李程錦, 宋長遠, 王 鵬, 陳珍珍, 許永玉,*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學植物保護學院, 山東泰安 271018;2.山東省煙臺市農(nóng)業(yè)科學研究院, 山東煙臺 265500)

植物在長期進化過程中形成了復(fù)雜的防御系統(tǒng)，大量的研究表明，植物在遭受昆蟲取食后，其體內(nèi)的生理生化及代謝可發(fā)生相應(yīng)的改變，引起植物體內(nèi)與防御有關(guān)物質(zhì)含量的變化。茶樹體內(nèi)含有大量的生物活性成分，如多酚類物質(zhì)、生物堿、糖類、氨基酸等，這些成分中有些在昆蟲取食后不利于昆蟲生長發(fā)育抑制了昆蟲的繁殖，使茶樹對昆蟲產(chǎn)生了抗性?？Х葔A是茶葉中重要的內(nèi)含成分，雖然沒有證據(jù)表明咖啡堿能直接影響昆蟲的生長發(fā)育，但通過對側(cè)多食跗線螨Polyphagotarsonemuslatus(劉奕清等, 1999)、假眼小綠葉蟬Empoascavitis(毛迎新等, 2009)的研究均發(fā)現(xiàn)咖啡堿含量高的茶樹品種抗蟲性較強。茶多酚是茶樹體內(nèi)多種酚類及其衍生物的總稱，具有濃烈的苦澀味和收斂性，可引起害蟲的拒食，從而起到保護茶樹的作用(張貽禮等, 1999)，兒茶素作為多酚類的一種，對葉螨類害蟲有一定的忌避作用(譚濟才和鄧欣, 1994)。茶樹所含氨基酸種類繁多，其中有些氨基酸可對昆蟲發(fā)育產(chǎn)生負面影響，如高濃度的谷氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸等對昆蟲生長發(fā)育有較強的抑制作用，這些氨基酸含量高的茶樹品種表現(xiàn)出較強的抗蟲性(劉奕清等, 1999)。糖分是昆蟲必需的營養(yǎng)成分，可溶性糖含量高的茶樹品種更有利于昆蟲的生長繁殖，被害指數(shù)高，品種抗蟲性較弱，反之害蟲發(fā)育不良、繁殖率下降，茶樹品種表現(xiàn)出抗蟲性(許寧等, 1996; 劉奕清等, 1999; 張貽禮等, 1999)。當植物受到昆蟲或其他不利環(huán)境條件的脅迫時，活性氧物質(zhì)會在體內(nèi)產(chǎn)生并積聚，對機體產(chǎn)生毒害作用。植物體內(nèi)的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)和其他氧化酶可以有效地清除這些自由基并抑制活性氧物質(zhì)對植物的傷害，提高機體的抗壓能力(劉明楊等, 2016)。

隨著山東茶區(qū)茶葉種植面積的不斷擴大，害蟲的種類逐漸增多，為害程度逐漸加重。文獻研究和目前田間調(diào)查可以看出，自2004年至今，黑刺粉虱Aleurocanthusspiniferus在山東茶園發(fā)生較為普遍，在局部茶園危害重，是山東茶園的主要害蟲之一(郭見早和馮志花, 2004; 邱忠蓮和袁洪剛, 2005; 段永春等, 2010)。黑刺粉虱隸屬半翅目(Hemiptera)粉虱科(Aleyrodidae)，除直接刺吸為害外，其排泄物產(chǎn)生的茶煤病Neocapnodiumtheae也會降低茶樹葉片的光合作用，影響茶樹的生長。黑刺粉虱成蟲喜歡聚集在未完全展開的嫩葉上刺吸為害，且偏好在茶樹上部幼嫩葉片產(chǎn)卵，卵孵化后除1齡幼蟲可以活動外，其余幼蟲階段均固著刺吸為害，可直接影響茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)。黃金芽Camelliasinensiscv.Huangjinya為1998年由浙江余姚市德氏茶場發(fā)現(xiàn)的自然黃化變異單株培育而成的珍稀黃化茶樹品種，可采制名優(yōu)茶，其新稍伸展能力大，芽體較小，目前通過引種栽培，已成為可在山東種植的優(yōu)良品種。本研究團隊前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，黑刺粉虱在黃金芽品種上的發(fā)生量高于其他品種。為探求黑刺粉虱為害和黃金芽生長發(fā)育間的關(guān)系，本研究測定分析了黑刺粉虱不同為害程度對茶葉中茶多酚、可溶性糖、游離氨基酸、咖啡堿、兒茶素等生化成分含量和3種抗氧化酶(SOD, POD和CAT)活性的影響，對全面了解黑刺粉虱在黃金芽上的動態(tài)規(guī)律、黃金芽受害后的反應(yīng)和兩者間的互作關(guān)系提供基礎(chǔ)，同時也為該蟲在茶園的科學防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試茶樹

