陳瑤瑤, 古 楓, 鐘國(guó)華,*, 易 欣,*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510642;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510642)

求偶是指交配前雌雄一方為了獲得配偶而盡力展現(xiàn)及動(dòng)作而使另一方做出選擇的整個(gè)過(guò)程(Koganezawaetal., 2016)。而與多數(shù)昆蟲(chóng)一樣，實(shí)蠅也是一類具有求偶行為的昆蟲(chóng)，實(shí)蠅通過(guò)聚集形成求偶場(chǎng)，且雄成蟲(chóng)間相互競(jìng)爭(zhēng)以吸引雌成蟲(chóng)；接著雌成蟲(chóng)選擇具有最佳求偶行為的雄成蟲(chóng)并與之進(jìn)行交配(de Aquino and Joachim-Bravo, 2014; Ekanayakeetal., 2017)。在實(shí)蠅中，求偶行為通常被劃分為幾個(gè)關(guān)鍵階段：(1)雄成蟲(chóng)保衛(wèi)其求偶場(chǎng)避免其他雄成蟲(chóng)侵入，并通過(guò)嗅覺(jué)、視覺(jué)和聽(tīng)覺(jué)以吸引雌成蟲(chóng)；(2)雄成蟲(chóng)附近的單個(gè)雌成蟲(chóng)降落求偶場(chǎng)并爬向雄成蟲(chóng)；(3)雄成蟲(chóng)感受到雌成蟲(chóng)并進(jìn)行一次或多次交配的嘗試(Robinson and Hooper, 1989)。因此，在昆蟲(chóng)的求偶過(guò)程中，雌性和雄性昆蟲(chóng)具有不同的行為表現(xiàn)，被稱為性別二態(tài)現(xiàn)象(Greenspan and Ferveur, 2000)。這些行為信息受到一系列性別相關(guān)基因調(diào)控，并表現(xiàn)為受性別二態(tài)型神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控。

在眾多可以調(diào)控交配行為的基因中，fruitless(fru)基因是其中最特殊的一個(gè)。fru突變會(huì)造成果蠅求偶歌與求偶行為的異常，甚至直接影響交配，導(dǎo)致其不育(Leeetal., 2001; Rideoutetal., 2007)。更有趣的是，fru突變會(huì)使得雄性果蠅喪失辨別兩性的能力，直接導(dǎo)致的行為便是fru突變的雄成蟲(chóng)聚集在一起形成雄-雄交配鏈，產(chǎn)生激烈的雄-雄交配行為(Ryneretal., 1996)。研究證明，在果蠅中，fru基因編碼轉(zhuǎn)錄因子，其中一種可變剪接異構(gòu)體在雄性性別調(diào)控通路中起決定雄性求偶行為的作用(Yamamoto, 2008)。近年來(lái)分子生物學(xué)的發(fā)展使人們對(duì)求偶交配行為的調(diào)控有了更深層次的了解，特別是針對(duì)模式昆蟲(chóng)果蠅和家蠶的研究為我們了解昆蟲(chóng)求偶交配行為的內(nèi)在機(jī)制提供了豐富的數(shù)據(jù)信息。但昆蟲(chóng)求偶交配行為機(jī)制豐富多樣，不同昆蟲(chóng)通過(guò)不同基因調(diào)控求偶和交配行為。桔小實(shí)蠅Bactroceradorsalis作為一種對(duì)果蔬具有毀滅性影響的重要農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，fru對(duì)其求偶交配行為的調(diào)控機(jī)制尚不明確。

桔小實(shí)蠅作為雙翅目中重要的經(jīng)濟(jì)害蟲(chóng)，對(duì)其的研究可為雙翅目昆蟲(chóng)以及其他農(nóng)業(yè)昆蟲(chóng)提供重要的參考價(jià)值和豐富的數(shù)據(jù)信息。本研究對(duì)NCBI數(shù)據(jù)進(jìn)行分析查找，對(duì)篩選注釋為fru的基因進(jìn)行克隆驗(yàn)證和鑒定，并對(duì)序列蛋白結(jié)構(gòu)域等特征進(jìn)行分析，最后采用RNAi技術(shù)探究該基因是否對(duì)桔小實(shí)蠅的求偶交配行為發(fā)揮作用，從而進(jìn)一步了解該基因的功能以及桔小實(shí)蠅的求偶交配行為。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

