王曉平， 黃 斌， 馬 帥， 黃 睿， 李曉佳

四川省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，成都 610072

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是最常見的神經(jīng)退行性疾病，以漸進(jìn)性的認(rèn)知功能障礙及行為損害為典型的臨床特征[1-2]。目前對阿爾茨海默病尚無特效治療藥物。臨床有采用免疫抑制劑治療阿爾茨海默病的報道，且取得一定療效。免疫抑制劑中較為典型的是嗎替麥考酚酯(mycophenolate mofetil)，但免疫抑制劑治療阿爾茨海默病的機理仍不明確[3]。報道顯示自噬活性降低是阿爾茨海默病的特點之一，自噬通路相關(guān)蛋白中研究較為明確的是微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3)與Beclin-1蛋白，2種蛋白在阿爾茨海默病患者腦內(nèi)呈低表達(dá)[4-5]，嗎替麥考酚酯治療阿爾茨海默病對自噬是否存在影響，較少報道。本研究制備阿爾茨海默病大鼠模型，觀察免疫抑制劑治療對阿爾茨海默病的療效及對2種自噬蛋白表達(dá)的影響，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SD大鼠，體質(zhì)量(250±30)g，購于北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，合格證號：SCXK-(軍)2012-0004。溫度(25±5)℃，相對濕度(40±10)%下，所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實驗。

1.2 受試藥、儀器和試劑

嗎替麥考酚酯膠囊(無錫福祈制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字：H20080642，規(guī)格：0.25 g/片，以C23H31NO7計)；多奈哌齊片[衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字：H20050978，規(guī)格：5 mg/片]；DW-5型大鼠腦立體定位儀(成都泰盟科技有限公司)；Morris水迷宮(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)；FluoView FV1200激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司)；ChemiDocTMXRS+凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；兔抗鼠LC3、Beclin-1和β-actin(美國Abcam公司)；Aβ25-35(美國Sigma公司)。

1.3 制備阿爾茨海默病大鼠模型、分組及給藥

采用戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠，將頭部固定在立體定位儀上，剪開頭部皮膚，暴露顱骨，定位前囟，于前囟后1.5 mm及旁開0.8 mm定位側(cè)腦室，顱骨鉆鉆孔，骨窗直徑約2 mm，將2 μL凝聚態(tài)Aβ25-35以微量注射器緩慢進(jìn)針，深度4 mm，回退1 mm，緩慢注射5 min，留針5 min，退針并縫合皮膚，碘伏消毒皮膚。對照組在側(cè)腦室注射生理鹽水2 μL，注射方式同前。存活大鼠用于實驗。將制備的阿爾茨海默病大鼠隨機分為4組：模型組、嗎替麥考酚酯高劑量組、嗎替麥考酚酯低劑量組和陽性藥組，每組10只。除對照組和模型組給予生理鹽水，嗎替麥考酚酯高劑量組(0.8 g/kg)、嗎替麥考酚酯低劑量組(0.4 g/kg)和陽性藥組(多奈哌齊0.5 mg/kg)在大鼠清醒后給藥，所有大鼠均連續(xù)灌胃給藥4周。

1.4 識別實驗

不透明檢測箱，規(guī)格80 cm×60 cm×60 cm，將大鼠進(jìn)行3個階段的訓(xùn)練：適應(yīng)階段、訓(xùn)練階段與檢測階段。適應(yīng)階段：將大鼠置于無任何物體的檢測箱內(nèi)，自由活動5 min，放回籠中；24 h后進(jìn)入訓(xùn)練階段：在檢測箱內(nèi)放置2個相同的物體，將大鼠背對2物體置于檢測箱內(nèi)，大鼠熟悉2個物體，10 min后，取出大鼠；24 h后進(jìn)入檢測階段：將檢測箱內(nèi)的2物體中的1個換為不同形狀的新物體，將大鼠再次放入檢測箱內(nèi)5 min，記錄大鼠用鼻子湊近新物體≤ 1 cm的范圍或舔咬或用身體擦蹭新物體的時間，即為大鼠對新物體和舊物體的探索時間。以識別指數(shù)(discrimination index，DI)來評價大鼠對2個不同測試物體的探索時間，計算公式：DI=(N-F)/(N + F)×100%，N：大鼠探索新物體所耗費的時間，F(xiàn)：大鼠探索熟悉物體所耗費的時間。每次每只大鼠放入檢測箱后，都用75%乙醇溶液擦拭檢測箱和2個物體。

