高艷，朱雅楠，李秋方，蘇松坤，聶紅毅

轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析意大利蜜蜂腦部哺育行為相關(guān)基因

高艷，朱雅楠，李秋方，蘇松坤，聶紅毅

（福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院（蜂學(xué)學(xué)院），福州 350002）

【目的】意大利蜜蜂（）哺育行為在維護(hù)蜂群穩(wěn)定和生產(chǎn)蜂王漿方面發(fā)揮重要作用。本研究通過(guò)人工組建蜂群獲得相同日齡的哺育蜂和采集蜂，篩選出排除日齡因素干擾后哺育蜂腦部與哺育行為密切相關(guān)的差異表達(dá)基因，揭示哺育蜂腦部調(diào)控哺育行為的分子網(wǎng)絡(luò)?！痉椒ā客ㄟ^(guò)人工組建蜂群的方法獲得3日齡工蜂、10日齡哺育蜂和采集蜂、21日齡哺育蜂和采集蜂，解剖各組工蜂頭部獲得腦組織樣本，應(yīng)用RNA-seq技術(shù)對(duì)5組腦部樣本（3日齡工蜂、10日齡哺育蜂、10日齡采集蜂、21日齡哺育蜂、21日齡采集蜂）中基因表達(dá)量進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的全面分析，篩選出哺育蜂腦部哺育行為密切相關(guān)的差異表達(dá)基因，并對(duì)這些差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析。同時(shí)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）對(duì)隨機(jī)選取的4個(gè)差異表達(dá)基因的表達(dá)模式進(jìn)行驗(yàn)證?！窘Y(jié)果】RNA-seq分析篩選得到32個(gè)與哺育蜂哺育行為密切相關(guān)的差異表達(dá)基因，這些基因在10日齡哺育蜂腦中表達(dá)量均顯著高于3日齡工蜂、10日齡采集蜂、21日齡采集蜂，且在21日齡哺育蜂腦中的表達(dá)量也顯著高于21日齡采集蜂。GO富集分析發(fā)現(xiàn)上調(diào)差異表達(dá)基因主要參與氧化還原酶活性、氣味結(jié)合、跨膜運(yùn)輸?shù)裙δ?。KEGG富集結(jié)果顯示，上調(diào)的差異表達(dá)基因主要參與蛋白質(zhì)代謝（核糖體）、能量代謝（氧化磷酸化、碳代謝、三羧酸循環(huán)、淀粉和蔗糖代謝、氮代謝、其他聚糖降解通路）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（Toll和Imd信號(hào)通路、光傳導(dǎo)、鞘脂代謝）、消化作用（溶酶體），其中顯著性富集在鞘脂代謝和其他聚糖降解通路。qPCR結(jié)果顯示3個(gè)上調(diào)差異表達(dá)基因（、、）和1個(gè)下調(diào)差異表達(dá)基因（）表達(dá)模式的檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序數(shù)據(jù)一致。【結(jié)論】通過(guò)對(duì)3日齡工蜂、10日齡哺育蜂、10日齡采集蜂、21日齡哺育蜂、21日齡采集蜂5組樣本腦部進(jìn)行全面分析，獲得相同日齡哺育蜂和采集蜂腦部基因的轉(zhuǎn)錄組圖譜，分析得到了腦部哺育行為相關(guān)的32個(gè)上調(diào)差異表達(dá)基因。哺育蜂腦部的差異表達(dá)基因主要通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和能量代謝等途徑調(diào)控哺育蜂的哺育行為。

