李海昆 劉 洋 李春華 王永旺 于瑞海

(中國(guó)海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266003)

自1981 年首次報(bào)道用細(xì)胞松弛素B(CB)成功誘導(dǎo)美洲牡蠣(Crassostrea virginica)的三倍體以來(lái)， 牡蠣的多倍體育種就成為了牡蠣育種的重要研究方向(Stanleyet al， 1981)。三倍體牡蠣育性差， 在繁殖季節(jié)不會(huì)因繁殖活動(dòng)導(dǎo)致軟體部消瘦， 因而可以全年保持較好的品質(zhì)(Allenet al， 1986a； Nell， 2002)； 三倍體牡蠣在最適的生存條件下要比二倍體牡蠣生長(zhǎng)快， 且在繁殖季節(jié)死亡率低(Piferreret al， 2009； Dégremontet al， 2012； Peacheyet al， 2016)； 此外， 三倍體的不育性還可避免基因污染， 具有一定的生態(tài)優(yōu)勢(shì)(Piferreret al， 2009； Peacheyet al， 2016)。這些有益的生態(tài)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值， 使三倍體牡蠣深受?chē)?guó)內(nèi)外養(yǎng)殖者的歡迎， 其養(yǎng)殖產(chǎn)量在世界牡蠣養(yǎng)殖產(chǎn)量的占比不斷提高(Peacheyet al， 2016)。目前獲得三倍體牡蠣的方法有兩種， 一種是通過(guò)物理方法(Allenet al， 1986b)或者化學(xué)方法(Downinget al， 1987； Gérardet al， 1999)誘導(dǎo)獲得， 另一種是用四倍體和二倍體雜交獲得100%的全三倍體(Guoet al， 1994， 1996)。獲得全三倍體牡蠣的關(guān)鍵是四倍體的獲得， 而四倍體誘導(dǎo)離不開(kāi)三倍體牡蠣(Guoet al， 1994)， 因此三倍體牡蠣的高效誘導(dǎo)是牡蠣多倍體育種的前提。目前， 國(guó)內(nèi)學(xué)者已經(jīng)利用不同方法對(duì)我國(guó)常見(jiàn)的幾種巨牡蠣屬牡蠣開(kāi)展了三倍體的研究， 包括長(zhǎng)牡蠣(C. gigas)(于瑞海等， 2000； 王康， 2014)、近江牡蠣(王康， 2014)、香港牡蠣(C. hongkongensis)(秦艷平等， 2017)、熊本牡蠣(C. sikamea)(武祥偉等， 2019)。

近江牡蠣主要分布于太平洋西海岸的河口區(qū)， 由于其具有生長(zhǎng)快、抗病性強(qiáng)的特點(diǎn)， 曾被美國(guó)考慮作為一個(gè)新的養(yǎng)殖對(duì)象引進(jìn)(Calvoet al， 2001； Yoonet al， 2008)。近江牡蠣在我國(guó)的南北方均有分布， 是我國(guó)自然分布的幾種比較重要的巨牡蠣屬牡蠣之一(張躍環(huán)等， 2014)。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于近江牡蠣的育種研究主要集中于雜交育種上， 關(guān)于近江牡蠣的多倍體育種的研究較少。