1.5 水迷宮實驗

水迷宮桶內(nèi)注入溫度(24±2)℃的清水，水面高于平臺2 cm，滴加藍(lán)黑墨水，排除視覺干擾。于水桶上緣，等距離劃分4個入水點，將大鼠面向池壁從其中一個入水點放入水中，記錄大鼠游到平臺并站在平臺的時間，即為逃避潛伏期，若尋找平臺時間超過120 s，記錄逃避潛伏期記為120 s，放回籠中。每天每只大鼠記錄逃避潛伏期1次，連續(xù)5 d，記錄5 d的逃避潛伏期及5 d的游泳距離，取均值。第6天撤去平臺，任選一個入水點將大鼠置于水中，記錄大鼠60 s內(nèi)穿越原平臺位置的次數(shù)，用以檢測大鼠對原平臺的記憶。

1.6 Tunel染色

行為學(xué)實驗結(jié)束后，大鼠斷頭取腦，冰上分離海馬組織并提取蛋白，剩余的腦組織采用水合氯醛固定，經(jīng)30%蔗糖沉降48 h后，用振動切片機制備30 μm小腦組織切片，用于Tunel染色，光鏡下觀察小腦細(xì)胞凋亡情況。

1.7 Western blot檢測

取“1.6 Tunel染色”項下從海馬組織提取的蛋白行Western blot檢測，制膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵LC3和Beclin-1一抗，工作濃度均為1∶1000，內(nèi)參為β-actin(工作濃度為1∶200)，過夜、二抗室溫1 h，將膜置于凝膠成像儀中，加入ECL發(fā)光劑，曝光顯影，采用Image J軟件分析LC3和Beclin-1蛋白表達(dá)情況。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，識別實驗指標(biāo)及水迷宮指標(biāo)等計量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，各組均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間均數(shù)比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的識別指數(shù)、潛伏期、游泳距離及穿環(huán)次數(shù)比較

與對照組比較，模型組的識別指數(shù)和穿環(huán)次數(shù)明顯降低(均P<0.05)，潛伏期和游泳距離明顯增高(均P<0.05)；與模型組比較，嗎替麥考酚酯低劑量組、高劑量組和陽性藥組的識別指數(shù)和穿環(huán)次數(shù)明顯增高(均P<0.05)，潛伏期和游泳距離明顯降低(均P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠的識別指數(shù)、潛伏期、游泳距離及穿環(huán)次數(shù)比較Table 1 Comparison of recognition index，latency，swimming distance and frequency of piercing cycles of rats in each

2.2 各組大鼠的小腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況

鏡下顯示，凋亡的小腦神經(jīng)細(xì)胞呈棕色。與對照組比較，模型組凋亡的小腦神經(jīng)細(xì)胞明顯增多；與模型組比較，嗎替麥考酚酯低劑量組、高劑量組和陽性藥組凋亡的小腦神經(jīng)細(xì)胞有明顯減少；免疫抑制組中，凋亡的小腦神經(jīng)細(xì)胞呈劑量依賴性降低趨勢。見圖1。

A：對照組；B：模型組；C：嗎替麥考酚酯低劑量組；D：嗎替麥考酚酯高劑量組；E：陽性藥組圖1 各組大鼠小腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡TUNEL染色(×200)Fig.1 Detection of cerebellar nerve cell apoptosis by Tunel staining in rats of each group(×200)

2.3 各組大鼠海馬的自噬蛋白表達(dá)

與對照組比較，模型組大鼠海馬的Beclin-1和LC3表達(dá)明顯降低(均P<0.05)；與模型組比較，嗎替麥考酚酯低劑量組、高劑量組和陽性藥組Beclin-1和LC3表達(dá)明顯增高(均P<0.05)，且嗎替麥考酚酯低劑量組、高劑量組存在劑量依賴性趨勢，見表2和圖2。

表2 各組大鼠海馬的自噬蛋白表達(dá)Table 2 Expression of autophagy protein in hippocampus of rats in each

1：對照組；2：模型組；3：嗎替麥考酚酯低劑量組；4：嗎替麥考酚酯高劑量組；5：陽性藥組圖2 各組大鼠海馬Beclin-1和LC3表達(dá)Fig.2 Expression of Beclin-1 and LC3 in hippocampus of rats in each group

3 討論

本研究通過側(cè)腦室注射Aβ25-35制作阿爾茨海默病大鼠模型，分別采用識別實驗及水迷宮實驗檢測阿爾茨海默病大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，結(jié)果顯示與進(jìn)行假手術(shù)的對照組大鼠比，阿爾茨海默病大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力顯著降低，表現(xiàn)出明顯的認(rèn)知障礙，表明阿爾茨海默病大鼠模型可用于研究。