意大利蜜蜂；哺育蜂；腦部；哺育行為；蜂王漿；RNA-seq

0 引言

【研究意義】蜜蜂腦是調(diào)節(jié)其生物學(xué)各項(xiàng)行為的中心器官，腦部的神經(jīng)系統(tǒng)能夠調(diào)控蜜蜂表現(xiàn)出的各種行為響應(yīng)，其中包括從哺育行為到采集行為的生命過(guò)渡過(guò)程，如分泌蜂王漿哺育幼蟲、采集、識(shí)別顏色和嗅覺(jué)線索、舞蹈交流、群體防御等[1-3]。工蜂的哺育行為在蜜蜂幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育、維護(hù)蜂群穩(wěn)定等方面發(fā)揮重要作用，同時(shí)工蜂的哺育行為也受到幼蟲信息素的調(diào)節(jié)[4]。蜂王漿的分泌由哺育蜂哺育行為所介導(dǎo)，這一哺育行為已被人工用于生產(chǎn)蜂王漿供人類食用。一般認(rèn)為，蜂王漿由適齡工蜂的咽下腺、上顎腺共同分泌，同時(shí)哺育行為介導(dǎo)的蜂王漿分泌過(guò)程離不開(kāi)腦部復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)機(jī)制調(diào)控[5-6]。因此，研究哺育蜂腦部調(diào)控哺育行為相關(guān)的分子網(wǎng)絡(luò)機(jī)制可為深入解析意大利蜜蜂（）蜂王漿分泌的分子機(jī)理提供新的思路和線索。【前人研究進(jìn)展】隨著日齡的發(fā)育，工蜂從巢內(nèi)工作向巢外采集活動(dòng)轉(zhuǎn)變，包括環(huán)境調(diào)節(jié)的行為變化[7-9]，這一過(guò)程涉及大腦的結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成的變化[10]；同樣也涉及到腦中激素和神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的生理過(guò)程以及成千上萬(wàn)基因表達(dá)的變化[11]，例如，其在功能和形態(tài)方面的轉(zhuǎn)變會(huì)受保幼激素的控制[12]。此外，腦部中樞神經(jīng)系統(tǒng)通過(guò)調(diào)控咽下腺和上顎腺相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)這些腺體的發(fā)育并且增強(qiáng)它們分泌蜂王漿的功能[13]。研究表明，哺育蜂的大腦對(duì)蜂王漿分泌產(chǎn)生了一種獨(dú)特的神經(jīng)肽，哺育蜂分泌蜂王漿能力的增強(qiáng)與調(diào)節(jié)行為過(guò)程中高度增強(qiáng)的神經(jīng)肽有關(guān)，并通過(guò)調(diào)節(jié)水穩(wěn)態(tài)、對(duì)幼蟲信息素的識(shí)別、采集能力和收集花粉來(lái)增加蜂群群體的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)進(jìn)而提高蜂王漿的分泌，從而在提高蜂王漿產(chǎn)量方面發(fā)揮了作用[13]。哺育蜂腦中高量表達(dá)的基因可能參與軸突形成和細(xì)胞黏附，這些基因可能涉及到哺育蜂在轉(zhuǎn)向采集活動(dòng)之前的腦結(jié)構(gòu)變化[7]。哺育蜂腦部磷脂酰肌醇信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和花生四烯酸代謝水平的提高有助于增強(qiáng)嗅覺(jué)對(duì)幼蟲信息素刺激的反應(yīng)[14]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】關(guān)于腦部調(diào)控蜂王漿分泌機(jī)制的研究主要集中于不同日齡工蜂腦部磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)和膜蛋白質(zhì)組學(xué)方面，以及不同日齡普通意大利蜜蜂與高產(chǎn)王漿意大利蜜蜂之間的腦部蛋白質(zhì)組學(xué)[2,6,10,13]。此外，借助微陣列分析技術(shù)展開(kāi)不同日齡工蜂腦部基因表達(dá)變化也有相關(guān)的報(bào)道[15]。目前，尚未有排除日齡因素影響而全面開(kāi)展的腦部調(diào)控蜂王漿分泌網(wǎng)絡(luò)機(jī)制相關(guān)的研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】為了排除日齡因素的干擾，人工組建蜂群，收集3日齡工蜂、10日齡哺育蜂、10日齡采集蜂、21日齡哺育蜂、21日齡采集蜂，利用RNA-seq技術(shù)全面篩選哺育蜂腦部哺育行為相關(guān)的關(guān)鍵差異表達(dá)基因（differentially expressed gene，DEG），為深入研究哺育蜂腦部調(diào)控蜂王漿分泌的分子機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試蜂種

供試蜂群為‘蜂強(qiáng)1號(hào)’意大利蜜蜂蜂種，樣品于2017年10月至2018年8月采自福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院（蜂學(xué)學(xué)院）教學(xué)蜂場(chǎng)。

1.2 主要儀器及試劑

體視顯微鏡1臺(tái)、冷光源儀器1臺(tái)、DEPC水（上海生工生物工程股份有限公司）、SYBR? Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）（TaKaRa公司）、75%酒精、干冰、碎冰。

1.3 標(biāo)記蜜蜂及收集樣品

試驗(yàn)所用蜂群為正常健康的5群強(qiáng)群，每群蜂中至少含有2—3張即將出房的封蓋子脾。在組建新的蜂群之前，去除封蓋子脾上的蜜蜂，放于恒溫恒濕培養(yǎng)箱（34.5℃，相對(duì)濕度60%）中，每隔24 h用不同顏色的記號(hào)筆在剛出房的蜜蜂胸部或腹部做好標(biāo)記，連續(xù)標(biāo)記5 d，每天標(biāo)記剛出房工蜂數(shù)目約為2 000—3 000頭。標(biāo)記完后投入由一只蜂王、一張蜜粉脾、一張幼蟲脾組建的人工蜂群。

