田 靜， 汪德海， 姚念杰

安徽省淮北市人民醫(yī)院眼科，淮北 235000

早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity，ROP)多在早產(chǎn)兒和低體重兒中發(fā)生[1]，早產(chǎn)兒及新生兒處于高氧環(huán)境時，促血管生長因子減少，導(dǎo)致ROP早期血管發(fā)育停滯，視網(wǎng)膜局部缺血、缺氧，進(jìn)一步又促進(jìn)大量促血管生長因子產(chǎn)生，導(dǎo)致視網(wǎng)膜邊緣區(qū)域的血管增生異常，ROP進(jìn)展至二期[2]。

硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是一種重要的氣體信號分子，在哺乳動物體內(nèi)，內(nèi)源性H2S主要通過胱硫醚-β合酶(cystathionine β synthase，CBS)和胱硫醚γ裂解酶(cystathionine γ lyase，CSE)催化L-半胱氨酸產(chǎn)生，CBS和CSE具有組織特異性，研究表明CSE主要存在于視網(wǎng)膜，CBS則主要在角膜表達(dá)[3]，提示內(nèi)源性H2S可能通過視網(wǎng)膜血管參與視網(wǎng)膜的正常生理反應(yīng)。ROP的發(fā)生及進(jìn)展過程中，轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)也參與血管生成的調(diào)節(jié)，TGF-β1為TGF-β超家族成員，TGF-β1對血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用是多效的，其對血管生成促進(jìn)或抑制作用與血管內(nèi)皮細(xì)胞來源、配體濃度、細(xì)胞密度等多種因素相關(guān)[4]。研究表明在糖尿病小鼠視網(wǎng)膜組織及血管內(nèi)皮細(xì)胞中，TGF-β1表達(dá)升高[5]。

當(dāng)前針對ROP的治療多集中于ROP二期，針對ROP早期病變尚未見有效干預(yù)措施，而多項(xiàng)研究表明H2S可介導(dǎo)TGF-β1的表達(dá)，基于此，本研究構(gòu)建新生大鼠氧誘導(dǎo)模型、高氧/低氧刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)，探討H2S能否通過介導(dǎo)TGF-β1表達(dá)在ROP早期血管發(fā)育中發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SD大鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，HUVEC購自中科院上海細(xì)胞庫，胎牛血清購自美國Gibco公司，RPMI 1640培養(yǎng)液購自美國Hyclon公司，H2O2、CoCl2、NaHS購自美國Sigma Aldrich公司，TGF-β1(批號3709)購自美國CST公司，p-Smad 2/3(批號ab272332)購自美國ABCAM公司，GAPDH、羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG、ECL液、BSA購自美國Thermo公司，CSE酶ELISA檢測試劑盒購自美國R&D Systems公司，Transwell小室模型購自美國Corning公司，主要實(shí)驗(yàn)儀器為酶標(biāo)儀(BIO-RAD，美國)、超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀(GE，美國)、病理切片機(jī)(徠卡，德國)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

MTT法，CSE酶測定方法，Transwell實(shí)驗(yàn)方法，詳細(xì)步驟見參考文獻(xiàn)[6-8]。

1.2.1 高氧/低氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變大鼠模型構(gòu)建[9]實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)淮北市人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，取生育齡SD大鼠按3∶1雌雄比合籠，雌鼠晨起見陰道栓子判斷其懷孕，將孕鼠單獨(dú)飼養(yǎng)，孕鼠生育后將新生鼠隨機(jī)分為ROP組及對照組，每組各30只。將ROP組新生鼠置于自控氧氣箱中，設(shè)置氧氣濃度為50%，24 h后將氧氣濃度調(diào)整為10%，維持24 h，此為高氧/低氧誘導(dǎo)一個循環(huán)，完成7個循環(huán)即新生鼠出生后14 d后終止實(shí)驗(yàn)，對照組新生鼠置于常氧環(huán)境下常規(guī)飼養(yǎng)至出生后14 d。