本研究所用桔小實(shí)蠅在大小為30 cm×30 cm×30 cm的尼龍紗網(wǎng)養(yǎng)蟲(chóng)籠飼養(yǎng)于人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)，并建立室內(nèi)種群。成蟲(chóng)飼養(yǎng)溫度27±0.5℃，光照強(qiáng)度60%，相對(duì)濕度70%±5%，光周期14L∶10D。成蟲(chóng)飼料配方為蔗糖∶酵母=3∶1(m/m)，蔗糖用粉碎機(jī)打成粉末稱重，加入相應(yīng)比例的酵母粉，充分混勻。配制好后放于室溫備用，并保證飼料不超過(guò)30 d。

用新鮮橙汁倒入布滿孔的70 mL離心管中，并將其放入羽化20 d成蟲(chóng)養(yǎng)蟲(chóng)籠中，誘集成蟲(chóng)產(chǎn)卵。8 h后將離心管取出，通過(guò)紗布用清水將卵沖洗干凈后置入放有飼料的幼蟲(chóng)養(yǎng)蟲(chóng)盒中，并置于人工氣候培養(yǎng)箱。幼蟲(chóng)飼料配方：香蕉1 500 g、鮮玉米1 500 g、酵母粉150 g、蔗糖150 g、纖維素150 g、苯甲酸鈉6 g、鹽酸12 mL、蒸餾水1 250 mL，充分混勻，放入4℃冰箱備用，保證飼料不超過(guò)30 d。在羽化3 d內(nèi)，將雌雄分開(kāi)飼養(yǎng)，于羽化9 d后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 桔小實(shí)蠅頭部RNA的提取和cDNA第1鏈的合成

摘取桔小實(shí)蠅羽化10 d已交配的成蟲(chóng)頭部，用液氮將桔小實(shí)蠅頭部組織速凍，后用自動(dòng)研磨儀將組織磨碎，并使用Trizol Reagent(TaKaRa)提取組織RNA，于30 μL的無(wú)核酸酶水溶解。提取后用1.2%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)RNA的質(zhì)量，并于Spectrophotometer(Thermo Nano DropTM2000c; Santa Clara, 美國(guó))測(cè)定RNA的純度及濃度。根據(jù)TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime Script RT Reagent Kit with gDNA Eraser合成cDNA第1鏈，并按照說(shuō)明書(shū)去除基因組DNA。將合成好的cDNA于-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 桔小實(shí)蠅fru基因的cDNA克隆

NCBI上獲得桔小實(shí)蠅fru基因cDNA全長(zhǎng)序列(GenBank登錄號(hào): LOC105224493)，并采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)兩端引物Q-Fru-F和Q-Fru-R(表1)，以桔小實(shí)蠅頭部cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系(50 μL): Buffer 5 μL, dNTPs 5 μL, Mg2+3 μL, KOD酶1 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各1.5 μL, cDNA模板1 μL, ddH2O 32 μL。PCR反應(yīng)條件: 94℃預(yù)變性3 min; 98℃ 10 s, 55℃ 30 s, 68℃ 1.45 min, 35個(gè)循環(huán)；12℃保存。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離并進(jìn)行膠回收，將回收得到的DNA片段克隆到pMD19-T Vector載體上：DNA片段7 μL, pMD19-T Vector載體 0.3 μL, Solution I 3 μL, 4℃過(guò)夜。將混合體系轉(zhuǎn)化到大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，加1 mL LB培養(yǎng)基放置搖床37℃ 180 r/min培養(yǎng)1 h，于超凈工作臺(tái)中取100 μL菌液涂布在含有Ampicilin/X-gal/IPTG的LB固體培養(yǎng)基上，在37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12～16 h。藍(lán)白斑篩選后挑取陽(yáng)性單克隆在1 mL LB液體培養(yǎng)基(含Ampicilin)中培養(yǎng)12～16 h，將培養(yǎng)得到的菌液送往廣州擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序。用Megalign軟件將測(cè)序成功的片段拼接獲得桔小實(shí)蠅fru基因全長(zhǎng)cDNA，將得到的全長(zhǎng)序列與NCBI官網(wǎng)上的預(yù)測(cè)序列進(jìn)行比對(duì)驗(yàn)證。