標(biāo)記的工蜂發(fā)育到第3天時(shí)，直接收取工蜂作為3日齡工蜂；第10、21天時(shí)，收集頭部伸到有幼蟲巢房且持續(xù)時(shí)間超過(guò)10 s的工蜂作為哺育蜂；第10、21天時(shí)，在巢門口收集后足花粉筐中載有花粉的外勤蜂，將其作為采集蜂。按照這個(gè)要求，收集3日齡工蜂（3 d）、10日齡哺育蜂（10 dN）、10日齡采集蜂（10 dF）、21日齡哺育蜂（21 dN）、21日齡采集蜂（21 dF）。

1.4 樣品測(cè)序

參考趙元洪等[16]解剖蜜蜂大腦的方法，解剖5組樣品（3 d、10 dN、10 dF、21 dN、21 dF）的腦部，每組解剖10—15只，每組均設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。3 d的3個(gè)生物學(xué)重復(fù)分別為3 d_1、3 d_2、3 d_3；10 dN的3個(gè)生物學(xué)重復(fù)分別為10 dN_1、10 dN_2、10 dN_3；10 dF的3個(gè)生物學(xué)重復(fù)分別為10 dF_1、10 dF_2、10 dF_3；21 dN的3個(gè)生物學(xué)重復(fù)分別為21 dN_1、21 dN_2、21 dN_3；21 dF的3個(gè)生物學(xué)重復(fù)分別為21 dF_1、21 dF_2、21 dF_3。委托北京諾禾致源生物有限公司開(kāi)展總RNA質(zhì)量控制、cDNA文庫(kù)構(gòu)建和Illumina測(cè)序。

1.5 哺育蜂腦部哺育行為相關(guān)DEG的篩選及表達(dá)水平分析

根據(jù)FPKM（Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped reads）值法計(jì)算每個(gè)基因在5組樣本中的表達(dá)量。利用DESeq2軟件分析差異表達(dá)基因，將校正后的-adjust＜0.05作為篩選DEG的標(biāo)準(zhǔn)[17]，其中l(wèi)og2fold change (FC)＞0和log2FC＜0分別作為篩選上調(diào)和下調(diào)DEG的標(biāo)準(zhǔn)。

篩選與哺育行為密切相關(guān)的DEG的標(biāo)準(zhǔn)如下：DEG在10 dN腦中的表達(dá)量顯著高于3 d和21 dF；DEG在10 dN腦中的表達(dá)量顯著高于10 dF；DEG在21 dN腦中的表達(dá)量顯著高于21 dF；DEG在10 dN與21 dN腦中的表達(dá)量無(wú)顯著差異。將10 dN與3 d之間產(chǎn)生的DEG記為10 dN3 d組，10 dN與21 dF之間產(chǎn)生的DEG記為10 dN21 dF組，10 dN與10 dF之間產(chǎn)生的DEG記為10 dN10 dF組，21 dN與21 dF之間產(chǎn)生的DEG記為21 dN21dF組，10 dN與21 dN產(chǎn)生的DEG為10 dN21 dN組。

通過(guò)韋恩圖分析，10 dN3 d與10 dN21 dF、10 dN10 dF、21 dN21 dF做交集會(huì)產(chǎn)生共有的DEG，這一共有DEG包括調(diào)控哺育行為及日齡發(fā)育等相關(guān)，最后為減少日齡發(fā)育對(duì)篩選的影響，從共有DEG中去除10 dN21 dN與其交集產(chǎn)生的DEG，最后得到的即為嚴(yán)格篩選條件下與哺育行為密切相關(guān)的DEG。

通過(guò)clusterProfiler R軟件包和基因本體（GO）將關(guān)鍵DEG映射到GO數(shù)據(jù)庫(kù)中。通過(guò)BLAST軟件將篩選得到的DEG與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)。利用諾禾N(yùn)ovogene售后工具平臺(tái)（https://magic.novogene.com/ public/customer/main#/tool_rna/add_tool）對(duì)DEG進(jìn)行KEGG pathway富集分析。

1.6 DEG的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）驗(yàn)證

在DEG中隨機(jī)選取4個(gè)基因。利用Primer Premier 6設(shè)計(jì)特異性引物（表1），其中以（NM_001185146.1）作為內(nèi)參基因，委托上海生工生物工程有限公司進(jìn)行引物合成。反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（TaKaRa公司，日本）5 μL，引物（2 μmol·L-1）2 μL，模板（500 ng·μL-1）2 μL，ddH2O補(bǔ)充至10 μL。PCR程序分為3步：第一步為95℃預(yù)變性30 s；第二步為95℃變性5 s，60℃退火30 s，共 40個(gè)循環(huán)；最后一步為熔解曲線分析：65℃開(kāi)始，每5 s上升0.5℃，直至上升到95℃。整個(gè)反應(yīng)程序在熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司，美國(guó)）上進(jìn)行，按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。以2-ΔΔCt法[18]計(jì)算哺育蜂腦部DEG的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 不同發(fā)育時(shí)期工蜂腦部測(cè)序文庫(kù)的測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控與評(píng)估