1.2.2 組織標(biāo)本取材 新生鼠14 d后腹腔注射足量水合氯醛，處死新生大鼠，迅速剪開大鼠左胸，于大鼠左心室心尖搏動處采用足量甲醛溶液緩慢灌注，隨后進(jìn)行取材，剪開新生鼠眼周圍皮膚，小心對眼球周圍結(jié)締組織進(jìn)行游離，采用眼科手術(shù)剪將眼球后方的視神經(jīng)、血管、眼周圍結(jié)締組織剪斷，小心清理眼球周圍殘余結(jié)締組織，隨后進(jìn)行包埋，常規(guī)HE染色，免疫組化法測TGF-β1表達(dá)。另取未灌注甲醛溶液新生大鼠，小心取出眼球，剝離視網(wǎng)膜血管組織，ELISA法測定CSE酶活性，Western blot法檢測p-Smad 2/3、TGF-β1表達(dá)水平。

1.2.3 高氧/低氧誘導(dǎo)HUVEC建立[10]配制含50 μmol/L H2O2、10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液作為高氧誘導(dǎo)培養(yǎng)液，配制含50 μmol/L CoCl2、10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液作為低氧誘導(dǎo)培養(yǎng)液，6孔培養(yǎng)板中HUVEC鋪滿至2/3時，去除含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，隨后加入高氧誘導(dǎo)培養(yǎng)液，于二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育15 min，除去高氧誘導(dǎo)培養(yǎng)液，加入低氧誘導(dǎo)培養(yǎng)液，于二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育4 h，此為高氧/低氧誘導(dǎo)1個循環(huán)，4個循環(huán)后HUVEC接近生長抑制，以模擬早產(chǎn)ROP病變高氧/低氧刺激。

1.2.4 Western blot法檢測 采集視網(wǎng)膜血管組織、收集6孔培養(yǎng)板中采用藥物處理后的HUVEC，提取組織及細(xì)胞蛋白，采用BCA法測定蛋白裂解液中的蛋白濃度，稀釋蛋白裂解液，配制含溴酚藍(lán)的上樣緩沖液，上樣，采用SDS-PAGE凝膠電泳，待藍(lán)色條帶至凝膠底部時，終止電泳。轉(zhuǎn)移凝膠中的蛋白至PVDF膜，TBST清洗3次，每次5 min，加一抗，4℃孵育過夜，TBST清洗3次×5 min，5%BSA封閉1 h，TBST清洗3次，每次5 min，加入二抗，室溫孵育1 h，TBST清洗3次，每次5 min，加ECL發(fā)光液顯影，目的條帶的吸光度值采用ImageQuant TL軟件分析處理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 視網(wǎng)膜血管組織及H2S濃度變化

ROP組HE染色切片中突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞較多，而對照組中突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞極少見或未見，詳見圖1A、1B。測定血管組織CSE酶活性，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算H2S濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ROP組視網(wǎng)膜血管組織H2S生成高于對照組，詳見圖1C。

A：對照組視網(wǎng)膜血管增生情況(HE染色，×400)；B：ROP組視網(wǎng)膜血管增生情況(HE染色，×400)；C：視網(wǎng)膜血管組織H2S生成情況圖1 視網(wǎng)膜血管組織及H2S濃度變化Fig.1 The changes of retinal vascular tissue and H2S concentration

2.2 視網(wǎng)膜血管組織TGF-β1信號通路表達(dá)水平

ROP組免疫組化染色切片中視網(wǎng)膜血管組織TGF-β1表達(dá)較少，而對照組中TGF-β1表達(dá)較高，詳見圖2A。Western blot法檢測視網(wǎng)膜血管組織中TGF-β1、pSmad 2/3表達(dá)水平，結(jié)果顯示ROP組視網(wǎng)膜血管組織中TGF-β1、pSmad 2/3表達(dá)水平較對照組低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，詳見圖2B、2C。

2.3 外源性H2S對HUVEC增殖的影響

我們采用外源性H2S供體NaHS(0～100 μmol/L)處理ROP組HUVEC 24 h，提示NaHS濃度10 μmol/L處理時約有50%ROP組HUVEC存活，詳見圖3A；進(jìn)一步采用NaHS濃度10 μmol/L處理0～42 h，結(jié)果提示24 h時約有50%ROP組HUVEC存活，詳見圖3B；隨后采用NaHS(10 μmol/L)處理ROP組HUVEC 24 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ROP組HUVEC生存率低于對照組HUVEC。對照組中采用NaHS處理的HUVEC細(xì)胞生存率高于未經(jīng)處理的細(xì)胞，ROP組中采用NaHS處理的HUVEC細(xì)胞生存率高于未經(jīng)處理的細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見圖3C。