三倍體近江牡蠣具有生長(zhǎng)快、存活率高、抗病性強(qiáng)的特點(diǎn)(Calvoet al， 2001)， 開(kāi)展近江牡蠣的三倍體的誘導(dǎo)研究對(duì)開(kāi)展近江牡蠣的三倍體育種， 進(jìn)一步提高我國(guó)養(yǎng)殖牡蠣的質(zhì)量具有重要意義。早在2008年， 楊春玲等(2008)就已經(jīng)進(jìn)行了6-DMAP 誘導(dǎo)近江牡蠣三倍體的研究， 但是當(dāng)時(shí)的“近江牡蠣(C. rivularis)”還沒(méi)有與香港牡蠣完全區(qū)分開(kāi)， 實(shí)驗(yàn)中所用的近江牡蠣可能混有香港牡蠣(Lamet al， 2003； Wanget al， 2004； 王海艷等， 2007)， 且研究評(píng)估6-DMAP 誘導(dǎo)效果的指標(biāo)單一， 研究?jī)?nèi)容不夠完善。本實(shí)驗(yàn)中， 近江牡蠣取自東營(yíng)市黃河三角洲地區(qū)河口區(qū)域， 具有個(gè)體較大、殼厚重的特點(diǎn)(Xiaoet al， 2010)， 為真正意義上的北方近江牡蠣； 使用的誘導(dǎo)藥物為 Desrosiers 等(1993)提出的毒害作用較小的6-DMAP。本次研究從誘導(dǎo)濃度、起始誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間三個(gè)水平探究6-DMAP 對(duì)近江牡蠣的誘導(dǎo)效果， 并結(jié)合卵裂率、孵化率、三倍體率和誘導(dǎo)后誘導(dǎo)組幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)率、存活率、三倍體率變化情況6 個(gè)評(píng)估指標(biāo)， 建立了6-DMAP 誘導(dǎo)近江牡蠣三倍體的方法， 為黃河口近江牡蠣的多倍體育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 親貝暫養(yǎng)

近江牡蠣親貝采自東營(yíng)市黃河三角洲， 4—5 齡， 挑選無(wú)損傷、左殼凹凸明顯的個(gè)體作為實(shí)驗(yàn)親貝。2019 年5 月1 日運(yùn)至萊州市長(zhǎng)漁水產(chǎn)有限公司育苗車(chē)間進(jìn)行暫養(yǎng)， 暫養(yǎng)期間投喂新月菱形藻(Nitzschia closterium)和亞心形扁藻(Platymonas subcordiformis)， 每天移池?fù)Q水一次。5 月底性腺同步成熟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 解剖獲取精卵、受精

解剖親貝后， 用牙簽挑破性腺， 蘸取性腺滴于載玻片的水滴上， 若呈煙霧狀為雄性個(gè)體， 若呈顆粒狀則為雌性個(gè)體。在顯微鏡下觀(guān)察每個(gè)個(gè)體的卵子質(zhì)量以及精子活力。選擇卵子梨形或卵圓形、卵顏色較深的個(gè)體作為母本， 卵液先用200 目的篩絹過(guò)濾較大的雜質(zhì)， 然后用500 目的篩絹洗卵3 次， 最后將洗好的卵置于過(guò)濾海水(溫度25°C， 鹽度29)中促熟30min； 選擇精子活力較強(qiáng)的個(gè)體作為父本， 精液用200 目的篩絹過(guò)濾。受精前檢查卵子是否污染， 受精時(shí)保證每個(gè)卵子周?chē)?—10 個(gè)精子。

1.3 6-DMAP 的誘導(dǎo)處理

所有的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)均在3L 的塑料桶中進(jìn)行， 誘導(dǎo)密 度 為 3.0×107個(gè)/mL， 溫 度 均 為 25°C； 參 考Desrosiers 等(1993)、Gèrard 等(1999)、秦艷平等(2017)對(duì)6-DMAP 的使用， 設(shè)計(jì)誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間3 個(gè)因素， 每個(gè)因素設(shè)計(jì)4 個(gè)水平， 每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。

1.3.1 誘導(dǎo)濃度實(shí)驗(yàn) 受精后將受精卵平均分成4 份， 受精后18min 將四份受精卵分別在150、300、450 和600μmol/L 的6-DMAP 中誘導(dǎo)處理15min。

1.3.2 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)實(shí)驗(yàn) 受精后將受精卵平均分成4 份， 分別在受精后10、14、18 和22min 用濃度實(shí)驗(yàn)中獲得最佳誘導(dǎo)濃度進(jìn)行誘導(dǎo)， 誘導(dǎo)持續(xù)15min。

1.3.3 誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間實(shí)驗(yàn) 受精后將受精卵平均分成4 份， 采用誘導(dǎo)濃度實(shí)驗(yàn)、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)實(shí)驗(yàn)中獲得最佳誘導(dǎo)條件進(jìn)行誘導(dǎo)， 分別持續(xù)誘導(dǎo)10、15、20 和25min。