15個(gè)工蜂腦樣品經(jīng)建庫(kù)和測(cè)序，有效讀段數(shù)介于56 348 822—82 964 416，樣本的單一匹配率均在72%以上，Q30值也都在88%以上，說(shuō)明RNA-Seq數(shù)據(jù)質(zhì)量較好，測(cè)序數(shù)據(jù)可靠性高（表2）。

2.2 哺育蜂哺育行為相關(guān)DEG的篩選及趨勢(shì)分析

韋恩圖分析發(fā)現(xiàn)，10 dN3 d有1 596個(gè)DEG；10 dN21 dF有578個(gè)DEG；10 dN10 dF有166個(gè)DEG；21 dN21 dF有1 315個(gè)DEG，將這4組進(jìn)行交集分析得到42個(gè)DEG（圖1-A），這42個(gè)DEG包括調(diào)控哺育行為及日齡發(fā)育等相關(guān)。為減少日齡對(duì)篩選與哺育行為相關(guān)DEG的干擾，去除10 dN21 dN與42個(gè)DEG交集產(chǎn)生的1個(gè)DEG，最后得到41個(gè)DEG（圖1-B）。

表1 qPCR引物信息

表2 RNA-seq數(shù)據(jù)總覽

41個(gè)DEG的表達(dá)量熱圖聚類分析發(fā)現(xiàn)，這些DEG主要在21 dN和10 dN組表達(dá)量較高（圖1-C）；其中，在哺育蜂階段均上調(diào)表達(dá)的DEG有32個(gè)，均下調(diào)表達(dá)的有6個(gè)，剩余的3個(gè)DEG除在10 dN3 d中呈上調(diào)表達(dá)外，其余都是在哺育蜂階段呈下調(diào)表達(dá)（表3）。

A、B：篩選哺育蜂腦部哺育行為相關(guān)DEG韋恩圖 Venn diagram of selected-DEGs related to nursing behavior of nurses；C：41個(gè)DEG表達(dá)量聚類熱圖 41 DEGs expression clustering heat map

32個(gè)在哺育蜂階段均上調(diào)表達(dá)的DEG為腦中與哺育行為密切相關(guān)的DEG。將32個(gè)DEG在10 dN10 dF和21 dN21 dF中按照l(shuí)og2FC值從高到低的順序排列，其中差異倍數(shù)最大的為編碼王漿主蛋白1（MRJP1）的基因（log2FC (10 dN10 dF)=9.44，log2FC (21 dN21 dF)=5.71），該基因在哺育蜂階段高量表達(dá)（10 dN、21 dN腦中FPKM值分別為1 564.78和510.71），在3日齡工蜂和采集蜂階段呈低量表達(dá)（3 d、10 dF和21 dF腦中FPKM值分別為0.40、2.27和9.64）；其次為（編碼毒酸磷酸酶Acph-1樣）、（編碼突觸小泡糖蛋白2C）、（編碼羧肽酶Q樣）、（編碼葡萄糖基神經(jīng)酰胺酶4），其中在哺育蜂階段呈高量表達(dá)（10 dN和21 dN腦中FPKM值分別為75.03、50.90），在3日齡工蜂和采集蜂階段呈低量表達(dá)（3 d、10 dF和21 dF腦中FPKM值分別為2.83、7.81和8.63）；還在上調(diào)DEG中發(fā)現(xiàn)編碼氣味結(jié)合蛋白（odorant binding protein，OBP）的3個(gè)基因、、，以及編碼細(xì)胞色素P450家族之一的基因（表4）。

表3 腦部41個(gè)DEG基于日齡依賴性在5組樣本中的顯著性趨勢(shì)

↑：顯著性上調(diào)significantly up-regulated；↓：顯著性下調(diào)significantly down-regulated；ns：兩組樣本之間無(wú)顯著性差異No significant difference

表4 腦部前11個(gè)上調(diào)DEG在5組樣本中的表達(dá)信息

2.3 哺育蜂哺育行為相關(guān)DEG的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

GO富集分析（表5）發(fā)現(xiàn)32個(gè)上調(diào)DEG主要參與氧化還原酶活性（4個(gè)DEG）、氣味結(jié)合（3個(gè)DEG）、跨膜運(yùn)輸（2個(gè)DEG），GO富集中未發(fā)現(xiàn)有顯著性富集的基因。

通過(guò)KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的DEG（圖2）主要參與蛋白質(zhì)代謝（核糖體）、能量代謝（氧化磷酸化、碳代謝、三羧酸循環(huán)、淀粉和蔗糖代謝、氮代謝、其他聚糖降解通路）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（Toll和Imd信號(hào)通路、光傳導(dǎo)、鞘脂代謝）、消化作用（溶酶體），其中顯著性富集在鞘脂代謝和其他聚糖降解通路上。