2.4 外源性H2S對HUVEC遷移能力的影響

我們采用Transwell小室模型觀察NaHS(10 μmol/L)處理24 h后HUVEC的遷移能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組細(xì)胞中NaHS處理后遷移到另一側(cè)膜的細(xì)胞數(shù)明顯升高，ROP組中NaHS處理后的細(xì)胞同樣觀察到此現(xiàn)象，詳見圖4A～D。進(jìn)一步采用圖像分析軟件計(jì)算細(xì)胞數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ROP組HUVEC遷移細(xì)胞數(shù)低于對照組HUVEC。對照組中經(jīng)NaHS處理后的細(xì)遷移細(xì)胞數(shù)高于未經(jīng)處理的細(xì)胞數(shù)，ROP組中經(jīng)NaHS處理后的遷移細(xì)胞數(shù)高于未經(jīng)處理的細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，詳見圖4E。

2.5 外源性H2S對HUVEC中TGF-β1信號通路的影響

Western blot法檢測NaHS(10 μmol/L)處理24 h后對HUVEC中TGF-β1、pSmad 2/3表達(dá)水平的影響，結(jié)果顯示ROP組HUVEC中TGF-β1、pSmad 2/3表達(dá)水平較對照組低，進(jìn)一步采用圖像分析軟件分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ROP組HUVEC中TGF-β1、pSmad 2/3表達(dá)水平低于對照組HUVEC。對照組中經(jīng)NaHS處理后的TGF-β1、pSmad 2/3表達(dá)水平低于未經(jīng)處理的細(xì)胞數(shù)，ROP組中經(jīng)NaHS處理后的TGF-β1、pSmad 2/3表達(dá)水平低于未經(jīng)處理的細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，詳見圖5。

A：兩組視網(wǎng)膜血管TGF-β1表達(dá)水平(免疫組化染色，×400)；B：Western blot法檢測視網(wǎng)膜血管組織TGF-β1、pSmad 2/3表達(dá)；C：圖像分析軟件分析視網(wǎng)膜血管組織TGF-β1、pSmad 2/3表達(dá)圖2 視網(wǎng)膜血管組織及TGF-β1信號通路表達(dá)水平變化Fig.2 The changes of retinal vascular tissues and expression of TGF-β1 signaling pathway

A：不同濃度NaHS處理對HUVEC增殖的影響；B：NaHS不同處理時間對HUVEC增殖的影響；C：經(jīng)10 μmol/L NaHS處理24 h對HUVEC增殖的影響圖3 外源性H2S對HUVEC增殖的影響Fig.3 Effect of exogenous H2S on HUVEC proliferation

A：對照組+NaHS；B：對照組；C：ROP組+ NaHS；D：ROP組；E：NaHS處理對HUVEC遷移細(xì)胞數(shù)目的影響圖4 外源性H2S對HUVEC遷移能力的影響Fig.4 Effect of exogenous H2S on immigration ability of HUVEC

A：Western blot法檢測HUVEC中TGF-β1、pSmad 2/3表達(dá)；B：圖像分析軟件分析HUVEC中TGF-β1、pSmad 2/3表達(dá)；①ROP組+ NaHS；②ROP組；③對照組+NaHS；④對照組圖5 外源性H2S對HUVEC中TGF-β1信號通路的影響Fig.5 Effect of exogenous H2S on TGF-β1 signaling pathway in HUVEC

3 討論

隨著早產(chǎn)兒存活率的提高，ROP的發(fā)病率也呈上升趨勢，研究表明我國體重<2 kg或胎齡<34周的早產(chǎn)兒或者因疾病接受氧療超過5 d的新生兒中，ROP發(fā)生率為15.2%[11]。ROP發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，胎兒在子宮內(nèi)時，其動脈氧分壓約為30 mmHg，而常氧狀態(tài)時，早產(chǎn)兒及新生兒動脈氧分壓約為55～80 mmHg[12]。由于高氧環(huán)境，ROP早期視網(wǎng)膜血管生成受抑，血管生長停滯，誘發(fā)視網(wǎng)膜缺氧，進(jìn)一步促進(jìn)氧調(diào)節(jié)因子表達(dá)，刺激視網(wǎng)膜形成新生血管即ROP二期[13]。H2S作為內(nèi)源性氣體信號分子參與抗缺血性損傷，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制細(xì)胞凋亡等多種病理生理反應(yīng)[14]。研究表明，哺乳動物中晶狀體、虹膜、角膜、視網(wǎng)膜等眼內(nèi)組織均能生成內(nèi)源性H2S，其中角膜及視網(wǎng)膜生成水平較高，而視網(wǎng)膜中存在CSE表達(dá)[15]。ROP早期H2S是否參與視網(wǎng)膜血管生成的調(diào)節(jié)值得研究，本項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)大鼠ROP模型視網(wǎng)膜血管組織中H2S生成高于對照組，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)ROP組HUVEC的增殖能力低于正常HUVEC，采用外源性H2S供體NaHS處理后ROP組HUVEC增殖能力高于未經(jīng)處理的HUVEC，上述結(jié)果提示ROP早期視網(wǎng)膜血管組織中內(nèi)源性H2S生成增加，這可能與病理狀態(tài)下代償性增加H2S生成以保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)。