表1 本研究中所用引物序列

1.4 桔小實(shí)蠅fru基因序列分析

將克隆獲得的fru基因所編碼的氨基酸序列在SMART(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)蛋白預(yù)測(cè)網(wǎng)站上，預(yù)測(cè)桔小實(shí)蠅FRU蛋白的分子量和等電點(diǎn)。在NCBI官網(wǎng)上獲得黑腹果蠅Drosophilamelanogaster、岡比亞按蚊Anophelesgambiae的fru編碼的氨基酸序列，同時(shí)在SilkDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得家蠶Bombyxmorifru編碼的氨基酸序列，將其放在SMART蛋白預(yù)測(cè)網(wǎng)站上，預(yù)測(cè)蛋白的結(jié)構(gòu)。并用軟件DNAMAN進(jìn)行比對(duì)，分析fru基因在進(jìn)化上是否具有保守性。黑腹果蠅D.melanogaster、岡比亞按蚊A.gambiae、家蠶B.morifru基因的GenBank登錄號(hào)分別為NM_00127783, AY785361和BGIBMGA006492-TA。

1.5 熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)

根據(jù)桔小實(shí)蠅fru序列，用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物。其中內(nèi)參為T(mén)ublin和EF1a，RT-qPCR所用引物序列見(jiàn)表1。

RT-qPCR反應(yīng)體系(10 μL): SYBB Green Supermix 5 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL, ddH2O 3.5 μL, cDNA 0.5 μL。反應(yīng)程序: 94℃預(yù)變性3 min; 95℃變性10 s, 58℃退火10 s, 72℃延伸30 s, 40個(gè)循環(huán)；溶解程序: 95℃ 10 s; 65℃ 5 s; 95℃ 5 s。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)，按照上述體系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.6 dsRNA的合成及注射

RNAi基因片段的T克?。河肞rimer Premier 5.0設(shè)計(jì)合適桔小實(shí)蠅fru基因dsRNA特異性片段PCR擴(kuò)增的特異性引物，其具體引物見(jiàn)表1。用帶T7啟動(dòng)子的引物進(jìn)行交叉PCR擴(kuò)增，將帶有T7啟動(dòng)子的PCR原液按照1.3節(jié)的方法進(jìn)行T克隆，將測(cè)序正確的陽(yáng)性菌液取50 μL在10 mL LB液體培養(yǎng)基(加Ampicilin)于37℃ 180 r/min搖床上培養(yǎng)12～16 h，將培養(yǎng)好的菌液按照質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，放于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

dsRNA的合成：對(duì)抽提的重組質(zhì)粒用EcoRI(TaKaRa)進(jìn)行酶切，獲得線性化質(zhì)粒。以線性化質(zhì)粒為模板，采用T7 RiboMAXTMExpress RNAi System Protocol試劑盒體外合成增強(qiáng)綠色熒光蛋白GFP基因和桔小實(shí)蠅fru的dsRNA。合成結(jié)束將其稀釋10倍用1.2%的瓊脂糖電泳分析合成的dsRNA的質(zhì)量，后用Spectrophotometer測(cè)定dsRNA的濃度及純度，并置于-80℃超低溫冰箱備用。

顯微注射dsRNA：取出保存的dsRNA，重新確定濃度，并顯微注射儀將其注射到羽化9 d的桔小實(shí)蠅雄成蟲(chóng)腹部(本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明在羽化9 d時(shí)，桔小實(shí)蠅求偶交配頻率達(dá)到最大值)，注射量為1 μg/頭(dsGFP和dsfru)，每個(gè)處理共注射100頭雄成蟲(chóng)。在注射后48和72 h取樣，于體視鏡下摘取桔小實(shí)蠅雄成蟲(chóng)頭部，采用RT-qPCR檢測(cè)干擾效率。將樣品用液氮速凍后于-80℃超低溫冰箱備用。

交配行為測(cè)定方法：在注射后72 h,將干擾的雄成蟲(chóng)與未干擾的雌成蟲(chóng)置入直徑8 cm、高20 cm并放有水盒和飼料的圓柱盒子中進(jìn)行配對(duì)，然后仔細(xì)觀察2 h內(nèi)雌雄求偶交配行為并統(tǒng)計(jì)交配頻率和交配持續(xù)時(shí)間。

1.7 數(shù)據(jù)分析

RT-qPCR實(shí)驗(yàn)每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，且每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)；依據(jù)RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果應(yīng)用2-△△CT法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)每個(gè)處理設(shè)置10個(gè)生物學(xué)重復(fù)(圓柱盒子)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)含10個(gè)雌雄試蟲(chóng)配對(duì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Excel表統(tǒng)計(jì)，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)及Bonferroni事后檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析，并用GraphPad Prism 5.0作圖。

