王丹陽, 王予彤,2, 于良斌, 韓海斌, 徐林波,*, 崔艷偉,康愛國, 龐紅巖

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院草原研究所, 呼和浩特 010020; 2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學, 呼和浩特 010020;3.河北省張家口市康?？h植保站, 河北張家口 076650)

線粒體(mitochondrion)是真核生物細胞中一種重要的胞質(zhì)細胞器，在細胞代謝、凋亡、疾病和衰老中起著重要作用(Boore, 1999; Alcolado, 2005; Cameron, 2014)。線粒體基因具有結(jié)構簡單、組成穩(wěn)定、排列保守、母系統(tǒng)遺傳、進化速率快等特點，被廣泛應用于系統(tǒng)發(fā)育分析、種群遺傳分化等研究中(Boore, 1999; Ballard and Rand, 2005; Weietal., 2010a; 李倩, 2014)。對于大多數(shù)昆蟲而言，線粒體基因組通常是一個大小為15～20 kb的雙鏈閉合環(huán)狀分子，編碼37個基因，包括13個蛋白編碼基因(PCGs)2個核糖體RNA(rRNA)基因和22個轉(zhuǎn)運RNA(tRNA)基因，以及1個長的非編碼區(qū)(又稱為控制區(qū)或AT富含區(qū))(Wolstenholme and Clary, 1985; Boore, 1999; Sharkey and Chapman, 2017)。

膜翅目(Hymenoptera)是六足總綱中較為高等的類群，除了具有上述普遍特征外，其線粒體基因組還有重排率較高，基因重排程度在類群間有差異，廣腰亞目(Symphyta)排列較細腰亞目(Apocrita)保守等特點(魏書軍, 2009; Weietal., 2014)。繭蜂科(Braconidae)是膜翅目最大的科，已記錄了1 040多個屬，19 000余種(Wharton and van Achterberg, 2000; Weietal., 2010b; Lietal., 2016)，其中有許多種類是農(nóng)林害蟲的重要寄生性天敵。繭蜂科是研究寄生蟲模式演變的理想群體，而該家族報道完整的線粒體基因組較少(李倩, 2014; 宋勝楠, 2015)。而且，繭蜂科昆蟲幾乎全部營寄生生活(Dangerfield and Austin, 1998)，且寄主范圍極其廣泛，是重要的天敵資源昆蟲，對其深入、全面的研究才能更好地發(fā)揮其利用價值。

綠眼賽繭蜂Zelechlorophthalmus屬膜翅目(Hymenoptera)繭蜂科(Braconidae)優(yōu)繭蜂亞科(Euphorinae)，主要分布于我國河北、內(nèi)蒙古、遼寧、吉林、黑龍江、浙江、安徽、甘肅、寧夏、新疆等地(何俊華等, 2004)。綠眼賽繭蜂為內(nèi)寄生，是草地螟Loxostegesticticalis、甜菜夜蛾Spodopteraexigua和斜紋夜蛾Spodopteralitura等農(nóng)業(yè)重大害蟲的主要天敵(李倩等, 2017)。目前國內(nèi)僅有少量關于其形態(tài)學、生物學特性等方面的研究，尚無對綠眼賽繭蜂線粒體基因組全序列的研究報道(杜芹, 2015; 李倩等, 2017)。雖然繭蜂科線粒體基因組的信息已有報道，但是并不全面，而且繭蜂科昆蟲幾乎全部營寄生生活(Dangerfield and Austin, 1998)，且寄主范圍極其廣泛，是重要的天敵資源昆蟲，對其深入、全面的研究才能更好地發(fā)揮其利用價值。本研究對綠眼賽繭蜂線粒體全基因組進行了測定，結(jié)合GenBank中已收錄的21種繭蜂科昆蟲的線粒體基因組COX1序列進行比較分析，探討繭蜂科各亞科、各屬及種間的系統(tǒng)發(fā)育關系，旨在為綠眼賽繭蜂的種群遺傳學、分子生態(tài)學以及繭蜂科的分子系統(tǒng)發(fā)育研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

綠眼賽繭蜂成蟲于2018年5月采自中國農(nóng)業(yè)科學院草原研究所沙爾沁農(nóng)牧交錯區(qū)試驗基地，室內(nèi)以草地螟為寄主，在溫度21～23℃、相對濕度50%～70%、光周期16L∶8D條件下，以15%蜂蜜水繼代飼養(yǎng)繁育。

