)胞參與了DSS誘導(dǎo)IBD的發(fā)生。為比較WT小鼠和NLRP3-/-小鼠結(jié)腸炎中CD4+T細(xì)胞的狀態(tài)，我們分別檢測(cè)小鼠CD4+T細(xì)胞各亞群比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)mLN、PPs和脾臟中DSS處理與否，不影響WT和NLRP3-/-小鼠產(chǎn)生的CD4+T細(xì)胞比例。但NLRP3-/-IBD組小鼠mLN中Th2細(xì)胞的比例(0.89±0.23)%高于NLRP3-/-對(duì)照組小鼠(0.36±0.11%)%。mLN、PPs和脾臟中IL-17+CD4+T細(xì)胞比例在WT IBD小鼠和NLRP3-/-IBD小鼠中無顯著差異；然而，WT對(duì)照組小鼠PPs和脾臟中IL-17+CD4+T細(xì)胞比例顯著高于NLRP3-/-對(duì)照組小鼠(圖4A～4C)。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，NLRP3-/-IBD組小鼠PPs和脾臟中Foxp3+Treg細(xì)胞的比例較WT IBD組顯著增加，而DSS處理前后，WT小鼠和NLRP3-/-小鼠的Foxp3+Treg細(xì)胞比例沒有明顯變化(圖4D～4F)。這些結(jié)果表明，NLRP3-/-小鼠的炎癥水平降低，可能與Treg細(xì)胞的增加有關(guān)。

2.3 NLRP3缺失會(huì)增加IL-10和Foxp3的表達(dá)

以往的研究表明細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)在炎癥性腸病病理生理學(xué)中的重要作用，這些細(xì)胞因子包括IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17等[12]。因此，本研究評(píng)估了4組小鼠血清中IFN-γ、IL-10、IL-17A、IL-1β、IL-6的含量。如圖5所示，4組小鼠的IFN-γ水平無顯著差異。DSS處理后，WT IBD組小鼠血清中IL-1β、IL-6和IL-10水平顯著升高，NLRP3-/-IBD組小鼠血清中IL-6水平顯著升高。盡管WT對(duì)照組小鼠和NLRP3-/-IBD組小鼠IL-17A沒有顯著差異，但NLRP3-/-IBD組小鼠的IL-17A表達(dá)明顯低于WT IBD組小鼠。而IL-1β僅在WT IBD組小鼠中增加，其濃度遠(yuǎn)高于WT對(duì)照組小鼠和NLRP3-/-IBD組小鼠。WT IBD組小鼠和NLRP3-/-IBD組小鼠血清中IL-6水平顯著升高，且WT IBD組小鼠中IL-6濃度幾乎是NLRP3-/-IBD組小鼠的4倍(圖5)。

綜上所述，DSS能促進(jìn)2種基因型小鼠中促炎細(xì)胞因子的分泌，而NLRP3缺失減少了大多數(shù)促炎細(xì)胞因子的分泌水平。這些結(jié)果與前面的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果一致。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證NLRP3分子對(duì)局部組織細(xì)胞因子和Foxp3蛋白表達(dá)的影響，我們采用Western blot方法檢測(cè)結(jié)腸中IL-6、IL-17A、IL-10和Foxp3的表達(dá)。結(jié)果與血清數(shù)據(jù)一致，在WT IBD小鼠和NLRP3-/-IBD小鼠中，促炎細(xì)胞因子IL-17A和IL-6較對(duì)照組顯著增加，且水平接近(圖6A和6B)，提示NLRP3在這些細(xì)胞因子的局部分泌中不占主導(dǎo)地位。NLRP3-/-IBD組小鼠結(jié)腸局部IL-10和Foxp3表達(dá)明顯高于WT IBD組小鼠，而DSS處理后WT IBD組小鼠局部IL-10和Foxp3表達(dá)增加不明顯(圖6C、6D)。這些觀察結(jié)果進(jìn)一步說明了在結(jié)腸炎情況下NLRP3在調(diào)節(jié)IL-10和Foxp3中的關(guān)鍵作用。

1：WT Control；2：WT IBD；3：NLRP3-/-Control；4：NLRP3-/-IBD；A；mLN中Th17細(xì)胞的百分比；B：PPs中Th17細(xì)胞的百分比；C：脾臟中Th17細(xì)胞百分比；D：mLN中Treg細(xì)胞百分比；E：PPs中Treg細(xì)胞百分比；F：脾臟中Treg細(xì)胞的百分比；n=6，*P< 0.05圖4 NLRP3-/- IBD小鼠PPs和脾臟中Treg細(xì)胞的比例增加Fig.4 An increasing proportion of Treg in PPs and spleen in the NLRP3-/- IBD mice

1：WT Control；2：WT IBD；3：NLRP3-/-Control；4：NLRP3-/-IBD；A：血清中IFN-γ水平；B：血清中IL-1β水平；C：血清中IL-6水平；D：血清中IL-10水平；E：血清中IL-17A水平；n=6，*P< 0.05，**P< 0.01圖5 WT對(duì)照組、WT IBD組、NLRP3-/-對(duì)照組和NLRP3-/- IBD組小鼠血清中細(xì)胞因子水平Fig.5 Cytokines levels in serum of WT control，WT IBD，NLRP3-/- control and NLRP3-/- IBD mice