自噬是一種存在于真核細(xì)胞中的細(xì)胞代謝現(xiàn)象，通過降解錯誤折疊及老化的蛋白質(zhì)，維持細(xì)胞內(nèi)代謝環(huán)境穩(wěn)定。但自噬過度或自噬損傷等自噬異常時反而對細(xì)胞功能帶來不利影響。大量研究顯示，自噬異常間接地為有害物質(zhì)損傷神經(jīng)提供了保護(hù)，因此自噬異常參與了很多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展過程，如阿爾茨海默病、帕金森癥及亨廷頓病。阿爾茨海默病重要的神經(jīng)病理特點之一是大腦存在顯著Aβ蛋白沉積，且Aβ蛋白積聚程度與阿爾茨海默病的嚴(yán)重程度緊密關(guān)聯(lián)[6-8]。研究顯示阿爾茨海默病患者及阿爾茨海默病動物模型腦組織中可編碼Beclin-1蛋白的Beclin-1基因含量降低，Beclin-1基因轉(zhuǎn)錄減少及其蛋白表達(dá)缺失，致使自噬水平及活性降低，自噬體形成減少，Aβ蛋白生成而不被降解，形成異常沉積，最終導(dǎo)致阿爾茨海默病。可見Beclin-1減少與自噬缺陷及阿爾茨海默病發(fā)病緊密關(guān)聯(lián)[9-11]。LC3是定位于自噬泡內(nèi)膜的自噬調(diào)節(jié)蛋白，細(xì)胞啟動自噬，LC3前體被加工為LC3-Ⅰ并溶在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，LC3-Ⅰ與自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合生成LC3-Ⅱ，并定位于自噬泡膜，發(fā)揮調(diào)節(jié)功能，故LC3蛋白表達(dá)可直接反映細(xì)胞自噬活性[12-13]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，阿爾茨海默病模型大鼠海馬的Beclin-1和LC3蛋白表達(dá)明顯降低，提示阿爾茨海默病大鼠海馬組織的自噬功能或活性降低，與報道結(jié)果類似。

嗎替麥考酚酯屬于免疫抑制劑，藥代動力學(xué)顯示，嗎替麥考酚酯屬于前體藥物，進(jìn)入人體后水解為霉酚酸而發(fā)揮免疫抑制的功效。有研究報道采用嗎替麥考酚酯可有效地控制阿爾茨海默病病情的進(jìn)一步發(fā)展[14]。本研究結(jié)果顯示，給予阿爾茨海默病大鼠嗎替麥考酚酯連續(xù)4周，大鼠的識別實驗及水迷宮實驗均獲得較好的結(jié)果，且存在嗎替麥考酚酯劑量依賴性關(guān)系，提示嗎替麥考酚酯具有改善阿爾茨海默病大鼠認(rèn)知障礙的效果。

通過進(jìn)一步檢測嗎替麥考酚酯對大鼠小腦凋亡細(xì)胞及海馬自噬蛋白表達(dá)的結(jié)果顯示，與阿爾茨海默病模型大鼠比較，嗎替麥考酚酯可緩解大鼠小腦細(xì)胞凋亡，增高阿爾茨海默病大鼠海馬Beclin-1和LC3蛋白表達(dá)，提示嗎替麥考酚酯有助于提高阿爾茨海默病大鼠在海馬區(qū)的自噬活性。報道顯示，Aβ蛋白積聚可促使炎癥反應(yīng)，腦內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞可被激活，參與體內(nèi)某種免疫應(yīng)答反應(yīng)，分泌大量的炎性因子，如白介素-6(interleukin-6，IL-6)和干擾素(interferon-γ，IFN-γ)，進(jìn)而介導(dǎo)神經(jīng)炎性反應(yīng)[15-16]，導(dǎo)致阿爾茨海默病發(fā)生發(fā)展。嗎替麥考酚酯可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活性[17]，小膠質(zhì)細(xì)胞活性與Beclin-1和LC3蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。我們在實驗中觀察到嗎替麥考酚酯對Beclin-1和LC3蛋白表達(dá)的干預(yù)效果可能與抑制小膠質(zhì)細(xì)胞有關(guān)。但嗎替麥考酚酯對Beclin-1和LC3蛋白表達(dá)的干預(yù)機制仍需更多的進(jìn)一步實驗研究。

綜上所述，嗎替麥考酚酯可以改善阿爾茨海默病大鼠的學(xué)習(xí)認(rèn)知能力，其機制可能與增強自噬水平和提高自噬蛋白Beclin-1和LC3表達(dá)相關(guān)，具體作用機制仍需進(jìn)一步研究。