歐陽佳，蘭雪花，李清明，李雁含，曾璐，李文佳，蘇小軍，，3，*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙410128；2.生物質(zhì)醇類燃料湖南省工程實驗室，湖南長沙410128；3.湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長沙410128）

淮山（Dioscorea opposita Thunb.）又名山藥，是薯蕷科薯蕷屬多年生薯蕷的塊莖[1]?；瓷阶鳛閭鹘y(tǒng)的藥食兼用食物，在我國有著上千年的食用歷史，中醫(yī)認為淮山有補脾養(yǎng)胃、生津益肺、固腎澀精的藥用功效[2-3]。乳酸菌是一類能利用糖類發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的革蘭氏染色陽性細菌，部分乳酸菌已被證明具有抗氧化、提高機體免疫力、改善乳糖不耐癥和防治腹瀉等功效[4-8]。我國現(xiàn)有的乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品形式多樣，其中大部分為乳制品，包括發(fā)酵乳、酸奶、奶酪等；而針對果蔬進行乳酸菌發(fā)酵的研究也有一些報道，比如馬鈴薯、紫甘薯、胡蘿卜等[9-12]。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）是目前較為常用的兩種具有益生作用的乳酸菌[13-14]。在果蔬自然發(fā)酵過程中，植物乳桿菌屬于優(yōu)勢菌種，具有較強的產(chǎn)酸能力和良好的耐酸性能；嗜熱鏈球菌來源于動物體內(nèi)，容易適應(yīng)腸道環(huán)境，便于人體消化[15-16]。

目前關(guān)于乳酸菌發(fā)酵淮山的研究較少，且主要是采用單一菌種，而以淮山為單一原料，采用復(fù)合菌種進行發(fā)酵的研究鮮有報道[17-18]。利用復(fù)合菌種進行發(fā)酵可以豐富相關(guān)產(chǎn)品中有益菌種類及其活性物質(zhì)，本文采用植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌組成的復(fù)合菌種對淮山進行發(fā)酵，并對發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，旨在為淮山復(fù)合益生菌發(fā)酵產(chǎn)品的開發(fā)提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 材料

淮山：產(chǎn)自湖南雙峰縣；嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌：由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院保藏。

1.1.2 試劑

M17肉湯（生化試劑）：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；MRS肉湯、技術(shù)瓊脂粉（均為生化試劑）：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；α-1，4-葡萄糖水解酶（1.0×104U/g）、α-淀粉酶（3700 U/g）：北京索萊寶科技有限公司；蔗糖、檸檬酸、無水乙酸鈉、無水乙醇、乙酸、氯化鈉、蒽酮、濃硫酸（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；磷酸鹽緩沖液：福建廈門海標科技有限公司；葡萄糖標準品：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GI54DWS型自動壓力蒸汽滅菌器：致微（廈門）儀器有限公司；HPX-30085-Ⅲ型恒溫恒濕箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司，PHS-3E型pH計：上海儀電科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；WFJ 7200型可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；Centrifuge 5804 R高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 復(fù)合乳酸菌發(fā)酵淮山工藝流程

新鮮淮山→清洗→去皮→切片→護色（0.2%檸檬酸）→熱燙→磨漿[料液比 1∶4（g/mL）]→糊化（95℃，30 min）→酶解（55℃，3 h）→添加蔗糖→高壓蒸汽滅菌→接種→發(fā)酵

1.3.2 復(fù)合乳酸菌發(fā)酵淮山工藝單因素試驗

單因素試驗的因素固定水平為：發(fā)酵時間14 h、發(fā)酵溫度40℃、蔗糖添加量3%、菌株接種量5%、菌株接種體積比（嗜熱鏈球菌∶植物乳桿菌）1∶1，在此基礎(chǔ)上每次改變一個因素的水平值，考察發(fā)酵時間（10、12、14、16、18 h）、發(fā)酵溫度（36、38、40、42、44 ℃）、蔗糖添加量（1%、2%、3%、4%、5%）、菌株接種量（3%、4%、5%、6%、7%）和菌株接種體積比（1∶2、1∶1.5、1∶1、1.5∶1、2∶1）對活菌數(shù)和 pH 值的影響。