1：WT Control；2：WT IBD；3：NLRP3-/-Control；4：NLRP3-/-IBD圖6 NLRP3-/-IBD組小鼠結(jié)腸中IL-10和Foxp3表達(dá)增加Fig.6 The increased IL-10 and Foxp3 expression in the colon of the colitic NLRP3-/- mice

2.4 NLRP3的缺失在體外調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞的分化

為了證明NLRP3分子對(duì)Foxp3+Treg細(xì)胞分化的直接作用，我們進(jìn)行了體外分化實(shí)驗(yàn)。從WT和NLRP3-/-小鼠脾臟中純化小鼠初始CD4+T細(xì)胞，在IL-2、TGF-β存在的情況下，被已包被的抗CD3抗體和抗CD28抗體激活。第3天，WT小鼠的Foxp3+CD25+Treg細(xì)胞百分比(42.13±3.35)%明顯低于NLRP3缺陷小鼠(61.7±3.12)%，第5天與第3天情況相似，見圖7。這一結(jié)果與我們上面結(jié)果一致，表明NLRP3分子抑制了Foxp3+CD25+Treg細(xì)胞的發(fā)育。

分別從WT和NLRP3-/-小鼠中分離出初始CD4+ T細(xì)胞，在重組IL-2(20 ng/mL)和TGF-β(5 ng/mL)的作用下，通過抗CD3抗體聯(lián)合抗CD28抗體激活細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Foxp3+CD25+ Treg細(xì)胞百分率；**P<0.01圖7 NLRP3的缺失促進(jìn)體外Treg的分化Fig.7 Deletion of NLRP3 induced Treg differentiation in vitro

3 討論

本研究利用DSS誘導(dǎo)小鼠IBD模型，探討NLRP3炎癥小體在腸道炎癥中的作用。我們的結(jié)果顯示，NLRP3缺失通過促進(jìn)Foxp3+Treg細(xì)胞的擴(kuò)增減輕了DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎。

NLRP3炎癥小體是腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)因子，但其在IBD中的作用仍存在爭(zhēng)議。早期研究報(bào)道，NLRP3缺陷小鼠的病理情況明顯比野生型小鼠輕，這與IL-1β和IL-18的低表達(dá)水平相關(guān)[5，13-14]。然而，最近有報(bào)道稱NLRP3分子具有維持結(jié)腸穩(wěn)態(tài)和抑制腸道炎癥的功能[15-17]。以往NLRP3的研究主要集中在骨髓細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞。最近，Bruchard團(tuán)隊(duì)[11]提出NLRP3在小鼠Th2細(xì)胞中不僅是一個(gè)關(guān)鍵的炎性小體成分，還是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，NLRP3的缺失不利于Th2細(xì)胞的分化。這項(xiàng)工作鼓勵(lì)我們進(jìn)一步探索NLRP3在T細(xì)胞中的作用。

在DSS誘導(dǎo)IBD小鼠模型中，NLRP3-/-小鼠癥狀較輕伴隨著PPs和脾臟中Treg細(xì)胞比例增加。此外，NLRP3缺失的初始CD4+T細(xì)胞在體外更易分化為Treg細(xì)胞。Treg細(xì)胞是一種抑制性CD4+T細(xì)胞，其特征是表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3，它們?cè)诰S持結(jié)腸穩(wěn)態(tài)和預(yù)防自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[18-20]。以往的研究表明，與非活躍期的IBD患者和對(duì)照組相比，活躍期IBD患者外周血中的Treg細(xì)胞比例降低[21-22]，F(xiàn)oxp3+Treg可能在抑制炎癥性腸病免疫相關(guān)的黏膜損傷中發(fā)揮重要作用[23]。我們的結(jié)果顯示，NLRP3的激活參與促進(jìn)腸道炎癥的進(jìn)程，初始CD4+T細(xì)胞NLRP3的缺失促進(jìn)Treg細(xì)胞的分化，參與了緩解結(jié)腸炎的過程。

腸道通過組織特異性的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)多種生理功能，細(xì)胞因子是這些細(xì)胞相互作用的關(guān)鍵介質(zhì)[22]，在生理和病理生理學(xué)中均有體現(xiàn)。IL-10是一種重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，在維持腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。IL-10、IL-10RA和IL-10RB基因突變導(dǎo)致MD-IBD，表現(xiàn)為嚴(yán)重的腸道炎癥，發(fā)病早[24]。IL-10和IL-10R缺陷小鼠都會(huì)出現(xiàn)自發(fā)性結(jié)腸炎[25-26]。我們的研究發(fā)現(xiàn)在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中，與WT小鼠相比，NLRP3-/-小鼠血清和腸道中表達(dá)更多的IL-10，且NLRP3缺陷小鼠的炎癥進(jìn)展要比WT小鼠慢。因此，我們的研究提示，通過NLRP3炎癥小體途徑促進(jìn)Treg細(xì)胞分化，從而減緩結(jié)腸炎可能是炎癥性腸病新的治療靶點(diǎn)。