1.2 綠眼賽繭蜂總DNA的提取

取單頭成蟲用于總DNA提取，采用DNeasy DNA Extraction Kit試劑盒(QIAGEN)，參照說明書進行總DNA的抽提，提取后采用Thermo Scientific NanoDrop 2000檢測純度及濃度，采用瓊脂糖電泳和Agilent 2100 Bioanalyzer檢測其完整性。

1.3 序列測定

采用全基因組鳥槍法(whole genome shotgun, WGS)策略構建文庫，利用第二代測序技術(next generation sequencing, NGS)，基于Illumina MiSeq測序系統(tǒng)，對構建的文庫進行雙末端(paired-end, PE)測序。

1.4 基因組序列拼裝與注釋

采用A5-miseq v20150522(Coiletal., 2015)和SPAdesv3.9.0(Bankevichetal., 2012)對高質(zhì)量的二代測序數(shù)據(jù)進行從頭拼裝，構建contig和scaffold序列。根據(jù)拼接序列的測序深度提取序列，將高測序深度的序列同NCBI上的nt庫進行blastn(BLAST v2.2.31+)比對，挑出各拼接結(jié)果的線粒體序列。拼接結(jié)果整合：將以上不同軟件得到的線粒體拼接結(jié)果利用mummer v3.1軟件進行共線性分析，確定contig間的位置關系，進行contigs間gap的填補。使用pilon v1.18(Walkeretal., 2014)軟件對結(jié)果進行校正以得到最終的線粒體序列。使用MEGA7.0對線粒體基因組各部分的堿基組成和相對同義密碼子使用頻率(relative synonymous codon usage, RSCU)進行統(tǒng)計。

將拼接得到的完整的線粒體基因組序列上傳至MITOS網(wǎng)頁服務器(http:∥mitos.bioinf.uni-leipzig.de)進行功能注釋(Berntetal., 2013)。其中Genetic Code選擇設置為05-inverterbrate，其余設置按照MITOS設置的默認參數(shù)，分別計算線粒體全基因組、蛋白編碼基因、基因排列順序、rRNA基因的堿基組成等。采用OGDRAM(ogdraw.mpimp-golm.mpg.del)在線可視化軟件繪制線粒體全基因組圈圖(Lohseetal., 2013)。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

以蜜蜂科的兩個種小蜜蜂Apisflorea和大蜜蜂Apisdorsata為外群，選用已報道的21種繭蜂科昆蟲和綠眼賽繭蜂的線粒體基因組COXⅠ基因的核苷酸序列，通過MEGAX的Align by Clustal-X程序進行序列比對(Kumaretal., 2016)，利用MEGA-X軟件采用最大似然法(ML)和鄰接法(NJ)構建繭蜂科的系統(tǒng)發(fā)育樹。系統(tǒng)樹分支的置信水平用bootstrap test(Felsenstein, 1985)估計，重復抽樣1 000次。

2 結(jié)果

2.1 綠眼賽繭蜂線粒體基因組的基因組成

綠眼賽繭蜂線粒體基因組全長16 661 bp(GenBank登錄號: MG822749)，基因組的基因排布與已報道繭蜂科其他種類的(Weietal., 2014; Lietal., 2016)相似度高，呈雙鏈閉合環(huán)狀結(jié)構(圖1)。基因組成包含13個蛋白質(zhì)編碼基因(PCGs)、22個tRNA基因、2個rRNA基因(rrnS和rrnL)和1個AT控制區(qū)(CR)。13個蛋白質(zhì)編碼基因中有4個(NAD1,NAD4l,NAD4,NAD5)在N鏈上，其余9個(Cob,NAD6,NAD3,COX3,ATP6,ATP8,COX2,COX1,NAD2)在J鏈上；22個tRNA基因中有10個位于N鏈，12個位于J鏈上；2個rRNA基因均位于N鏈上，其中rrnS基因長748 bp，位于tRNAIle(I)和tRNAVal(V)之間；rrnL基因長1 264 bp，位于tRNAVal(V)和tRNALeu-1(L1)之間(圖1)；控制區(qū)長度418 bp，位于tRNAGln(Q)和tRNAMet(M)之間。