2 結(jié)果

2.1 桔小實(shí)蠅fru的全長(zhǎng)克隆

依據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI中的fru序列信息，克隆獲得桔小實(shí)蠅的fru全長(zhǎng)序列，經(jīng)比對(duì)測(cè)序結(jié)果與NCBI官網(wǎng)上的預(yù)測(cè)序列相一致。序列全長(zhǎng)為2 865 bp，編碼954個(gè)氨基酸。將該基因所編碼的氨基酸序列在SMART(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)蛋白預(yù)測(cè)網(wǎng)站上，預(yù)測(cè)了桔小實(shí)蠅FRU蛋白的分子量、等電點(diǎn)和特殊結(jié)構(gòu)域：即桔小實(shí)蠅FRU蛋白序列中含有一個(gè)BTB(Broad-complex, Tramtrack and Bric-a-bric)結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)鋅指(zinc finger)結(jié)構(gòu)域(圖1)。其中FRU蛋白的等電點(diǎn)為6.01，蛋白分子量大小為104.1 kD。

根據(jù)蛋白預(yù)測(cè)網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)，黑腹果蠅D.melanogaster、岡比亞按蚊A.gambiae、家蠶B.mori的FRU蛋白序列在N端亦存在BTB結(jié)構(gòu)域和C端是兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域。經(jīng)過(guò)序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)，它們的N端非常保守，同源性為87.76%(圖1: A)。然而在兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域中，桔小實(shí)蠅和岡比亞按蚊的同源性較高，黑腹果蠅與家蠶的同源性較高(圖1: B和C)。因此，fru基因非常保守，BTB結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)域是該基因的特點(diǎn)。

圖1 昆蟲(chóng)物種間FRU功能域的序列比對(duì)

2.2 fru基因在桔小實(shí)蠅成蟲(chóng)不同組織中的表達(dá)情況

嗅覺(jué)、味覺(jué)在求偶性信息素識(shí)別的過(guò)程中至關(guān)重要，而主要行使嗅覺(jué)功能的是觸角、下顎須等組織。在本研究中，我們解剖羽化后9 d的雄成蟲(chóng)腦、下顎須和觸角等感官組織，采用RT-qPCR檢測(cè)這些組織中fru基因的表達(dá)量。結(jié)果表明：桔小實(shí)蠅中的fru基因在成蟲(chóng)觸角、下顎須和腦中均有表達(dá)。這些感官組織分布在頭部，因此在本研究中我們選取頭部作為主要檢測(cè)對(duì)象(圖2)。

圖2 fru基因在桔小實(shí)蠅9日齡雄成蟲(chóng)不同組織中的表達(dá)譜

2.3 fru在桔小實(shí)蠅雄成蟲(chóng)不同交配狀態(tài)下的表達(dá)差異檢測(cè)

RT-qPCR檢測(cè)在桔小實(shí)蠅雄成蟲(chóng)交配前和交配后4 h之內(nèi)fru基因的表達(dá)量差異，結(jié)果表明，相較于未交配雄成蟲(chóng)，fru在桔小實(shí)蠅雄成蟲(chóng)頭部中的表達(dá)量在與雌成蟲(chóng)交配后顯著上升(P<0.001)(圖3)。

圖3 fru基因在不同交配狀態(tài)下桔小實(shí)蠅雄成蟲(chóng)頭部中的相對(duì)表達(dá)量

2.4 RNAi干擾效率檢測(cè)

RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組(注射DEPC水)和陰性對(duì)照組(注射dsGFP)相比，注射了dsfru的處理組中fru基因的表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)；與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，處理組中fru基因表達(dá)水平在注射后48 h分別下降了51.66%和47.82%(圖4: A)，在注射后72 h分別下降了72.16%和73.65%(圖4: B)，因此后續(xù)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)選擇在干擾后72 h統(tǒng)計(jì)交配結(jié)果。

圖4 RNAi后48 h(A)和72 h(B)桔小實(shí)蠅成蟲(chóng)fru基因的相對(duì)表達(dá)量

2.5 RNAi探究fru在求偶行為中的功能

據(jù)我們觀察可知，桔小實(shí)蠅的求偶行為可以分為以下幾個(gè)步驟：當(dāng)雄性發(fā)現(xiàn)一個(gè)較為感興趣的雌性時(shí)，跟隨其后。接近雌性桔小實(shí)蠅時(shí)，雄性保持翅靠近腹部，并震動(dòng)翅膀，持續(xù)幾秒到幾分鐘。而雌性會(huì)被雄性的振翅(求偶歌)所吸引，較少與振翅時(shí)間短(少于30 s)的雄性交配。雌性被雄性的求偶歌所包圍時(shí)，較為平和，雄性會(huì)趁機(jī)舔舐雌性的生殖器，取悅雌性。待時(shí)機(jī)成熟時(shí)，雄性會(huì)爬上雌性背部嘗試交配(未遂交配)。受到求偶歌和舔舐的影響，雌性會(huì)打開(kāi)陰道板開(kāi)始交配。