試驗地點為泰安市道朗鎮(zhèn)茶溪谷茶園(36°12′48.09″N, 116°56′4.27″E)，園內(nèi)以黑刺粉虱和小綠葉蟬為主要發(fā)生害蟲，尤其以黑刺粉虱發(fā)生嚴重。近幾年來，我們指導(dǎo)茶園經(jīng)營者在非采茶期使用聯(lián)苯聚酯壓低蟲口密度，而后通過使用黃板誘殺成蟲，茶園適時臺刈以及噴灑苦參堿、藜蘆堿等綠色防控措施，黑刺粉虱的危害得到了較好的控制。目前茶園內(nèi)局部茶叢發(fā)生較重，可能是由于茶園園區(qū)內(nèi)種植紅葉石楠、櫻花、松樹、柿子樹等造成環(huán)境郁閉引起的。試驗茶樹為5年生黃金芽。

1.2 茶樹葉片樣品收集

采樣方法參考Tian等(2018)以芽下第3片葉片觀察小貫小綠葉蟬Empoascaonukii刺吸為害對茶樹的影響的方法，于2018年9月份采集黑刺粉虱幼蟲為害不同級別的黃金芽茶樹芽下第3片葉片。按照在葉片上固著不動的2齡、3齡幼蟲的數(shù)量進行黑刺粉虱為害等級的劃分，共分為5個級別：Ⅰ級1～20頭，Ⅱ級20～40頭，Ⅲ級40～60頭，Ⅳ級大于60頭。以未經(jīng)黑刺粉虱危害的芽下第3片葉片作為對照(CK)，每個級別和對照分別采200個葉片備用。

1.3 茶葉生化成分含量測定

將部分采集的茶葉于110℃微波殺青5 min后，80℃烘干，并用磨碎機細磨成粉末后經(jīng)60目篩網(wǎng)篩除雜質(zhì)。每個生物學重復(fù)稱取儲備的樣品3.0 g放入500 mL錐形瓶中，加入450 mL沸水，然后將其置于沸水浴中浸提45 min，每10 min振蕩一次。浸提完畢后，趁熱減壓過濾。殘渣用少量熱蒸餾水洗滌2～3次，待茶湯冷卻至室溫后用蒸餾水定容至500 mL，備用。每個生化成分含量的測定均設(shè)3個生物學重復(fù)。

茶多酚的測定按國家標準(GB/T 8313-2008)進行測定。吸取備用茶湯1.0 mL，注入25 mL容量瓶中，加入4.0 mL蒸餾水、5.0 mL酒石酸亞鐵溶液，充分混勻，再用pH 7.5磷酸鹽緩沖液定容至刻度。以試劑空白溶液作參比，在波長540 nm處測定吸光度。

游離氨基酸含量按照國家標準(GB/T 8314-2013)進行測定。準確吸取備用茶湯1.0 mL，注入25 mL容量瓶中，加入0.5 mL的2%茚三酮溶液和0.5 mL的pH 8.0磷酸緩沖液，搖勻于沸浴中加熱15 min，取出冷卻至室溫后用蒸餾水定容至刻度，靜置10 min后，以試劑空白溶液作參比，在波長570 nm處測定吸光度。

咖啡堿含量按照國家標準(GB/T 8312-2013)進行測定。準確吸取8.0 mL茶湯于100 mL容量瓶中，加入4.0 mL 0.01 mol/L鹽酸溶液和0.8 mL 堿式醋酸鉛溶液，用水定容至刻度，混勻靜置后過濾。取濾液50 mL于100 mL容量瓶中，加入0.2 mL 4.5 mol/L硫酸溶液定容至刻度，混勻靜置后過濾。以試劑空白溶液作參比，在274 nm波長處測定吸光度。

兒茶素總量測定采用香莢蘭素比色法進行測定。稱取磨碎的茶樣1 g(精確至 0.01 g)，加20 mL 95%乙醇，在80℃～85℃水浴上提取30 min，使乙醇保持微沸。過濾冷卻后用95%乙醇定容至25 mL。吸取10 μL試液，加入盛有1 mL 95%乙醇的刻度試管中。搖勻后加入5 mL 1%香莢蘭素鹽酸溶液，加塞搖勻顯紅色。靜置40 min，以試劑空白作參比，在500 nm波長處測定吸光度。