誘導(dǎo)結(jié)束后用500 目篩絹洗受精卵3 次， 之后將受精卵轉(zhuǎn)移至60L 的塑料桶中進(jìn)行孵化， 孵化過(guò)程中連續(xù)充氣， 并每間隔2h 攪動(dòng)一次小桶， 避免受精卵下沉。受精2h 后取樣測(cè)量各組的卵裂率。24h 后測(cè)量各組的孵化率， 并將孵化獲得的一部分D 形幼蟲(chóng)制成細(xì)胞懸液固定于75%的酒精中， 用流式細(xì)胞儀(Beckman CoulterCytoFLEX， 美國(guó))檢測(cè)倍率。

1.4 幼蟲(chóng)培育

將不同誘導(dǎo)濃度、不同起始誘導(dǎo)時(shí)間、不同誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間獲得的D 形幼蟲(chóng)繼續(xù)培養(yǎng)。幼蟲(chóng)培育期間， 投喂球等鞭金藻(Isochrysis galbana)， 每天投喂6 次， 日投餌量6000—8000cells/mL； 水溫25—27°C， 每天換水兩次， 每次換水50%。每隔4 天隨機(jī)取30個(gè)幼蟲(chóng)測(cè)量殼高， 同時(shí)測(cè)每組的存活率， 連續(xù)觀(guān)察至第25 天； 在50%殼頂期幼蟲(chóng)和50%眼點(diǎn)幼蟲(chóng)兩個(gè)時(shí)期， 收集幼蟲(chóng)制成細(xì)胞懸液固定于 75%酒精中， 用于倍率檢測(cè)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用SPSS18.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理， 進(jìn)行單因素方差分析比較不同處理的誘導(dǎo)效果， 并進(jìn)行Duncan 多重比較分析不同處理下卵裂率、孵化率、三倍體率、幼蟲(chóng)的殼高和存活率指標(biāo)的差異， 顯著水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果

2.1 6-DMAP 對(duì)近江牡蠣三倍體的誘導(dǎo)效果

2.1.1 誘導(dǎo)濃度 隨誘導(dǎo)濃度的增加受精卵的卵裂率逐漸降低； 誘導(dǎo)濃度150、300 和450μmol/L 組的孵化率無(wú)顯著性差異(P＞0.05)， 誘導(dǎo)濃度為600μmol/L 時(shí)的孵化率顯著小于誘導(dǎo)濃度為150μmol/L和300μmol/L 時(shí)的孵化率(P＜0.05)； 誘導(dǎo)濃度為300、450 和 600μmol/L 時(shí)的三倍體率無(wú)顯著性差異(P＞0.05)， 但均顯著高于誘導(dǎo)濃度為150μmol/L 時(shí)的三倍體率(P＜0.05)； 誘導(dǎo)濃度為450μmol/L 時(shí)誘導(dǎo)獲得三倍體率最高達(dá)60.67%±5.63%(圖1)。

圖1 不同的誘導(dǎo)濃度下卵裂率、孵化率和三倍體率 Fig.2 Cleavage rate， hatching rate， and triploid rate in different induction concentrations

2.1.2 起始誘導(dǎo)時(shí)間 起始誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)卵裂率影響較小， 起始誘導(dǎo)時(shí)間14、18 和22min 時(shí)的卵裂率無(wú)顯著性差異(P＞0.05)， 但均顯著低于起始誘導(dǎo)時(shí)間10min 時(shí)的卵裂率； 不同的起始誘導(dǎo)時(shí)間下的三倍體率差異較大， 起始誘導(dǎo)時(shí)間為受精后14min 時(shí)， 誘導(dǎo)獲得的三倍體率最高為69.34%±2.11%(圖2)。

2.1.3 誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間 隨誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間的增加， 卵裂率和孵化率均降低； 誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間25min 時(shí)， 卵裂率和孵化率均不到60%。持續(xù)誘導(dǎo)時(shí)間15min 和20min 兩組的三倍體率顯著高于另外兩組的三倍體率(P＜0.05)， 但兩組內(nèi)的三倍體率無(wú)顯著性差異(P＞0.05)， 持續(xù)誘導(dǎo)時(shí)間為20min 時(shí)， 誘導(dǎo)獲得三倍體率最高為60.32%±2.01%(圖3)。