將已注射dsfru、DEPC水和dsGFP的雄成蟲(chóng)分別與未進(jìn)行注射的雌成蟲(chóng)進(jìn)行配對(duì)。結(jié)果表明(圖5)，注射了dsfru的處理組相對(duì)于空白對(duì)照組(注射DEPC水)和陰性對(duì)照組(注射dsGFP)交配所花費(fèi)的時(shí)間大幅度提高。在對(duì)照組中，在60 min后超過(guò)60%的雄成蟲(chóng)進(jìn)入交配階段，且交配頻率達(dá)到最大值。但是注射了dsfru的處理組，在90 min后雌雄交配頻率達(dá)到了最大值，僅有不到40%的雄成蟲(chóng)進(jìn)入交配階段，且直到觀察結(jié)束(120 min)一直在該交配頻率上下浮動(dòng)。該結(jié)果表明，當(dāng)fru基因表達(dá)量下調(diào)時(shí)會(huì)直接導(dǎo)致桔小實(shí)蠅的交配行為受到抑制，具體表現(xiàn)為求偶時(shí)間延長(zhǎng)(比空白對(duì)照組延長(zhǎng)了25～35 min)，交配成功率下降(比空白對(duì)照組下降了17%～22%)，說(shuō)明fru基因在桔小實(shí)蠅的求偶交配行為中發(fā)揮著重要作用。

圖5 RNAi干擾fru對(duì)桔小實(shí)蠅成蟲(chóng)交配頻率和交配持續(xù)時(shí)間的影響

3 討論

在果蠅中，fru基因編碼轉(zhuǎn)錄因子，其中一種可變剪接異構(gòu)體在雄性性別調(diào)控通路中參與雄性求偶行為，而其他可變剪接異構(gòu)體則不具有性別特異性(Salveminietal., 2010; Satoetal., 2019)。在雄性果蠅中，fru基因前體發(fā)生剪接，將位于2號(hào)外顯子上的雌性特異性調(diào)節(jié)區(qū)切除，加上雄性特異性5′剪接位點(diǎn)和位于3號(hào)外顯子的3′剪接位點(diǎn)，編碼BTB結(jié)構(gòu)域。因此，雄性特異性FRU蛋白在BTB結(jié)構(gòu)域上游具有雄性特異的、長(zhǎng)101個(gè)氨基酸的N末端。且有研究表明這個(gè)FRU蛋白在雄性的求偶行為中也是必要的(Telonis-Scottetal., 2009; Itoetal., 2016)，這與本研究結(jié)果一致。所有報(bào)道的FRU蛋白亞型都含有一個(gè)BTB結(jié)構(gòu)域，這個(gè)結(jié)構(gòu)域可以行使二聚體化的功能，同時(shí)在C末端具有ZnF結(jié)構(gòu)與作為DNA結(jié)構(gòu)識(shí)別區(qū)，表明FRU蛋白可能作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下游基因的表達(dá)(Vernes, 2014)。且進(jìn)化分析表明桔小實(shí)蠅fru基因序列與果蠅等昆蟲(chóng)在N端非常保守，預(yù)示著該基因在各個(gè)昆蟲(chóng)中行使類似的功能。

