李 芮 綜述 唐旭東 審校

1 骨髓衰竭的分子診斷

新一代測(cè)序(next-generation sequencing，NGS)已經(jīng)對(duì)體細(xì)胞的大量基因和生殖系突變進(jìn)行了篩選，這些基因的改變構(gòu)成了髓樣腫瘤如骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome,MDS)和典型的非克隆性骨髓衰竭綜合征如再生障礙性貧血(aplastic anemia,AA)的主要致病原因。體細(xì)胞突變?cè)谂R床管理中最明顯的應(yīng)用是可以更精確、更客觀地對(duì)疾病實(shí)體進(jìn)行分類或預(yù)測(cè)、并且在靶向藥物開發(fā)和個(gè)性化治療方面具有應(yīng)用價(jià)值。與經(jīng)典的X染色體滅活研究相比，體細(xì)胞突變可以作為克隆標(biāo)記來定量克隆性造血。全外顯子組測(cè)序的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以全面分析突變的多樣性和負(fù)荷，包括伴隨突變和驅(qū)動(dòng)突變。體細(xì)胞染色體畸變可以獲得性基因組損害的突變總量，可以作為另一種度量形式。連續(xù)的NGS能夠重建個(gè)體病例和動(dòng)態(tài)的克隆結(jié)構(gòu)(如微小殘留疾病監(jiān)測(cè)白血病的治療效果)[1-5]。

2 MDS中體細(xì)胞突變和克隆結(jié)構(gòu)

從理論上講，MDS可能也存在如急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)的基因亞型。然而，體細(xì)胞突變譜的多樣性和明顯缺乏亞型特異性[6-8]，導(dǎo)致MDS的體細(xì)胞突變譜分類非常困難，這要除外一些具有診斷性分子異常的體細(xì)胞突變?nèi)鏡UNX1、DDX41和CEBPA[9-11]和一些重現(xiàn)性分子異常如t(8;21) AML[12]。雖然存在以上問題，體細(xì)胞突變譜仍然在MDS中進(jìn)行推廣應(yīng)用，并以形態(tài)學(xué)作為MDS診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。早期事件也稱為生殖系事件，根據(jù)此定義，它們既可以是克隆的(如在遺傳性白血病中所見)，也可以是非克隆的。MDS的一些基因突變是亞克隆的，而另一些基因突變可以是生殖系或亞克隆的。

初發(fā)AML中出現(xiàn)的特異性基因突變可能一直存在，從而導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)。最初的基因突變可能普遍存在，并不能早期預(yù)測(cè)疾病的發(fā)生，而某些次級(jí)次克隆事件卻可能有預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展的作用。例如，在早期TET2突變后第2次發(fā)生的亞克隆TET2突變將導(dǎo)致骨髓增殖性疾病。同樣，一些生殖系基因(如CEBPA、TP53和EVI1)可使剩余等位基因失活[13-16]。

一般來說，MDS可以通過克隆造血來啟動(dòng)，現(xiàn)在可以通過某些基因(包括DNMT3A、TET2、SF3B1等)的克隆突變來識(shí)別[17-18]。這種情況通常是無癥狀的，現(xiàn)在被稱為潛質(zhì)未定的克隆造血(clonal hematopoiesis of indeterminate potential， CHIP)。最終CHIP可能會(huì)產(chǎn)生不利影響。CHIP患病率隨著年齡的增長(zhǎng)而增加，盡管某些基因突變(如TET2)在老年人中的比例過高，而非典型DNMT3A突變構(gòu)成了CHIP病變的主要部分。雖然所有的早期病變似乎都是由衰老因素導(dǎo)致的，但有些體細(xì)胞突變更容易引起無癥狀CHIP的疾病進(jìn)展。對(duì)于某些體細(xì)胞突變來說，它們?cè)诳寺〗Y(jié)構(gòu)體系中的位置可能對(duì)預(yù)后的影響很大，而對(duì)于其他體細(xì)胞突變，它們?cè)诳寺〗Y(jié)構(gòu)體系中的位置并不那么重要。

迄今為止，可用的診斷和預(yù)后信息基于幾項(xiàng)大型研究(表1)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)臨床相關(guān)的預(yù)后信息和各種體細(xì)胞突變的聯(lián)系，如TP53、RAS基因家族、SETBP1和DNMT3A[6-8,19-21]。值得注意的是，個(gè)體突變可能具有不同的預(yù)后影響，特定突變的存在越來越多地決定了可能的治療選擇(如IDH1突變和AG-120；IDH2突變和AG-221；UTX突變和EZH2抑制劑；雜合TET2突變和5-氮雜胞苷/維生素C(可能)；DNMT3A突變和S-腺苷甲硫氨酸(可能)；JAK2 、CSF3R突變和魯索利替尼；cKIT突變和阿西替尼和達(dá)沙替尼；Del 5q-和來那度胺；剪接體因子突變和H3B-8800)[22-24]。但在大多數(shù)情況下，單純基因突變還不能確保疾病診斷的準(zhǔn)確性。因此，與形態(tài)學(xué)金標(biāo)準(zhǔn)完全匹配的分子診斷模式尚未成功建立，當(dāng)然未來的疾病分類方案可能更多地依賴于分子突變的劃分而不是形態(tài)學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)。