2.2 不同的6-DMAP 誘導(dǎo)條件下誘導(dǎo)組幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)情況

幼蟲(chóng)培育的前5 天， 不同誘導(dǎo)濃度下的誘導(dǎo)組幼蟲(chóng)殼高均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)； 培育的第10—20 天， 誘導(dǎo)濃度為600μmol/L 時(shí)的誘導(dǎo)組幼蟲(chóng)殼高最小， 顯著小于誘導(dǎo)濃度為300μmol/L 時(shí)幼蟲(chóng)的殼高(P＜0.05)， 誘導(dǎo)濃度為150、300 和450μmol/L 時(shí)的誘導(dǎo)組幼蟲(chóng)的殼高無(wú)顯著性差異(P＞0.05)； 培育的第20—25 天， 誘導(dǎo)濃度150、300 和450μmol/L 時(shí)誘導(dǎo)組幼蟲(chóng)的殼高無(wú)顯著性差異(P＞0.05)， 但均高于濃度為600μmol/L時(shí)幼蟲(chóng)的殼高(圖4)。

圖2 不同的起始誘導(dǎo)時(shí)間下卵裂率、孵化率和三倍體率 Fig.2 Cleavage rate， hatching rate， and triploid rate in different initial induction times

圖3 不同的誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間下卵裂率、孵化率和三倍體率 Fig.3 Cleavage rate， hatching rate， and triploid rate in different induction durations

在培育的25 天內(nèi)， 起始誘導(dǎo)時(shí)間為受精后14、18 和22min 時(shí)誘導(dǎo)組幼蟲(chóng)的殼高始終無(wú)顯著性差異(P＞0.05)； 幼蟲(chóng)培育的前10 天， 不同的誘導(dǎo)起始時(shí)間下誘導(dǎo)組幼蟲(chóng)的殼高均無(wú)顯著性的差異(P＞0.05)； 培 育的第15—20 天， 起始誘導(dǎo)時(shí)間10min 時(shí)誘導(dǎo)組幼蟲(chóng)的殼高均顯著高于起始誘導(dǎo)時(shí)間18min 時(shí)誘導(dǎo)組幼蟲(chóng)的殼高(P＜0.05)(圖5)。

圖4 不同的誘導(dǎo)濃度下三倍體誘導(dǎo)組幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)情況 Fig.4 The growth of triploid induced larvae under different induction concentrations

圖5 不同的起始誘導(dǎo)時(shí)間下三倍體誘導(dǎo)組幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)情況 Fig.5 The growth of triploid induced larvae under different initial induction times

在培育的25 天內(nèi)， 誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間為10、15 和20min 時(shí)誘導(dǎo)組幼蟲(chóng)的殼高無(wú)顯著性差異(P＞0.05)； 在培育的前10 天， 不同的誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間下的誘導(dǎo)組幼蟲(chóng)的殼高無(wú)顯著性差異(P＞0.05)； 在培育的第15—20 天， 誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間為10、15 和20min 的誘導(dǎo)組幼蟲(chóng)殼高均顯著高于持續(xù)誘導(dǎo)時(shí)間為25min 時(shí)幼蟲(chóng)的殼高(P＜0.05)； 培育的25 天內(nèi)， 持續(xù)誘導(dǎo)時(shí)間為25min 時(shí)的誘導(dǎo)組幼蟲(chóng)殼高均最小(圖6)。