表5 上調(diào)DEG富集的GO條目

2.4 轉(zhuǎn)錄組中DEG的qPCR驗(yàn)證

為驗(yàn)證測(cè)序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，從41個(gè)DEG中選取3個(gè)上調(diào)基因（、和）和1個(gè)下調(diào)基因（），結(jié)果顯示這些基因表達(dá)水平的趨勢(shì)變化與RNA-seq數(shù)據(jù)中的變化趨勢(shì)基本一致（圖3），證實(shí)了測(cè)序結(jié)果的可信性。

圖2 哺育蜂哺育行為相關(guān)DEG的KEGG功能富集分析

黑色柱狀圖表示RNA-seq數(shù)據(jù)中基因的FPKM值，灰色表示qPCR數(shù)據(jù)中基因的相對(duì)表達(dá)量，縱坐標(biāo)均為相應(yīng)取過(guò)以2為底的對(duì)數(shù)值The black bar graph represents the FPKM value of the gene in the RNA-seq data, and the gray represents the relative expression of genes in the qPCR data; the ordinates are the corresponding logarithmic values with a base of 2。圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，采用單因素方差分析 Data in the figure are the mean±SE, One-way Anova. *P＜0.05; **P＜0.01; ***P＜0.001

3 討論

蜜蜂腦部的研究大多基于腦細(xì)胞的化學(xué)功能、結(jié)構(gòu)、內(nèi)分泌活動(dòng)以及腦部基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的時(shí)態(tài)變化，如保幼激素、生物胺、多巴胺、5-羥色胺和章魚胺在腦中對(duì)蜜蜂行為發(fā)育的調(diào)節(jié)起著關(guān)鍵作用[19]。此外，神經(jīng)分子（例如神經(jīng)肽）被稱為中樞神經(jīng)系統(tǒng)回路中的神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)節(jié)劑[20]，對(duì)蜜蜂腦中神經(jīng)功能的肽能調(diào)節(jié)產(chǎn)生重大影響[21]，也有研究表明腦部神經(jīng)肽組的重構(gòu)用以適應(yīng)蜂王漿高產(chǎn)的需要[14]。哺育蜂對(duì)幼蟲的哺育行為是建立在其大腦對(duì)幼蟲信息素信號(hào)的接收和反饋基礎(chǔ)上的[4,14]。哺育蜂哺育行為介導(dǎo)的蜂王漿分泌機(jī)制的研究大多集中在咽下腺和上顎腺[6,22-23]，有關(guān)腦部調(diào)控哺育行為介導(dǎo)蜂王漿分泌的分子機(jī)制方面的研究相對(duì)較少。

本研究人工組建蜂群收集3日齡工蜂，10日齡哺育蜂、采集蜂，21日齡哺育蜂、采集蜂，利用RNA-seq技術(shù)，在減小日齡的干擾下嚴(yán)格篩選出41個(gè)DEG，其中32個(gè)與哺育蜂哺育行為密切相關(guān)。WHITFIELD等通過(guò)基因芯片技術(shù)檢測(cè)到哺育蜂和采集蜂腦之間約有1 800個(gè)DEG[7]，而本研究只篩選出41個(gè)DEG，主要有以下原因：首先本研究的試驗(yàn)樣本來(lái)自人工構(gòu)建相同日齡的哺育蜂和采集蜂；構(gòu)建兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)（10日齡和21日齡）的同日齡哺育蜂和采集蜂，然后取共有的DEG。這兩個(gè)嚴(yán)格條件可以排除日齡的影響，導(dǎo)致篩選的DEG數(shù)目較少，進(jìn)一步保證結(jié)果更加可靠。GO富集分析顯示上調(diào)DEG主要參與氧化還原酶活性、氣味結(jié)合、跨膜運(yùn)輸；KEGG富集通路顯示這些上調(diào)DEG主要參與蛋白質(zhì)代謝、能量代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等（圖2），其中顯著性富集在鞘脂代謝和其他聚糖降解通路上。