可溶性糖含量的測定采用蒽酮法進行測定。吸取1 mL茶湯于25 mL容量瓶再加入8 mL蒽酮試劑，搖勻于沸水浴中加熱7 min，立即取出于冷水中冷卻至室溫。于波長620 nm處測定吸光度，空白對照以1 mL水替代茶湯。

1.4 茶葉抗氧化酶活性的測定

將采集到的不同為害級別的黃金芽葉片鮮葉按重量體積比(g∶mL)為1∶9(CAT)、1∶4(SOD)、1∶9(POD)的比例加入生理鹽水研磨勻漿后，25℃ 2 500 r/min離心10 min,取上清用于組織勻漿蛋白濃度及酶活性測定。每處理均設(shè)3個生物學重復(fù)。

組織勻漿蛋白濃度測定：根據(jù)檢測試劑盒考馬斯亮藍法(南京建成生物工程研究所)測定各樣品中的勻漿蛋白濃度。

CAT, SOD和POD的活力測定嚴格按照檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)進行。根據(jù)說明中的公式計算活力值。CAT, SOD和POD的活力測定波長分別為405, 550和420 mm。SOD活性單位定義為每克組織在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達50%時所對應(yīng)的SOD量為一個反應(yīng)單位；POD活力定義為在37℃條件下，每毫克組織蛋白每min催化1 μg底物的酶量定義為一個酶活力單位；CAT活力定義為每毫克組織蛋白每秒分解1 μmol的H2O2的量為一個活力單位。

1.5 數(shù)據(jù)分析

黑刺粉虱不同為害級別間生化成分及抗氧化酶活力的差異用SPSS19.0軟件進行分析。通過Shapiro-Wilk檢驗和方差同質(zhì)性檢驗(homogeneity of variance test)分析數(shù)據(jù)分布的正態(tài)性和方差齊性，得到所有數(shù)據(jù)均為正態(tài)分布，方差具有同質(zhì)性，隨后進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，對不同處理間的差異進行Tukey HSD多重比較分析(P<0.05)。

2 結(jié)果

2.1 黑刺粉虱為害不同級別下黃金芽茶葉生化成分含量的變化

隨著黑刺粉虱刺吸黃金芽為害級別的增加，茶葉中茶多酚含量逐漸降低(圖1)。除為害級別為Ⅰ級時的茶多酚含量(23.20%±0.67%)與對照之間(25.21%±0.23%)沒有顯著性差異(P=0.256)外，其余各為害級別的茶多酚含量均顯著低于未受到為害的(F4,10=13.650,P<0.001)，且以危害級別為Ⅳ級時茶多酚含量最低，為18.82%±0.21%。黑刺粉虱為害不同級別對黃金芽茶葉中游離氨基酸、咖啡堿、可溶性糖及兒茶素含量的影響均無顯著性差異(游離氨基酸:F4,10=2.001,P=0.170; 咖啡堿:F4,10=0.656,P=0.636; 可溶性糖:F4,10=0.734,P=0.589; 兒茶酚:F4,10=1.004,P=0.450)。

圖1 黑刺粉虱為害不同級別下黃金芽芽下第3葉內(nèi)生化成分含量的變化

2.2 黑刺粉虱為害不同級別下黃金芽茶葉抗氧化酶活力的變化

黑刺粉虱為害黃金芽后，當為害級別達到Ⅰ級和Ⅳ級時黃金芽茶葉中POD活力(分別為57.14±3.98和39.74±0.56 U/mg pro)較未經(jīng)為害的(34.51±2.20 U/mg pro)有顯著的提高，而達到Ⅱ級(28.81±1.01 U/mg pro)和Ⅲ級(20.84±1.29 U/mg pro)時顯著降低，各為害級別間的活力均存在顯著性差異(F4,10=140.348,P<0.001)；當黑刺粉虱為害級別達Ⅰ級時黃金芽茶葉中CAT活力最高，為28.05±0.40 U/mg pro，且顯著高于其他為害等級，達到Ⅳ級(13.10±0.60 U/mg pro)時的活力顯著降低(F4,10=46.546,P<0.001)；黃金芽茶葉中SOD活力隨著黑刺粉虱為害等級的增加顯著下降(P<0.05)，除為害級別為Ⅰ級時SOD活力(863.60±46.06 U/mg pro)與CK(783.11±17.52 U/mg pro)相比無顯著性差異(P>0.05)外，其余為害等級間均存在顯著性差異(F4,10=171.668,P<0.001)，且以為害級別為Ⅳ級時SOD活力最低，為442.73±10.54 U/mg pro。