圖1 綠眼賽繭蜂線粒體基因組結(jié)構

綠眼賽繭蜂線粒體基因組上的基因排列順序與昆蟲線粒體原始排列(魏書軍, 2009; 魏書軍和陳學新, 2011)存在一定差異。13個蛋白質(zhì)編碼基因和2個rRNA基因的排列順序和方向均相同，7個tRNA基因發(fā)生重排。tRNACys(C)從tRNATrp(W)和tRNATyr(Y)之間移到了COX3和tRNAGly(G)之間，tRNAAsn(N)從tRNASer-1(S1)和tRNAArg(R)之間移到了tRNAPhe(F)和NAD5之間，tRNALys(K)和tRNAAsp(D)以及tRNASer-1(S1)和tRNASer-2(S2)發(fā)生了基因位置互換，tRNAIle(I)發(fā)生了倒置，tRNAMet(M)和tRNAGln(Q)發(fā)生了異位倒置。

綠眼賽繭蜂線粒體基因組有16處基因重疊，共107 bp，最長重疊位于COX1和tRNATyr(Y)之間，重疊序列長24 bp。基因間隔區(qū)域有18處，共1 886 bp，最長間隔854 bp，位于tRNASer-2(S2)和Cob之間；其次為NAD1和tRNASer-2(S2)之間，間隔236 bp。既無重疊又無間隔有4處(表1)。

表1 綠眼賽繭蜂線粒體基因組特征分析

2.2 綠眼賽繭蜂線粒體基因組核苷酸組成

綠眼賽繭蜂線粒體基因組中，A, T, G和C含量分別為43.00%, 39.84%, 10.09%和7.08%，A含量最高而C含量最低(表2)。全基因組的A+T總量高達82.83%，G+C含量為17.17%，呈現(xiàn)明顯的A+T偏好性，符合昆蟲線粒體基因組中A+T含量偏向性的特征(夏靖等, 2011; 王菊平等, 2015; 鐘健等, 2017)。綠眼賽繭蜂基因組全序列的AT偏斜(AT-skew)為0.038，GC偏斜(GC-skew)為0.176，表明A多于T，G多于C。從不同的基因來看，蛋白質(zhì)編碼基因的AT偏斜均為負值，J鏈上9個蛋白質(zhì)編碼基因的GC偏斜為負值。N鏈上4個蛋白質(zhì)編碼基因和rRNA基因的GC偏斜均為正值，與大多數(shù)昆蟲的線粒體基因組AT/GC偏斜(彭艷等, 2017)一致。

表2 綠眼賽繭蜂線粒體基因組的核苷酸組成

2.3 綠眼賽繭蜂線粒體基因組蛋白質(zhì)編碼基因(PCGs)

綠眼賽繭蜂線粒體蛋白質(zhì)編碼基因長度與其他膜翅目昆蟲線粒體蛋白編碼基因相似，13個蛋白質(zhì)編碼基因均以ATN為起始密碼子，以TAA為終止密碼子，其中NAD3以ATA為起始密碼子，NAD6,NAD4l,NAD5,ATP8,COX1和NAD2以ATT為起始密碼子，其余6種均以ATG作為起始密碼子。綠眼賽繭蜂線粒體蛋白質(zhì)編碼基因的相對同義密碼子使用頻率(RSCU)見表3。綠眼賽繭蜂線粒體蛋白質(zhì)編碼基因?qū)和T有明顯的偏向性，使用最多的5個密碼子是AAA(Lys)525次、UAA(終止密碼子)465次、UUA(Leu)459次、AAU(Asn)420次和UUU(Phe)394次。只有Met和Trp僅有一種密碼子，分別為AUG和UGG。除了Met和Trp外，綠眼賽繭蜂蛋白質(zhì)編碼基因使用頻率最高密碼子第3位偏好使用A和U，與一些膜翅目昆蟲(Fanetal., 2017; 彭艷等, 2017)相似，蛋白質(zhì)編碼基因的氨基酸百分比最高者為Ile(15.3%)，其次為Leu(13.2%), Lys(11.2%)和Phe(8.6%)。

表3 綠眼賽繭蜂線粒體基因組相對同義密碼子使用頻率(RSCU)

2.4 綠眼賽繭蜂線粒體基因組tRNA基因和rRNA基因

綠眼賽繭蜂線粒體基因組的22個tRNA基因與其他膜翅目昆蟲線粒體基因組對應的tRNA反密碼子相同，除tRNALeu和tRNASer有兩個tRNA結(jié)構外，其他都只有一個與之對應。除tRNAHis(H)缺失TΨC環(huán)和tRNACys(C)僅剩DHU臂和反密碼子臂外，其他tRNA基因都能形成典型的三葉草式二級結(jié)構(圖2)。在三葉草結(jié)構中還發(fā)現(xiàn)有6處錯配：tRNAAla(A)有1處，錯配于氨基酸臂上；tRNAPhe(F), tRNAGly(G)和tRNAVal(V)各有1處，位于DHU臂上；tRNAGln(Q)有2處，分別位于DHU臂和反密碼子臂上，發(fā)生錯配的堿基均為G-U。