1.3.3 復(fù)合乳酸菌發(fā)酵淮山工藝正交試驗

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，選取發(fā)酵時間（A）、菌株接種量（B）和發(fā)酵溫度（C）進行正交試驗，考察其對復(fù)合乳酸菌活菌數(shù)的影響，確定發(fā)酵的最佳工藝條件。因素水平表見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of the experiment

1.3.4 發(fā)酵過程中多糖含量的測定

綜合單因素和正交試驗結(jié)果，在最優(yōu)發(fā)酵條件下對淮山進行發(fā)酵。在發(fā)酵過程中，每隔3 h對發(fā)酵液中的多糖含量進行測定，并繪制24 h內(nèi)多糖含量的動態(tài)變化曲線。

1.3.5 指標分析測定

pH值的測定：采用pH計直接測定。

活菌數(shù)的測定：采用平板菌落計數(shù)法。

多糖含量的測定參考蒽酮硫酸法[19]，具體操作如下。

樣品處理：吸取發(fā)酵液20 mL于100 mL錐形瓶中，超聲1.5 h，沸水加熱1 h；加入1 mL 10%α-淀粉酶溶液和0.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液于錐形瓶中，60℃水浴酶解1 h，再加0.4 mL 5%α-1，4-葡萄糖水解酶溶液，55℃酶解1 h，沸水滅酶；取5 mL上述溶液，加入 95%乙醇 20 mL，4℃放置 12 h，離心（5 000 r/min，10 min）；殘渣用80%乙醇洗滌，重復(fù)3次，殘渣即為粗多糖，加20 mL蒸餾水復(fù)溶。

樣品測定：吸取樣品溶液和蒸餾水各1mL于10mL具塞試管中，冰水浴條件下向試管中加入6 mL蒽酮硫酸試劑，沸水中反應(yīng)15 min，取出搖勻，冷水中靜置7 min，490 nm處測吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵條件對淮山發(fā)酵的影響

2.1.1 發(fā)酵溫度對pH值和活菌數(shù)的影響

發(fā)酵溫度對pH值和活菌數(shù)的影響見圖1。

圖1 發(fā)酵溫度對pH值和活菌數(shù)的影響Fig.1 Effects of fermentation temperatures on pH value and viable count

過低或過高的溫度都會導(dǎo)致細胞內(nèi)酶活下降，影響產(chǎn)酸能力和發(fā)酵速度，不利于乳酸菌的生長。從圖1可以看出，發(fā)酵溫度對活菌數(shù)和pH值的影響較大，在36℃～42℃的范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，活菌數(shù)呈現(xiàn)不斷增加的趨勢，并在42℃條件下活菌數(shù)達到最大值（8.23±0.02）lg（CFU/mL），繼續(xù)升高溫度時，活菌數(shù)開始下降；pH值則隨發(fā)酵溫度的升高不斷降低，后趨于穩(wěn)定。嗜熱鏈球菌屬于嗜熱型微生物，細胞內(nèi)的酶和蛋白質(zhì)具有較強的抗熱性，能在50℃以內(nèi)的溫度下生長；但植物乳桿菌屬于嗜溫微生物，溫度高于40℃時，細胞內(nèi)酶的催化能力會大大降低，甚至?xí)?dǎo)致其喪失催化活性，從而影響菌株的正常生長[20]。因此，本試驗選擇42℃作為適宜發(fā)酵溫度。

2.1.2 發(fā)酵時間對pH值和活菌數(shù)的影響

發(fā)酵時間對pH值和活菌數(shù)的影響見圖2。

圖2 發(fā)酵時間對pH值和活菌數(shù)的影響Fig.2 Effects of fermentation time on pH value and viable count