3.1 哺育蜂腦中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的上調(diào)DEG

突觸囊泡糖蛋白2（SV2）具有許多功能，包括囊泡運(yùn)輸、穩(wěn)定神經(jīng)遞質(zhì)囊泡負(fù)載、錨定囊泡蛋白、協(xié)助囊泡運(yùn)輸、調(diào)節(jié)鈣敏感性以及與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用；在脊椎動(dòng)物中，SV2家族由3個(gè)副產(chǎn)物組成，包括SV2A、SV2B和SV2C，其中SV2C的表達(dá)是最受限制的，僅局限于進(jìn)化古老的大腦區(qū)域，在紋狀體、中腦和腹側(cè)蒼白球均有較強(qiáng)的表達(dá)，而在新皮層的表達(dá)很少[24]。SV2C參與中樞系統(tǒng)中多巴胺的釋放，其缺失可以引起小鼠運(yùn)動(dòng)障礙、增加-突觸核蛋白單體的聚集和降低紋狀體多巴胺的釋放[25]。本研究在上調(diào)DEG中發(fā)現(xiàn)編碼SV2C的基因，該基因在3日齡工蜂和采集蜂階段基本不表達(dá)（3 d、10 dF和21 dF中該基因的FPKM值分別為0.22、0.47和0.60），而在哺育蜂階段的表達(dá)量相對(duì)較高（10 dN和21 dN腦中FPKM值分別為12.81和11.96）。化學(xué)神經(jīng)傳遞對(duì)神經(jīng)元之間的交流至關(guān)重要，在這個(gè)交流過(guò)程中，Ca2+涌入突觸前末端，觸發(fā)神經(jīng)遞質(zhì)釋放進(jìn)入突觸，作用于突觸后受體[24]。此外，GO富集結(jié)果也顯示參與跨膜運(yùn)輸功能，推測(cè)工蜂腦部的在調(diào)節(jié)Ca2+敏感性，促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)作用于突觸后受體，從而引發(fā)哺育行為方面發(fā)揮重要作用。

葡萄糖神經(jīng)酰胺是300多種結(jié)構(gòu)不同的鞘糖脂（包括神經(jīng)節(jié)苷脂和硫苷脂）的骨架，對(duì)于哺乳動(dòng)物的發(fā)育至關(guān)重要。葡萄糖神經(jīng)酰胺是一種膜鞘磷脂，是許多糖脂的前體[26]。葡糖苷神經(jīng)酰胺合成酶催化神經(jīng)酰胺產(chǎn)生葡萄糖神經(jīng)酰胺，它是神經(jīng)節(jié)苷脂類的前體物質(zhì)[27]。在上調(diào)DEG中發(fā)現(xiàn)編碼葡萄糖基神經(jīng)酰胺酶的基因和，KEGG富集結(jié)果顯示這兩個(gè)基因顯著性富集在鞘脂代謝路徑上。鞘脂及其代謝產(chǎn)物不僅是構(gòu)成細(xì)胞膜的重要結(jié)構(gòu)分子，而且參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、衰老和細(xì)胞程序性死亡等許多重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，使細(xì)胞產(chǎn)生各種不同的生物學(xué)功能[28]。

藥理學(xué)研究表明，在發(fā)育的大腦中，sn-1特異性二?；视椭久富钚允禽S突生長(zhǎng)和引導(dǎo)所必需的[29-30]。在哺育蜂階段富集的光傳導(dǎo)途徑可能表明該通路在哺育蜂從事巢外工作接受光信號(hào)中發(fā)揮重要作用[31]。本研究在上調(diào)DEG中發(fā)現(xiàn)編碼sn-1特異性二酰基甘油脂肪酶的基因富集在光傳導(dǎo)途徑中。

在昆蟲中，氣味結(jié)合蛋白（OBP）和化學(xué)感受蛋白（chemosensory protein，CSP）在運(yùn)載疏水性氣味分子和信息素穿過(guò)淋巴液的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用[32-33]。OBP14在蜂群的上顎腺中含量豐富，與單萜類結(jié)構(gòu)有較好的親和力；OBP21在老蜂體內(nèi)含量豐富，并與法尼素結(jié)合，而法尼素是一種吸引蜂群的信息素[34]。OBP和CSP可以與多種配體結(jié)合，但是與蜜蜂的幼蟲信息素有更高的結(jié)合力[33,35]。本研究在上調(diào)DEG中發(fā)現(xiàn)了、、；Nie等在意蜂的觸角轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)、、，其中、在觸角中的表達(dá)量從剛出房工蜂到哺育蜂階段呈增加趨勢(shì)，而在哺育蜂階段到采集蜂階段呈減小趨勢(shì)[36]，這與本研究在上調(diào)DEG中發(fā)現(xiàn)的這兩個(gè)基因的表達(dá)趨勢(shì)基本一致，推測(cè)這兩個(gè)基因可能在腦部化學(xué)信息的傳遞和調(diào)控方面發(fā)揮重要作用。

哺育蜂通過(guò)調(diào)節(jié)對(duì)幼蟲信息素的識(shí)別和采集蜂的采集能力等來(lái)增加蜂群群體的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)進(jìn)而提高蜂王漿的分泌。細(xì)胞的一切行為都需要信號(hào)分子和受體結(jié)合，通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)現(xiàn)。這些與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因（和）在哺育蜂腦中呈上調(diào)表達(dá)，暗示哺育蜂可能通過(guò)這些基因增強(qiáng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而在感知揮發(fā)物信息素后啟動(dòng)高效蛋白合成的機(jī)制。