2.3 不同的誘導(dǎo)條件下幼蟲(chóng)的存活情況

在培育的 25 天內(nèi)， 誘導(dǎo)濃度 150、300 和450μmol/L 時(shí)的誘導(dǎo)組幼蟲(chóng)存活率均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)； 在培育的15—25 天， 誘導(dǎo)濃度150、300和450μmol/L 時(shí)的誘導(dǎo)組幼蟲(chóng)的存活率均顯著高于誘導(dǎo)濃度 600μmol/L 時(shí)的誘導(dǎo)組幼蟲(chóng)存活率(P＜0.05)。起始誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)幼蟲(chóng)存活影響較小， 在培育第15 天之后各起始誘導(dǎo)時(shí)間之間的誘導(dǎo)組幼蟲(chóng)的存活率均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)； 在培育的第10 天， 起始誘導(dǎo)時(shí)間10min 時(shí)的誘導(dǎo)組幼蟲(chóng)的存活率顯著低于其他各誘導(dǎo)組幼蟲(chóng)存活率(P＜0.05)。在培育的前20 天內(nèi)， 持續(xù)誘導(dǎo)時(shí)間10、15 和20min 時(shí)的誘導(dǎo)組幼蟲(chóng)的存活率無(wú)顯著性差異(P＞0.05)， 但均顯著高于持續(xù)誘導(dǎo)時(shí)間 25min 時(shí)誘導(dǎo)組幼蟲(chóng)的存活率(P＜0.05)(表1)。

不同的6-DMAP 誘導(dǎo)組合下的三倍體誘導(dǎo)組幼蟲(chóng)的日平均生長(zhǎng)率無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。培育25天內(nèi)， 誘導(dǎo)濃度為150、300 和450μmol/L 的三倍體誘導(dǎo)組幼蟲(chóng)平均存活率無(wú)顯著性差異(P＞0.05)， 但均顯著高于誘導(dǎo)濃度為600μmol/L 時(shí)的三倍體誘導(dǎo)組幼蟲(chóng)的平均存活率(P＜0.05)。起始誘導(dǎo)時(shí)間為10min時(shí)的三倍體誘導(dǎo)組幼蟲(chóng)的平均存活率顯著小于起始誘導(dǎo)時(shí)間為14min 時(shí)的三倍體誘導(dǎo)組幼蟲(chóng)的平均存活率(P＜0.05)。不同的持續(xù)誘導(dǎo)時(shí)間下， 三倍體誘導(dǎo)組幼蟲(chóng)的平均存活率差異較小， 誘導(dǎo)持續(xù)10、15 和20min 時(shí)的三倍體誘導(dǎo)組幼蟲(chóng)的平均存活率無(wú)顯著性差異 (P＞0.05)， 但均顯著高于誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間為25min 時(shí)的三倍體誘導(dǎo)組幼蟲(chóng)的平均存活率(P＜0.05)(表2)。

圖6 不同的持續(xù)誘導(dǎo)時(shí)間下三倍體誘導(dǎo)組幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)情況 Fig.6 The growth of triploid induced larvae under different induction durations

表1 不同的6-DMAP 誘導(dǎo)條件下三倍體誘導(dǎo)組幼蟲(chóng)的存活率 Tab.1 Survival rate of triploid induced larvae under different 6-DMAP induction conditions

2.4 不同的誘導(dǎo)條件對(duì)三倍體近江牡蠣誘導(dǎo)的影響程度比較

不同的誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間對(duì)卵裂率產(chǎn)生極顯著差異影響(P＜0.01)， 且對(duì)應(yīng)的極差最大， 因此誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間對(duì)卵裂率的影響程度最大， 三個(gè)誘導(dǎo)條件對(duì)卵裂率的影響程度為誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間＞誘導(dǎo)濃度＞起始誘導(dǎo)時(shí)間； 三個(gè)誘導(dǎo)條件對(duì)孵化率的影響程度為起始誘導(dǎo)時(shí)間＞誘導(dǎo)濃度＞誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間； 三個(gè)誘導(dǎo)條件對(duì)三倍體率的影響程度為起始誘導(dǎo)時(shí)間＞誘導(dǎo)濃度＞誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間。誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間是影響幼蟲(chóng)平均存活率的主要因素(表3)。

2.5 不同幼蟲(chóng)期各三倍體誘導(dǎo)組幼蟲(chóng)三倍體率變化情況

幼蟲(chóng)培育期間， 各三倍體誘導(dǎo)組幼蟲(chóng)的三倍體率均有所下降， 誘導(dǎo)濃度600μmol/L 和誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間25min 兩組的三倍體率下降超過(guò)10%， 其他各組三倍體率下降均為超過(guò)10%， 變化不顯著(P＞0.05)。多數(shù)情況下， 三倍體率的下降主要集中于殼頂期幼蟲(chóng)之前， 殼頂期幼蟲(chóng)之后三倍體率變化較小(圖7)。