fru在果蠅的性取向、求偶和交配行為中都發(fā)揮著十分重要的作用。在果蠅中，fru基因的突變可以導(dǎo)致雄性果蠅的許多交配和求偶行為的改變(Gaileyetal., 2005; Watanabe, 2019)。除此之外，雄性對(duì)配偶辨別跟嗅覺(jué)、味覺(jué)、視覺(jué)等感器接受外界信號(hào)息息相關(guān)：當(dāng)果蠅的觸角、下顎須嗅覺(jué)組織被剝奪時(shí)，與對(duì)照組相比，雄性求偶頻率顯著下降(Liuetal., 2008)。且據(jù)報(bào)道，fru神經(jīng)元在味覺(jué)、視覺(jué)、嗅覺(jué)等區(qū)域都有分布(Leeetal., 2000)。本研究結(jié)果與前期研究一致，在桔小實(shí)蠅中，fru基因在觸角、下顎須、腦組織中均有所表達(dá)(圖2)，因此嗅覺(jué)系統(tǒng)可能與fru基因?qū)崿F(xiàn)相互作用，并在桔小實(shí)蠅交配行為中發(fā)揮著一定的作用。且所涉及參與交配行為的組織主要分布在頭部，因此在本研究中我們選取頭部作為主要檢測(cè)對(duì)象。fru基因在桔小實(shí)蠅雄成蟲(chóng)不同交配狀態(tài)下頭部的相對(duì)表達(dá)量并不相同，相較于未交配雄成蟲(chóng)，fru基因在桔小實(shí)蠅雄成蟲(chóng)頭部中的表達(dá)量在與雌成蟲(chóng)交配后顯著上升(圖3)，因此說(shuō)明fru基因可能參與桔小實(shí)蠅的雄性求偶交配行為。

在果蠅中，當(dāng)FruM完全缺失或者表達(dá)下調(diào)時(shí)，雄蠅表現(xiàn)出對(duì)雌蠅求偶下降，對(duì)同性雄蠅強(qiáng)烈追逐以及交配失敗等行為異常。且研究表明人為地在雌性中表達(dá)FruM能夠使雌蠅展現(xiàn)出追逐、求偶歌等求偶現(xiàn)象(Villellaetal., 1997; Zhouetal., 2015; Shirangietal., 2016)，說(shuō)明FruM是求偶行為某些步驟形成的充分調(diào)控因素。因此，F(xiàn)ruM被稱為果蠅求偶的開(kāi)關(guān)分子(Satoetal., 2019; Wuetal., 2019)。在果蠅中，約有1 500個(gè)神經(jīng)元可表達(dá)FruM，fruP1Gal4在視覺(jué)、嗅覺(jué)、味覺(jué)以及腹神經(jīng)索區(qū)域都有分布(Leeetal., 2000; Stockingeretal., 2005)。因此，激活fruP1Gal4能夠誘導(dǎo)雄成蟲(chóng)在沒(méi)有求偶對(duì)象的情況下展現(xiàn)所有的求偶步驟，而失活fruP1Gal4神經(jīng)元?jiǎng)t使雄成蟲(chóng)求偶下降甚至完全消失(Manolietal., 2005)。與全變態(tài)昆蟲(chóng)不一樣的是，在雙斑蟀Gryllusbimaculatus中，該基因的表達(dá)并未呈現(xiàn)性別二態(tài)型，說(shuō)明fru在半變態(tài)昆蟲(chóng)中可能不直接參與求偶和性決定等交配行為(Watanabe, 2019)。因此，fru在果蠅求偶和交配行為中的重要作用不言而喻，但在其他昆蟲(chóng)中的功能作用以及參與形式還有待進(jìn)一步挖掘和揭示。本研究結(jié)果闡明了fru參與了桔小實(shí)蠅雌雄交配的行為中，RNAi引起的fru基因表達(dá)量的降低(圖4)會(huì)導(dǎo)致桔小實(shí)蠅求偶時(shí)間延長(zhǎng)以及交配成功率的下降(圖5)。與本研究結(jié)果一致，在家蠶中，使用RNAi降低fru基因的表達(dá)量后，只有20%的家蠶在10 min內(nèi)完成交配，與對(duì)照組中10 min內(nèi)80%的家蠶均已完成交配差異顯著(Zheng, 2016)，表明fru基因在家蠶求偶行為中發(fā)揮著重要作用。且作者還進(jìn)一步采用免疫沉淀篩選出4類潛在與FRU蛋白存在相互作用的蛋白(Zheng, 2016)，為進(jìn)一步研究FRU蛋白的功能提供了基礎(chǔ)。但是fru基因在家蠶中的不同剪切形式，對(duì)其功能的調(diào)控是否相同，且該基因是否是調(diào)控交配的必要條件亦不清楚。本研究結(jié)果也表明fru表達(dá)與桔小實(shí)蠅交配行為緊密相關(guān)，為揭示該基因在非模式昆蟲(chóng)中的功能和綠色防控桔小實(shí)蠅提供了有力證據(jù)，但fru基因(或FRU蛋白)具體以何種形式參與到這些行為中，還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究與驗(yàn)證。