3.2 哺育蜂腦中與能量代謝相關(guān)的上調(diào)DEG

氧化磷酸化是真核生物體內(nèi)有機(jī)物包括糖、脂、氨基酸等在分解過(guò)程中發(fā)生氧化并驅(qū)動(dòng)ATP合成的過(guò)程，生物體內(nèi)95%的ATP來(lái)自這種方式[37]。腦部為滿足其較高的代謝速率需要消耗很多的ATP，因此有大量的線粒體位于大腦細(xì)胞中。除氧化磷酸化外，三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)）和碳代謝也是生物體能量代謝產(chǎn)生ATP的重要途徑。在細(xì)胞和器官中，三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)）是產(chǎn)生能量的關(guān)鍵過(guò)程，本研究在上調(diào)DEG中發(fā)現(xiàn)編碼琥珀酸脫氫酶[泛醌]黃素蛋白亞基的基因，表明哺育蜂腦部可能通過(guò)有氧氧化（TCA循環(huán)）葡萄糖產(chǎn)生大量ATP。此外，該基因還顯示富集在氧化磷酸化、碳代謝、三羧酸循環(huán)通路，這些結(jié)果表明哺育蜂腦部可能通過(guò)多種途徑為哺育行為提供充足的能量。

昆蟲細(xì)胞色素P450酶參與多種代謝活動(dòng)，包括外源性物質(zhì)降解、保幼激素和蛻皮類固醇生物合成、信息素代謝[9]。在相同日齡哺育蜂和采集蜂腦中，發(fā)現(xiàn)在10日齡哺育蜂和21日齡哺育蜂腦中的表達(dá)量均顯著高于相同日齡采集蜂中表達(dá)量；GO富集分析表明該基因參與氧化還原酶活性。唐曉偉根據(jù)細(xì)胞色素P450與血紅素結(jié)合區(qū)域設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物克隆出一段蜜蜂細(xì)胞色素P450基因片段，進(jìn)而克隆得到該基因全長(zhǎng)，并由細(xì)胞色素P450命名委員會(huì)命名為[38]。該基因?qū)儆贑YP6家族成員，但是關(guān)于該基因的功能尚未有深入研究。在果蠅中，CYP6家族的成員羥化了月桂酸的ω-1位置，這表明CYP6家族的成員參與了昆蟲的脂肪酸羥化反應(yīng)[23,39]。BOUTIN等通過(guò)在清理行為和非清理行為工蜂腦部的差異表達(dá)基因中發(fā)現(xiàn)在清理行為工蜂腦部高表達(dá)的細(xì)胞色素P450基因，推測(cè)可能是清理行為工蜂對(duì)外源性物質(zhì)（如幼蟲發(fā)出的信息素等氣味）的高敏感性引發(fā)細(xì)胞色素P450基因的高量表達(dá)[40]。在哺育蜂腦中發(fā)現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，推測(cè)該基因可能在哺育蜂腦部調(diào)控脂肪酸羥基化或降解幼蟲釋放的請(qǐng)求飼喂的信息素過(guò)程中發(fā)揮作用。哺育蜂能夠感知幼蟲信息素并通過(guò)外圍化學(xué)感受器官傳輸信號(hào)到大腦；通過(guò)高級(jí)中樞神經(jīng)器官-大腦調(diào)控上顎腺和咽下腺合成蛋白質(zhì)和脂肪酸等重要大分子物質(zhì)，引發(fā)腦部產(chǎn)生哺育行為，進(jìn)而促進(jìn)咽下腺和上顎腺等腺體產(chǎn)生蜂王漿分泌的行為。上述富集的通路說(shuō)明大腦在這一時(shí)期的基礎(chǔ)能量供應(yīng)和蛋白、脂肪酸合成都得到加強(qiáng)，這樣更有利于大腦進(jìn)行信息處理和行為調(diào)控，從而促進(jìn)哺育蜂的哺育行為。

值得注意的是，在上調(diào)DEG中發(fā)現(xiàn)編碼王漿主蛋白1（MRJP1）的，目前該基因尚未有相關(guān)功能的報(bào)道。該基因在NCBI意大利蜜蜂基因組新版本Amel_HAv3.1中尚未注釋，但以前版本Amel_4.5中有注釋。針對(duì)該基因特異序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)熒光定量檢測(cè)該基因在腦中表達(dá)，且在哺育蜂腦中顯著高量表達(dá)（圖3），該基因有可能是蜂王漿主蛋白家族的新成員，后續(xù)可以通過(guò)克隆基因全長(zhǎng)進(jìn)行驗(yàn)證。前人在蜜蜂腦中也檢測(cè)到蜂王漿主蛋白家族基因的表達(dá)，但在腦中發(fā)揮的作用尚不明確。RNA-seq測(cè)序?qū)⒕哂行l(wèi)生行為和不具有衛(wèi)生行為工蜂腦進(jìn)行比較[40]，也發(fā)現(xiàn)在這兩種行為工蜂腦部高量表達(dá)。蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)MRJP1、MRJP2和MRJP7蛋白在哺育蜂腦中的含量顯著高于采集蜂腦中含量，推測(cè)這些基因可能為腦中蛋白質(zhì)的合成過(guò)程儲(chǔ)存氨基酸[41]。在本研究構(gòu)建的相同日齡哺育蜂和采集蜂腦的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，檢測(cè)到（）在哺育蜂腦中顯著高量表達(dá)，暗示該基因可能在哺育行為調(diào)控蜂王漿合成和分泌過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