3 討論

3.1 6-DMAP 誘導(dǎo)黃河口近江牡蠣三倍體方法的探討

從三倍體誘導(dǎo)原理上看， 起始誘導(dǎo)時(shí)間的控制是把握極體排放時(shí)機(jī)的關(guān)鍵， 誘導(dǎo)濃度是作用強(qiáng)度

的體現(xiàn)， 這兩個(gè)因素是決定三倍體率的主要因素， 本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也證明了這一點(diǎn)。楊春玲等(2008)誘導(dǎo)“近江牡蠣(C. rivularis)”三倍體時(shí)， 也認(rèn)為起始誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)濃度是決定誘導(dǎo)三倍體率的主要因素。田傳遠(yuǎn)等(1999)認(rèn)為誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間對(duì)長(zhǎng)牡蠣三倍體誘導(dǎo)率無(wú)顯著性影響， 而本實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間是三因素中對(duì)三倍體率影響最小的因素， 這說(shuō)明誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間是三個(gè)因素中對(duì)誘導(dǎo)三倍體率影響最小的一個(gè)因素。持續(xù)誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)濃度是影響卵裂率的主要因素， 推測(cè)原因是較高的誘導(dǎo)濃度和較長(zhǎng)的誘導(dǎo)時(shí)間使受精卵受到一定的毒害作用， 受精卵不能正常分裂(田傳遠(yuǎn)等， 1998)。持續(xù)誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)胚胎的孵化率沒(méi)有顯著性的影響， 這與CB 誘導(dǎo)熊本牡蠣的結(jié)論相反， 推測(cè)原因是6-DMAP 毒性比CB 的毒性小， 其毒害作用是瞬間的， 因此其毒害作用主要集中于受精卵時(shí)期， 而對(duì)胚胎的影響較小， 因此卵裂率受該因素的影響較大， 而孵化率幾乎不受該因素的影響(田傳遠(yuǎn)等， 1998； 武祥偉等， 2019)。綜合來(lái)看， 三個(gè)誘導(dǎo)條件對(duì)三倍體誘導(dǎo)效果的影響程度為起始誘導(dǎo)時(shí)間＞誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間＞誘導(dǎo)濃度。

表2 培育25 天內(nèi)不同的6-DMAP 誘導(dǎo)條件下三倍體誘導(dǎo)組幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)存活比較 Tab.2 Comparison on growth and survival of triploid induced larvae under different 6-DMAP induction conditions on the 25th day

表3 不同的誘導(dǎo)條件對(duì)三倍體近江牡蠣誘導(dǎo)的影響程度比較 Tab.3 Comparison on effects of different induction conditions on triploid C. ariakensis induction

圖7 不同的誘導(dǎo)條件下三倍體誘導(dǎo)組幼蟲(chóng)的三倍體率的變化 Fig.7 Variation of triploid rate of triploid induced larvae in different induced conditions

較高的誘導(dǎo)濃度(600μmol/L)和較長(zhǎng)的持續(xù)誘導(dǎo)時(shí)間(25min)下三倍體誘導(dǎo)組幼蟲(chóng)生長(zhǎng)慢且存活率顯著低， 若以三倍體誘導(dǎo)組幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)、存活和三倍體率變化作為考量誘導(dǎo)效果的指標(biāo)， 只能說(shuō)明誘導(dǎo)濃度600μmol/L、誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間25min 兩個(gè)條件下誘導(dǎo)效果較差， 而其他的條件下均無(wú)顯著性差異。綜合三倍體 D 形幼蟲(chóng)的產(chǎn)量和誘導(dǎo)組幼蟲(chóng)的情況來(lái)看， 6-DMAP 誘導(dǎo)黃河口近江牡蠣三倍體的最佳組合是： 誘導(dǎo)濃度為300—450μmol/L， 起始誘導(dǎo)時(shí)間為受精后14min， 持續(xù)誘導(dǎo)時(shí)間為15min。

