張明先 楊燕

[摘要]本研究利用高效液相色譜同時測定食用油中沒食子酸丙酯（PG）、沒食子酸月桂酯（DG）、沒食子酸辛酯（OG）、叔丁基對苯二酚（TBHQ）、叔丁基對羥基茴香醚（BHA）、2，6-二叔丁基對甲基苯酚（BHT）、2，6-二叔丁基-4-羥甲基苯酚（Ionox-100）7種抗氧化劑的測定方法，樣品中的抗氧化劑經(jīng)正己烷溶解、乙腈萃取后，經(jīng)C18柱分離，乙腈-1.5%乙酸溶液體系為流動相進(jìn)行梯度洗脫，紫外檢測器檢測，外標(biāo)法定量。選擇線性范圍在1～100mg/L，結(jié)果表明7種抗氧化劑呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r大于0.999，方法的測定低限為0.8～2.0mg/kg，回收率在89.3%～110.1%，變異系數(shù)在1.5%～4.9%。該方法準(zhǔn)確、快速、重現(xiàn)性好，可用于大批量食用油檢測中7種抗氧化劑的定量分析。

[關(guān)鍵詞]抗氧化劑;高效液相色譜;食用油

中圖分類號：TS227 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.202003

食用油脂在生產(chǎn)、儲藏、使用過程中容易發(fā)生酸敗現(xiàn)象，從而導(dǎo)致油脂變質(zhì)、品質(zhì)下降，甚至產(chǎn)生對人體有害的物質(zhì)[1]。為了阻止和延緩食用油的氧化，在油脂中添加抗氧化劑來阻止氧化反應(yīng)的發(fā)生是目前食品生產(chǎn)企業(yè)常用的有效手段[2]?？寡趸瘎┰谝欢ǖ姆秶鷥?nèi)可以使用，但過量食用會對人體產(chǎn)生毒性[3-6]。鑒于其危害性，世界上很多國家都通過法規(guī)或者標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格規(guī)定了抗氧化劑在食品中的限量?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）[7]規(guī)定沒食子酸丙酯（PG）最大使用量不能超過1g/kg，叔丁基對苯二酚（TBHQ）、叔丁基對羥基茴香醚（BHA）、2，6-二叔丁基對甲基苯酚（BHT）最大使用量不能超過0.2g/kg。

《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中9種抗氧化劑的測定》（GB 5009.32—2016）是測定抗氧化劑的國標(biāo)方法[8]，但在實際使用中并不能實現(xiàn)多種抗氧化劑的完全分離和陽性鑒別，存在不足之處。因此，本文以食用油為研究對象，采用液-液萃取法進(jìn)行樣品提取、高效液相色譜配紫外檢測器進(jìn)行分離和檢測，對前處理方法和測定條件進(jìn)行了大量試驗，最終建立了食用油中7種抗氧化劑的測定方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

1.1.1 樣品選擇

大豆油、玉米油樣品：市售。

1.1.2 試劑與標(biāo)準(zhǔn)品

1.1.2.1 試劑

正己烷色譜純、乙腈色譜純：賽默飛世爾科技公司;乙酸：純度99%，西亞試劑;純水：屈臣氏集團（香港）有限公司。

1.1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品

PG、TBHQ、BHA、BHT：純度分別為99.7%、99.2%、99.8%、99.5%，德國Dr.Ehrenstorfer公司;Ionox-100、DG、OG：純度分別為99.1%、99.0%、99.1%，上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 主要儀器和設(shè)備

高效液相色譜儀配紫外檢測器（Agilent 1260）、氮吹儀（MV5，lab Tech）、離心機（HC-3018）：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;漩渦混合（IKA）、有機微孔濾膜（0.22）：天津市津騰實驗設(shè)備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別稱取7種抗氧化劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)50.0mg，用乙腈溶解后，轉(zhuǎn)移定容至50mL棕色容量瓶中，得到濃度為1 000mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，4℃避光保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)使用液：移取適量體積的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液至不同的10mL容量瓶中，用乙腈定容，得到濃度分別為1mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L、100mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，臨用現(xiàn)配。

1.3.2 樣品前處理

稱取油脂樣品1.00g于具塞離心管中，加入5mL乙腈飽和的正己烷溶液溶解樣品，渦旋混勻2min，加入5mL正己烷飽和的乙腈溶液，渦旋提取2min，3 000r/min離心5min，收集乙腈層于試管中。再重復(fù)使用5mL正己烷飽和的乙腈溶液提取2次，合并3次提取液，氮吹濃縮至近干，加2mL乙腈定容，過0.22?m有機微孔濾膜，待上機測定。