3 討論

3.1 黑刺粉虱為害對黃金芽茶葉生化成分含量的影響

茶樹體內(nèi)的茶多酚、游離氨基酸、咖啡堿、可溶性糖、兒茶素等物質(zhì)的含量變化影響茶葉的口感和品質(zhì)，也是茶樹表現(xiàn)對害蟲抗性的生化基礎(chǔ)。本研究以黃金芽芽下第3葉為研究對象，依據(jù)是黑刺粉虱成蟲產(chǎn)卵于新展開的嫩芽上，隨著幼蟲的孵化生長及新芽的出現(xiàn)而變成第3-4葉，且第3-4葉具有相對較大的葉面積和較強的光合能力，干物質(zhì)積累較大(王峰等, 2016)，其同化產(chǎn)物為新芽發(fā)育提供重要營養(yǎng)物質(zhì)。本研究的結(jié)果可以看出，黑刺粉虱不同為害級別對茶葉內(nèi)茶多酚、游離氨基酸、咖啡堿、可溶性糖、兒茶素含量的變化有不同的影響(圖1)。

植物被昆蟲為害后，體內(nèi)部分生化成分的種類及數(shù)量會有所改變，包括營養(yǎng)物質(zhì)含量和次生代謝物的變化，而寄主植物的營養(yǎng)狀況也是影響植食性昆蟲的生長、發(fā)育和繁殖的重要因素，同時也是影響其寄主選擇性的重要因素(陳常頌等, 2007)。糖類是生物體內(nèi)能量的主要來源，葛超美等(2018)研究發(fā)現(xiàn)，可溶性糖含量高的茶樹品種被害指數(shù)高，茶樹抗性品種新梢的含糖量明顯低于易感品種。李傳明等(2017)對煙粉虱的研究發(fā)現(xiàn)，辣椒葉片中可溶性糖含量隨煙粉虱為害呈明顯下降趨勢，抗蟲品種的下降幅度大于感蟲品種。本研究的結(jié)果顯示，黑刺粉虱為害不同等級下的黃金芽體內(nèi)可溶性糖的含量與對照沒有明顯變化，可能是由于茶樹自身應(yīng)對蟲害損失提高了自身的補償能力。研究表明，在適當?shù)臈l件下，植物可以通過一系列生理變化對蟲害引起的損失進行補償或超補償(Trumbleetal., 1993; Lennartssonetal., 1998)，且茶樹對茶尺蠖Ectropisobliqua取食危害的光補償反應(yīng)也印證了這一觀點(童鑫等, 2007)。植物中酚類被認為可以通過植食性昆蟲取食誘導(dǎo)并參與植物的抗蟲作用中去(Czerniewiczetal., 2017)；葛超美等(2018)研究灰茶尺蠖Ectropisgrisescens對茶樹的選擇性研究發(fā)現(xiàn)其與茶樹體內(nèi)茶多酚含量呈負相關(guān)，說明茶多酚含量越高茶樹抗性越強。本研究發(fā)現(xiàn)，茶葉受危害后，體內(nèi)茶多酚的含量顯著下降，可能也會降低茶葉對黑刺粉虱的抵抗能力，而且隨著為害等級的增加茶多酚含量顯著下降，抗性的降低也可能使黑刺粉虱發(fā)生加重。王敏(2016)對小綠葉蟬的研究也發(fā)現(xiàn)相似的變化趨勢，即隨著危害程度的提高茶多酚含量顯著降低。此外，兒茶素是茶葉體內(nèi)主要的酚類成分。冉偉等(2018)研究發(fā)現(xiàn)，茶尺蠖幼蟲為害提高了茶樹兒茶素合成途徑的代謝強度和兒茶素類化合物的積累。本研究發(fā)現(xiàn)，黑刺粉虱為害黃金芽后體內(nèi)兒茶素含量有一定的升高，但是與對照差異不顯著(圖1)，說明影響茶多酚含量顯著降低是其他種類的酚酸類的減少造成的，需進一步研究。氨基酸是植食性昆蟲的主要氮源之一，并且植食性昆蟲取食添加氮元素的食物，通常會發(fā)育得更快而且能夠更好地存活和繁殖(Mattson, 1980; Woods, 1999; Leeetal., 2002; Chenetal., 2009)。Tomczak(2001)研究發(fā)現(xiàn)二斑葉螨Tetranychusurticae的為害會降低菊花葉片中游離氨基酸的濃度；對茶橙癭螨的研究發(fā)現(xiàn)茶樹新梢中氨基酸濃度較高時能在一定程度上能抑制其取食和繁殖，茶樹抗性與氨基酸含量呈正相關(guān)(陳華才等, 2000)；灰茶尺蠖幼蟲也不喜食游離氨基酸含量高的葉片(葛超美等, 2018)。本研究中黑刺粉虱的為害并沒有引起黃金芽體內(nèi)游離氨基酸含量的變化(圖1)。植物體內(nèi)咖啡堿與植物的抗蟲性可能存在一定的關(guān)系，Wang等(2016)研究發(fā)現(xiàn)了6個茶咖啡因合成酶(Tcs)基因，并推斷可能與抗蟲性有關(guān)，黑刺粉虱為害后黃金芽體內(nèi)咖啡堿的含量有所降低，但差異并不顯著，咖啡堿是否影響茶樹對黑刺粉虱的抗性還需要深入研究。