ROP的發(fā)生及進(jìn)展與視網(wǎng)膜血管發(fā)育密切相關(guān)，研究表明，胚胎發(fā)育中TGF-β1及其下游信號通路激活能夠調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育[16]。胚胎發(fā)育中視網(wǎng)膜為腦的衍生器官，研究表明視網(wǎng)膜深層血管發(fā)育進(jìn)程中TGF-β1及其下游信號通路激活能夠促進(jìn)視網(wǎng)膜深層血管的正常發(fā)育[17]。本項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)D14大鼠ROP模型中突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞較對照組多，采用免疫組化技術(shù)發(fā)現(xiàn)ROP組視網(wǎng)膜血管組織TGF-β1表達(dá)較對照組少，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)ROP組視網(wǎng)膜血管組織中TGF-β1、pSmad 2/3表達(dá)水平較對照組低。上述結(jié)果提示高氧/低氧誘導(dǎo)產(chǎn)生的大鼠ROP模型其TGF-β1及其下游信號通路的抑制對視網(wǎng)膜血管發(fā)育產(chǎn)生影響。

TGF-β1通過與不同的TGF-β受體結(jié)合，能夠發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)效應(yīng)，抑制TGF-β1及其下游信號通路可降低細(xì)胞凋亡，改善氧化應(yīng)激水平[18]。研究表明，H2S可通過下調(diào)TGF-β1及其下游信號通路對血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用[19]。本項(xiàng)研究中，我們發(fā)現(xiàn)對照組HUVEC遷移能力高于ROP組HUVEC。對照組中經(jīng)NaHS處理后的遷移細(xì)胞數(shù)高于未經(jīng)處理的細(xì)胞，ROP組中經(jīng)NaHS處理后的遷移細(xì)胞數(shù)高于未經(jīng)處理的細(xì)胞，提示外源性H2S可改善高氧/低氧誘導(dǎo)造成的HUVEC遷移能力降低。在TGF-β1及其下游信號通路中Smad 2/3為重要蛋白，Smad 2/3能夠促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成相關(guān)蛋白表達(dá)及膠原沉積[20]。進(jìn)一步我們采用Western blot法檢測外源性H2S對TGF-β1及其下游重要蛋白Smad 2/3的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ROP組HUVEC中TGF-β1、pSmad 2/3表達(dá)水平低于對照組HUVEC。對照組中經(jīng)NaHS處理后的TGF-β1、pSmad 2/3表達(dá)水平低于未經(jīng)處理的細(xì)胞數(shù)，ROP組中經(jīng)NaHS處理后的TGF-β1、pSmad 2/3表達(dá)水平低于未經(jīng)處理的細(xì)胞。本項(xiàng)研究結(jié)果提示外源性H2S可以改善高氧/低氧誘導(dǎo)HUVEC的增殖和遷移能力，下調(diào)TGF-β1、pSmad 2/3的表達(dá)水平，說明H2S可能通過介導(dǎo)TGF-β1信號通路參與視網(wǎng)膜血管病變早期的血管發(fā)育。

我們的研究證明了在早期ROP病變中，H2S在視網(wǎng)膜血管發(fā)育早期可能扮演關(guān)鍵角色，其機(jī)制與介導(dǎo)TGF-β1及其下游信號通路相關(guān)。然而TGF-β1與ALK1、ALK5這2種不同受體的結(jié)合對血管發(fā)育的作用是雙相的，既可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，也可以抑制其增殖及遷移[21]。此外在ROP進(jìn)展過程中，涉及血管內(nèi)皮細(xì)胞及周細(xì)胞，H2S在其中的機(jī)制及其對TGF-β1信號通路的調(diào)節(jié)有待進(jìn)一步研究。