3.2 三倍體誘導(dǎo)組幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)存活探討

從幼蟲(chóng)殼高變化看， 誘導(dǎo)濃度600μmol/L 和持續(xù)誘導(dǎo)時(shí)間25min 時(shí)的幼蟲(chóng)在培育的第5—15 天內(nèi)， 生長(zhǎng)速度明顯減慢， 幼蟲(chóng)殼高顯著小于組內(nèi)其他條件下幼蟲(chóng)的殼高。武祥偉等(2019)用CB 誘導(dǎo)獲得的熊本牡蠣三倍體群幼蟲(chóng)在培育前期出現(xiàn)大量死亡現(xiàn)象， 作者認(rèn)為死亡率高的原因之一是CB 的毒性大， 對(duì)胚胎產(chǎn)生了毒害作用。雖然本實(shí)驗(yàn)中用到的6-DMAP的毒性小， 但當(dāng)誘導(dǎo)濃度過(guò)大和誘導(dǎo)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)， 胚胎處于極度不適應(yīng)的環(huán)境中， 會(huì)受到潛在的傷害， 而這種潛在的傷害會(huì)在D 形幼蟲(chóng)初期表現(xiàn)出來(lái)—生長(zhǎng)遲滯和高死亡率(田傳遠(yuǎn)等， 2000)。在培育的前期， 幼蟲(chóng)的死亡率急劇下降， 尤其是誘導(dǎo)強(qiáng)度較強(qiáng)時(shí)(高誘導(dǎo)濃度和長(zhǎng)的誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間)， 這種現(xiàn)象尤為明顯。由于極體排放不同步， 高強(qiáng)度的誘導(dǎo)使得第一極體被抑制的幾率大大增加， 導(dǎo)致染色體多級(jí)分離產(chǎn)生非整倍體(Guoet al， 1992； 田傳遠(yuǎn)等， 1999)， 這些非整倍體幼蟲(chóng)雖然不存在生長(zhǎng)遲滯現(xiàn)象(Guoet al， 1996； Wanget al， 1999)， 但 是 其 存 活 能 力 低(武 祥 偉 等， 2019)， 造成整組在培育初期存活率急劇下降。

3.3 三倍體誘導(dǎo)組幼蟲(chóng)的三倍體率變化情況分析

培育至眼點(diǎn)幼蟲(chóng)時(shí)期， 多數(shù)情況下幼蟲(chóng)三倍體率下降幅度較小， 均未超過(guò)10%， 只有誘導(dǎo)強(qiáng)度過(guò)大時(shí)三倍體率下降顯著。誘導(dǎo)濃度600μmol/L 和持續(xù)誘導(dǎo)時(shí)間25min 兩組幼蟲(chóng)時(shí)幼蟲(chóng)死亡率均較高， 同時(shí)三倍體率急劇下降， 較高的誘導(dǎo)強(qiáng)度獲得了較多的非整倍體， 非整倍體存在會(huì)降低三倍體率(Heet al， 2000)。因此在用6-DMAP 誘導(dǎo)近江牡蠣三倍體時(shí)， 誘導(dǎo)濃度不能太大且誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間不能太長(zhǎng)， 否則三倍體產(chǎn)量會(huì)大大下降。此外， 三倍體染色體的丟失也是造成三倍體率下降的重要原因， 多倍體牡蠣由于體內(nèi)多了一套染色體而具備了許多二倍體牡蠣不具有的特點(diǎn)， 但其額外的染色體組使其細(xì)胞分裂紊亂的幾率增加， 容易產(chǎn)生非整倍體嵌合體， 甚至逆轉(zhuǎn)回二倍體(de Sousaet al， 2016)。

4 結(jié)論

本研究認(rèn)為， 溫度25°C， 鹽度29 的條件下， 誘導(dǎo)濃度為300—450μmol/L， 起始誘導(dǎo)時(shí)間為受精后14min， 誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間為15min 時(shí)， 6-DMAP 誘導(dǎo)黃河口近江牡蠣三倍體的效果較好。