3.2 黑刺粉虱為害對黃金芽茶葉抗氧化酶活力的影響

植物通過抗氧化酶加強抗氧化作用提高對逆境的抗性，從而防止自由基毒害(Inbaretal., 1999; McKenzieetal., 2002)。刺吸式昆蟲的刺吸為害會導(dǎo)致植物體內(nèi)氧代謝的失調(diào)，體內(nèi)活性氧物質(zhì)的過度積累，造成生物膜的過氧化損傷，引起葉綠體、線粒體等細胞器的功能降低及DNA等其他大分子生物的降解和失活，最終引起細胞的凋亡(周丹丹等, 2009)。一旦體內(nèi)活性氧的含量超標，寄主植物便會啟動自身的活性氧清除系統(tǒng)包括酶促活性氧清除系統(tǒng)(如SOD, POD和CAT)和非酶促性活性氧清除劑(如類胡蘿卜素)等，對氧化脅迫具有一定的適應(yīng)及抵抗能力。受黑刺粉虱為害后黃金芽體內(nèi)的POD, CAT和SOD活力隨著為害等級的增加，均出現(xiàn)先升高后顯著降低的變化趨勢，且均在為害等級為Ⅰ級時有最大值(圖2)，這說明黃金芽對黑刺粉虱的為害并不能誘導(dǎo)形成明顯的抗氧化能力。當為害等級達到Ⅰ級，即黑刺粉虱刺吸為害較輕時，黃金芽體內(nèi)的POD和CAT活性會迅速上升，可會及時將過剩的自由基清除；隨著黑刺粉虱蟲量增多，為害等級增加，產(chǎn)生自由基的速度可能已經(jīng)超過SOD, CAT和POD的降解速度，使活性氧過度積累，造成生物膜的過氧化和葉綠體、線粒體等細胞器的功能損耗，導(dǎo)致黃金芽發(fā)育不良。

圖2 黑刺粉虱為害不同級別下黃金芽芽下第3葉內(nèi)抗氧化酶活力的變化

鄭雨婷等(2017)通過對比不同茶樹品種應(yīng)對茶小綠葉蟬為害后體內(nèi)抗性物質(zhì)的變化，發(fā)現(xiàn)不同學者對茶樹抗葉蟬性能與茶葉化學成分之間的說法不一致，需要進一步求證。本研究則是通過研究黑刺粉虱密度增加是否會引起茶樹自身防御物質(zhì)的改變，從而判斷茶樹自身是否對黑刺粉虱為害有一定的防御能力。王慶森等(2009)測定了12種茶樹葉片組織結(jié)構(gòu)與黑刺粉虱的發(fā)生關(guān)系，并發(fā)現(xiàn)黑刺粉虱的生殖與存活與氣孔密度呈顯著的正相關(guān)，與葉片下表皮厚度呈顯著的負相關(guān)。Tian等(2018)測量葉片組織發(fā)現(xiàn)黃金芽柵欄組織厚度和海綿組織厚度均大于福鼎大白，這可能是田間黃金芽上黑刺粉虱發(fā)生量較大的原因，還需要進一步研究。

3.3 結(jié)語

綜上所述，黑刺粉虱為害對黃金芽茶葉體內(nèi)與抗性提高相關(guān)的生化物質(zhì)咖啡堿和兒茶素含量，以及與抗逆補償相關(guān)的游離氨基酸和可溶性糖含量均沒有顯著性影響，但茶多酚含量顯著降低，3種抗氧化酶活性隨黑刺粉虱為害級別增加呈現(xiàn)先升高后顯著降低的趨勢，說明黃金芽抗黑刺粉虱為害的能力較弱，需要加強黃金芽上黑刺粉虱發(fā)生的科學管理。