4 結(jié)論

在mRNA組學(xué)水平對(duì)3日齡工蜂、10日齡哺育蜂、10日齡采集蜂、21日齡哺育蜂、21日齡采集蜂5組樣本腦組織進(jìn)行全面表征分析，獲得了相同日齡哺育蜂和采集蜂腦部基因的轉(zhuǎn)錄組圖譜，分析得到了哺育行為密切相關(guān)的32個(gè)上調(diào)差異表達(dá)基因。哺育蜂腦部的差異表達(dá)基因主要通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和能量代謝等途徑調(diào)控哺育蜂的哺育行為，研究結(jié)果可為闡明哺育蜂哺育行為的分子機(jī)制提供理論參考。

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GAO Yan, ZHU YaNan, LI QiuFang, SU SongKun, NIE HongYi

(College of Animal Sciences (College of Bee science), Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002)

【Objective】The nursing behavior ofplays an important role in maintaining colony stability and production of royal jelly (RJ). In this study, samples (3-day-old worker bees, 10-day-old nurses/foragers, 21-day-old nurses/foragers) were obtained by constructing artificial colony, which can eliminate the influence of age on nursing behavior. Moreover, genes closely related to the nursing behavior were strictly screened out in the brain of these samples, which could reveal the molecular network of brain regulation of nursing behavior.【Method】The 3-day-old worker bees, 10-day-old nurses and foragers, 21-day-old nurses and foragers were obtained by constructing artificial bee colony. And then the head of different group’s worker bees was dissected to obtain brain tissues of these samples. RNA-seq was used to analyze the transcriptome sequencing of the 5 groups (3-day-old worker bees, 10-day-old nurses, 10-day-old foragers, 21-day-old nurses, 21-day-old foragers) of brain samples. Differentially expressed genes (DEGs) which are closely related to the nursing behavior in the nurses’ brain were screened out. GO and KEGG enrichment analysis were carried out for these genes. qPCR was used to verify the expression patterns of 4 randomly selected DEGs.【Result】RNA-seq analysis screened out 32 DEGs that were closely related to the nursing behavior of nurses. These genes were significantly up-regulated in the brain of 10-day-old nurses than 3-day-old worker bees, 10-day-old foragers and 21-day-old foragers, and the expression level in the brain of 21-day-old nurses was significantly higher than that in 21-day-old foragers. Go enrichment analysis showed that the up-regulated DEGs were mainly involved in oxidoreductase activity, odor binding, transmembrane transport and other functional items. KEGG enrichment results showed that the up-regulated DEGs were mainly involved in protein metabolism (ribosome), energy metabolism (oxidative phosphorylation, carbon metabolism, the citrate cycle (TCA cycle), starch and sucrose metabolism, nitrogen metabolism and other glycan degradation pathway), signal transduction (Toll and Imd signaling pathways, phototransduction, sphingolipid metabolism), digestive function (lysosome). Of them, only sphingolipid metabolism and other glycan degradation pathway were notably enriched. qPCR results showed that the expression patterns of 3 up-regulated DEGs (,,) and 1 down-regulated DEG () were consistent with the sequencing data.【Conclusion】To obtain gene expression profiles of brains from age-matched nurses and foragers, the brains of 5 groups (3-day-old worker bees, 10-day-old nurses, 10-day-old foragers, 21-day-old nurses, and 21-day-old foragers) were comprehensively analyzed using transcriptome sequencing, revealing that the 32 up-regulated DEGs were associated with brain nursing behavior. These genes were mainly involved in signal transduction and energy metabolism, which can affect the nursing behavior.

; nurses; brain; nursing behavior; royal jelly; RNA-seq

2020-01-17；

2020-03-10

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（蜜蜂）（CARS-44-KXJ4）、福建省自然科學(xué)基金（2018J05043）、福建省省屬高?？蒲许?xiàng)目（JK2017014）

高艷，E-mail：2726820378@qq.com。通信作者蘇松坤，E-mail：susongkun@zju.edu.cn。通信作者聶紅毅，E-mail：hnhynie@126.com

（責(zé)任編輯 岳梅）