表1 骨髓衰竭的主要突變分析研究

3 AA和PNH中的體細(xì)胞突變和克隆結(jié)構(gòu)

從理論上講，正常的造血干細(xì)胞池(hematopoietic stem cell, HSC)的縮小可能導(dǎo)致寡核苷酸產(chǎn)生。例如，AA的克隆性染色體異?？梢远虝撼霈F(xiàn)，因?yàn)樗鼈兛梢栽诨謴?fù)正常造血過程中通過正常HSC池的再擴(kuò)張來緩解[25]?；贜GS的深度突變分析顯示，以體細(xì)胞突變事件為特征的克隆可能會(huì)間歇性出現(xiàn)。相應(yīng)克隆的變化可能取決于體細(xì)胞突變的類型[19]。初始呈現(xiàn)的某些克隆突變可以修復(fù)為正常克隆，或它們被選擇和擴(kuò)增，向相反方向發(fā)展，演進(jìn)為MDS或PNH。通過流式細(xì)胞術(shù)鑒定PNH克隆，從而推斷出AA克隆突變的存在[26]。

深度測(cè)序表明，PNH不是嚴(yán)格的單基因突變導(dǎo)致的。此外，一些PNH克隆顯示出更復(fù)雜的亞克隆結(jié)構(gòu)，這不僅涉及PIGA突變，還涉及典型MDS的其他骨髓基因突變。PNH的外在免疫選擇理論并不能完全解釋克隆演化的所有方面。例如，即使在免疫抑制劑治療后，一些患者的克隆擴(kuò)增仍在繼續(xù)，而其他患者的PNH克隆保持穩(wěn)定。已經(jīng)觀察到一些生殖系突變?nèi)鏟IGA突變和各種基因的亞克隆突變，類似于MDS突變[27]。在某些情況下，PIGA突變克隆與以嵌合體形式的其他突變克隆共存。

AA進(jìn)展為MDS可以視作骨髓衰竭疾病的嚴(yán)重并發(fā)癥，在臨床上有著重要的治療意義，10年內(nèi)發(fā)生率為10%～20%[16,25-26]。大多數(shù)從AA演變而來的繼發(fā)性MDS的特征是獲得單體性7，通常是單個(gè)染色體畸變，提示預(yù)后不良[28]。如果骨穿無法獲取足夠的骨髓細(xì)胞數(shù)，單核苷酸多態(tài)性分析可能更有幫助[16]。在具有和不具有UPD6p的患者中發(fā)現(xiàn)了各種體細(xì)胞突變，如移碼、無義和剪接位點(diǎn)突變，表明免疫選擇(可能類似于PNH)可以導(dǎo)致HLA基因座中失活分子的克隆演進(jìn)[16]。

克隆演進(jìn)和分子學(xué)突變可能還基于其他潛在的機(jī)制。例如，一些具有-7/del(7q)的病例因?yàn)榫哂蠸AMD9和SAMD9L突變導(dǎo)致骨髓衰竭[29]。而在具有GATA2突變的患者中相對(duì)高頻率的-7 / del(7q)表達(dá)，也可能涉及其他機(jī)制。臨床上大多數(shù)進(jìn)展為MDS的骨髓衰竭患者主要表現(xiàn)為難治或免疫抑制治療反應(yīng)不佳[28]。迄今為止，在AA轉(zhuǎn)化為MDS的-7 / del(7q)保留等位基因上未發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)性半合子，但在MDS中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)各種體細(xì)胞突變，包括SETBP1、CBL、RUNX1等[27]。對(duì)AA患者進(jìn)行全外顯子組測(cè)序或靶向深度測(cè)序，發(fā)現(xiàn)某些患者存在以體細(xì)胞突變?yōu)樘卣鞯目寺19]。

這些突變除了PIGA中的突變外，還包括DNMT3A、CBL、SETBP1、TET2、ASXL1、BCOR和BCORL。某些體細(xì)胞突變頻率的增加是否具有病理生理學(xué)意義還未可知。但總的來說，大多數(shù)體細(xì)胞突變僅存在于NGS評(píng)估的微小克隆中。在這些體細(xì)胞突變中的某幾種突變雖不會(huì)持續(xù)存在但偶爾會(huì)擴(kuò)增和消失，尤其是BCOR、BCORL和DNMT3A突變，這表明縮小的干細(xì)胞池具有募集選擇的作用。此外，克隆突變的存在并不能預(yù)測(cè)MDS的進(jìn)展；相反，只有特定的某些體細(xì)胞突變具有這種能力，而且隨后的二次突變可以進(jìn)一步加速M(fèi)DS的演進(jìn)過程。其他大多數(shù)體細(xì)胞突變則被免疫系統(tǒng)消除，或者通過與正常HSC競(jìng)爭(zhēng)而消除。值得注意的是，在AA中發(fā)現(xiàn)的一些克隆可以表現(xiàn)為無癥狀的正?？寺。绕湓诶夏陚€(gè)體中常見。因此，這其實(shí)等同于AA患者中存在CHIP。

對(duì)AA的體細(xì)胞突變進(jìn)行深度NGS追蹤表明，亞克隆擴(kuò)增已經(jīng)存在于一定比例的AA患者中。而這些體細(xì)胞突變(如RUNX、SETBP1)可能引起后來的繼發(fā)性MDS，并且表明del7不是初始缺陷，而是繼發(fā)缺陷。AA發(fā)現(xiàn)克隆突變的一個(gè)重要科學(xué)意義是HSC存在動(dòng)態(tài)演變以及對(duì)特發(fā)性AA起源理論進(jìn)行了佐證。試想體細(xì)胞突變事件是如何引發(fā)腫瘤監(jiān)視的免疫應(yīng)答的：克隆突變可能與HSC相互作用并引起對(duì)HSCs的損傷，從而導(dǎo)致AA；機(jī)體的免疫系統(tǒng)消除了病理性克隆，并對(duì)最適宜體細(xì)胞突變克隆進(jìn)行選擇，如果這種被選中的克隆突變能夠逃脫免疫監(jiān)視，就會(huì)導(dǎo)致AA繼發(fā)的MDS。