發(fā)酵時間會影響乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸量及發(fā)酵的完全程度[21]。在發(fā)酵過程中，乳酸菌利用淮山漿液中的糖作為碳源，在對數(shù)生長期內(nèi)快速增長，同時產(chǎn)生大量有機酸。當(dāng)有機酸積累到一定程度后，乳酸菌活力下降，同時基質(zhì)中的營養(yǎng)物質(zhì)被大量消耗，營養(yǎng)物比例逐漸失衡，使得其走向衰亡期。從圖2可以看出，隨著發(fā)酵時間的延長，活菌數(shù)先增加后減少，而pH值則呈現(xiàn)持續(xù)降低的趨勢。發(fā)酵14 h后，活菌數(shù)達到最高，為（8.43±0.06）lg（CFU/mL）。因此，在本試驗條件下，復(fù)合乳酸菌發(fā)酵淮山的適宜發(fā)酵時間為14 h。

2.1.3 菌株接種量對pH值和活菌數(shù)的影響

菌株接種量對pH值和活菌數(shù)的影響見圖3。

圖3 菌株接種量對pH值和活菌數(shù)的影響Fig.3 Effects of inoculation amount on pH value and viable count

接種量會影響菌株進入對數(shù)生長期的速度和菌株的生長周期[20]。從圖3可以看出，在菌株接種量增加的過程中，乳酸菌的活菌數(shù)呈現(xiàn)先增后減的趨勢，當(dāng)接種量為4%時，活菌數(shù)達到最大值（8.89±0.03）lg（CFU/mL），此時pH值為4.05±0.01。菌株接種量較低時，乳酸菌繁殖基數(shù)小，活菌數(shù)增長緩慢，而加大接種量則能有效縮短延滯期，也能使淮山漿液中的營養(yǎng)物質(zhì)被充分利用；但另一方面，淮山漿液所能提供的營養(yǎng)物質(zhì)又是有限的，接種量過大會使得營養(yǎng)物質(zhì)被過快消耗，同時產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致部分乳酸菌缺乏生長所需的能量，生長受到限制并提早進入衰亡期[22]。綜合考慮，本試驗選擇4%作為復(fù)合乳酸菌發(fā)酵淮山的適宜菌株接種量。

2.1.4 蔗糖添加量對pH值和活菌數(shù)的影響

蔗糖添加量對pH值和活菌數(shù)的影響見圖4。

從圖4可以看出，隨著蔗糖添加量的增加，乳酸菌的活菌數(shù)呈現(xiàn)先增后減的趨勢，在蔗糖添加量為2%～4%的范圍內(nèi)，活菌數(shù)的變化波動較小。在此條件下，復(fù)合乳酸菌發(fā)酵淮山的適宜蔗糖添加量為3%。

嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌均能利用蔗糖作為碳源；但在氮源含量不變的情況下，單方面提高蔗糖添加量容易造成基質(zhì)中的碳氮比失衡，從而導(dǎo)致乳酸菌提早衰亡；此外，蔗糖含量過高會造成高滲透壓環(huán)境，對乳酸菌有一定的脫水作用，可抑制其生長[4，23]。

圖4 蔗糖添加量對pH值和活菌數(shù)的影響Fig.4 Effects of sucrose content on pH value and viable count

2.1.5 菌株接種體積比對pH值和活菌數(shù)的影響

菌株接種體積比對pH值和活菌數(shù)的影響見圖5。

圖5 菌株接種體積比對pH值和活菌數(shù)的影響Fig.5 Effects of strain inoculation volume ratio on pH value and viable count

從圖5可以看出，嗜熱鏈球菌比例的增加會導(dǎo)致活菌數(shù)呈現(xiàn)先增后減的趨勢，并且在菌株接種體積比為 1∶1 時，活菌數(shù)達到最大值（8.63±0.04）lg（CFU/mL），此時pH值為4.34±0.01。

嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌之間存在種間共存關(guān)系，并且嗜熱鏈球菌屬于其中的優(yōu)勢菌種[24]。接種后，嗜熱鏈球菌生長很快，較早進入對數(shù)生長期并且大量產(chǎn)酸，使得發(fā)酵體系的pH值快速下降，并會刺激植物乳桿菌的生長；但當(dāng)接種比例過高時，嗜熱鏈球菌會迅速消耗基質(zhì)中的營養(yǎng)物質(zhì)，影響后期植物乳桿菌的生長，導(dǎo)致復(fù)合菌株之間的促生長能力降低和活菌總數(shù)下降。因此本試驗選擇菌株接種體積比為1∶1進行下一步研究。

2.2 復(fù)合乳酸菌發(fā)酵淮山工藝優(yōu)化

為了進一步優(yōu)化發(fā)酵工藝，根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，選取發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度和菌株接種量進行正交試驗，考察它們對乳酸菌活菌數(shù)的影響。正交試驗結(jié)果見表2。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 The results of orthogonal test

由表2可知，對發(fā)酵體系中活菌數(shù)的影響因素依次為A>C>B，最佳方案為A3B2C1，即發(fā)酵時間16 h、菌株接種量5%、發(fā)酵溫度40℃。在最優(yōu)條件下進行3組重復(fù)驗證試驗，試驗結(jié)果表明發(fā)酵結(jié)束后體系中乳酸菌活菌數(shù)為（8.62±0.02）lg（CFU/mL）。與正交試驗結(jié)果基本相符，證明結(jié)果可信。黃天等[21]采用Lactobacillus plantarum P-8和Bifidobacterium lactis V9發(fā)酵淮山，在發(fā)酵時間19.1 h、發(fā)酵溫度37℃的條件下活菌數(shù)可達到8.63 lg（CFU/mL）；劉聰慧等[10]采用保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌和動物雙歧桿菌發(fā)酵馬鈴薯，在接種量5%、各菌種間接種體積比為1∶1、發(fā)酵溫度40℃的條件下活菌數(shù)可達到8.97 lg（CFU/mL），本試驗取得了與之相近的研究結(jié)果。

2.3 發(fā)酵過程中多糖含量的動態(tài)變化

發(fā)酵過程中多糖含量的動態(tài)變化見圖6。

淮山多糖是淮山中主要的活性成分，包含均多糖、雜多糖和糖蛋白，其中均多糖主要由葡萄糖構(gòu)成，雜多糖主要由葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖等單糖構(gòu)成[2，25]。嗜熱鏈球菌在發(fā)酵過程中能利用乳糖、果糖、蔗糖和葡萄糖產(chǎn)酸，植物乳桿菌在發(fā)酵過程中能利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、纖維二糖、木糖、果糖等產(chǎn)酸[4，26]。從圖6可以看出，隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵體系中的多糖含量呈現(xiàn)不斷下降的趨勢。這可能是因為淮山多糖在乳酸菌發(fā)酵過程中被水解利用[4]。在發(fā)酵前期，乳酸菌生長處于延滯期，對營養(yǎng)物質(zhì)的利用較低，此時淮山多糖含量變化不大；在發(fā)酵3 h～15 h內(nèi)乳酸菌活菌數(shù)呈現(xiàn)對數(shù)增長，多糖含量則顯著降低；在發(fā)酵15 h之后乳酸菌的活菌數(shù)趨于穩(wěn)定，而多糖含量的變化也同樣趨于穩(wěn)定，說明乳酸菌活菌數(shù)的增加與淮山多糖的減少密切相關(guān)，證明乳酸菌可以利用淮山多糖作為其營養(yǎng)物質(zhì)。

圖6 發(fā)酵過程中多糖含量的動態(tài)變化Fig.6 Dynamic change of polysaccharide content during fermentation

3 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，以植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌組成的復(fù)合乳酸菌在單一的淮山漿液中能很好地進行發(fā)酵，活菌數(shù)超過8.00 lg（CFU/mL）；通過工藝優(yōu)化，確定了較優(yōu)的工藝條件，提高了發(fā)酵體系中的活菌總數(shù)；同時，發(fā)酵過程中多糖含量的動態(tài)變化證明乳酸菌可以利用淮山多糖，為淮山復(fù)合乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品的研究和開發(fā)提供參考和依據(jù)。