1.3.3 儀器工作條件

色譜柱：C18柱（4.6mm×250mm，5?m）;檢測波長：280nm;柱溫：30℃;流動相：A為1.5%乙酸-水溶液（體積分?jǐn)?shù)），B為乙腈;流速：1.0mL/min;進(jìn)樣量：10?L;洗脫梯度見表1。

2 試驗條件優(yōu)化

2.1 流動相選擇

乙腈-水溶液和甲醇-水溶液分離效果對比。本試驗比較了乙腈-水溶液和甲醇-水溶液分別作為流動相的分離效果。結(jié)果表明，當(dāng)流動相為甲醇-水溶液時，DG和BHT出峰時間較晚且色譜峰嚴(yán)重重疊，不能實現(xiàn)完全分離;而流動相為乙腈-水溶液時，7種抗氧化劑的色譜峰分離效果較好，且出峰時間快、雜質(zhì)干擾少。

乙酸-水溶液最佳濃度的確定。在相同的洗脫梯度下，本試驗比較了不同乙酸-水溶液濃度對7種抗氧化劑總體分離效果的影響。結(jié)果表明，當(dāng)乙酸-水溶液濃度為1.5%時，7種抗氧化劑實現(xiàn)完全分離，且峰形較好;當(dāng)濃度繼續(xù)增加時，OG和Ionox-100色譜峰出現(xiàn)重疊現(xiàn)象。因此，本試驗選擇乙酸-水溶液的最佳濃度為1.5%。

2.2 洗脫梯度選擇

由于同時測定的抗氧化劑種類較多且保留時間相近，優(yōu)選洗脫梯度對實現(xiàn)最佳分離效果較為重要。通過反復(fù)多次試驗，綜合考慮保留時間和分離效果，本試驗最終確定了流動相為乙腈-1.5%乙酸水溶液條件下的梯度洗脫程序，見表1。

2.3 提取條件選擇

《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中9種抗氧化劑的測定》（GB 5009.32—2016）采用C18固相萃取柱或凝膠滲透色譜進(jìn)行提取液凈化，整個操作過程步驟繁瑣、凈化時間長且有機溶劑消耗量大，不利于日常大批量檢測工作的開展。因此，本文在省去凈化步驟的情況下與《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中9種抗氧化劑的測定》（GB 5009.32—2016）進(jìn)行了加標(biāo)回收率對比試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)未受雜質(zhì)明顯干擾，且兩者的加標(biāo)回收率均在90%以上，達(dá)到了相同的提取效果。

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性關(guān)系

將本文1.3.1中配制的7種抗氧化劑混合標(biāo)準(zhǔn)使用液1mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L、100mg/L進(jìn)行上機測定，得到標(biāo)準(zhǔn)液相色譜圖，見圖1。以濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到7種抗氧化劑的回歸方程及相關(guān)系數(shù)，見表2。結(jié)果表明，當(dāng)線性范圍在1～100mg/L時，濃度與峰面積呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，7種抗氧化劑的相關(guān)系數(shù)均大于0.999。

3.2 檢出限

以儀器噪聲3倍的色譜峰高作為最低檢出衡量指標(biāo)，根據(jù)稱樣量、定容體積，計算出該方法中7種抗氧化劑的最低檢出限，大大低于《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中9種抗氧化劑的測定》（GB 5009.32—2016）中相應(yīng)的檢出限要求，結(jié)果見表2。

3.3 加標(biāo)回收試驗

分別以大豆油空白樣品和玉米油空白樣品為本底，各自做2.0mg/kg、20.0mg/kg、100.0mg/kg三個添加水平的回收試驗，每個添加水平平行測定6次，結(jié)果見表3。由表3可知，大豆油和玉米油中三個添加水平的回收率在89.3%～110.1%，變異系數(shù)在1.5%～4.9%，符合準(zhǔn)確度要求。

4 結(jié)? 論

本試驗利用高效液相色譜建立了同時測定食用油中PG、TBHQ、BHA、BHT、Ionox-100、DG、OG 7種抗氧化劑含量的方法。與《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)?食品中9種抗氧化劑的測定》（GB 5009.32—2016）相比，該方法免去凈化步驟，操作簡便、試劑消耗少、分析速度快、分離效果好、準(zhǔn)確度高、檢出限低，適用于大批量食用油檢測中7種抗氧化劑的快速定量分析。

參考文獻(xiàn)

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[7] GB 2760—2014，食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)[S].

[8] GB 5009.32—2016，食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中9種抗氧化劑的測定[S].