圖2 綠眼賽繭蜂線粒體基因組tRNA基因二級結(jié)構

綠眼賽繭蜂線粒體基因組的2個rRNA基因與大部分昆蟲線粒體rRNA基因相比類似，具有明顯的AT堿基偏向性，rrnS與rrnL的長度分別為748 bp和1 264 bp(表1)，A+T的含量分別為85.03%和85.28%(表2)。

2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

以蜜蜂科為外群，基于已報道的21個繭蜂科種和綠眼賽繭蜂的線粒體基因組COX1蛋白編碼基因序列，采用最大似然法(ML)和鄰接法(NJ)利用MEGA-X軟件構建繭蜂科的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3和4)。最大似然法分析結(jié)果(圖3)表明，繭蜂科各個種群分類關系為蚜繭峰亞科Aphidiinae+(長體繭蜂亞科Macrocentrinae+毛繭蜂亞科Doryctinae+探繭峰亞科Ichneutinae+(窄徑繭蜂亞科Agathidinae+折脈繭蜂亞科Cardiochilinae))+優(yōu)繭峰亞科Euphorinae；鄰接法分析結(jié)果表明，優(yōu)繭峰亞科Euphorinae+(蚜繭峰亞科Aphidiinae+((窄徑繭蜂亞科Agathidinae+折脈繭蜂亞科Cardiochilinae)+(探繭峰亞科Ichneutinae)+(長體繭蜂亞科Macrocentrinae+毛繭蜂亞科Doryctinae)))。綜合比較，兩種方法構建的系統(tǒng)發(fā)育樹大致相同。在系統(tǒng)發(fā)育樹中，繭蜂科主要分為3支，蚜繭峰亞科為一支，優(yōu)繭蜂亞科為一支，剩余的一支包括長體繭蜂亞科、毛繭蜂亞科、探繭蜂亞科、折脈繭蜂亞科和窄徑繭蜂亞科。窄徑繭蜂亞科(Agathidinae)和折脈繭蜂亞科(Cardiochilinae)在兩種方法中都為姐妹群。綠眼賽繭蜂聚于優(yōu)繭蜂亞科賽繭蜂屬，與傳統(tǒng)形態(tài)分類學結(jié)果一致，其與雪跗賽繭蜂Zeleniveitarsis親緣關系較近。

圖3 最大似然法構建的基于線粒體COX1序列的繭蜂科22個種的系統(tǒng)發(fā)育樹(1 000次重復)

圖4 鄰接法構建的基于線粒體COX1序列的繭蜂科22個種的系統(tǒng)發(fā)育樹(1 000次重復)

3 討論

亞庫巴果蠅Drosophilayakuba線粒體基因組的排列方式被認為是昆蟲線粒體基因組最原始的排列方式(魏書軍和陳學新, 2011)，綠眼賽繭蜂線粒體基因組與其相比，存在基因重排現(xiàn)象。本研究通過與繭蜂科其他種的線粒體基因組比較分析，發(fā)現(xiàn)綠眼賽繭蜂線粒體基因組重排多出現(xiàn)于tRNA基因中，除tRNALeu-2(L2)處于COX1和COX2之間較穩(wěn)定，沒有出現(xiàn)重排外，其余tRNA基因都曾出現(xiàn)重排現(xiàn)象。膜翅目分為廣腰亞目(Symphyta)和細腰亞目(Apocrita)兩個類群，廣腰亞目的基因排列相比細腰亞目保守，重排較少(宋勝楠, 2015)，但細腰亞目存在大量重排，包括移位、原位倒置、異位倒置(Weietal., 2010b)，而綠眼賽繭蜂屬于細腰亞目。膜翅目線粒體具有較高的重排速率，主要集中發(fā)生于AT富含區(qū)NAD2,NAD2-COX1,COX2-ATP8和NAD3-NAD5區(qū)(魏書軍, 2009)。

膜翅目繭蜂科昆蟲線粒體基因組中有大量的基因間隔區(qū)和基因重疊區(qū)的現(xiàn)象并不少見。離顎細蜂科的Vanhorniaeucnemidaru存在36處基因間隔，5處基因重疊，基因間隔總長達1 777 bp，基因重疊共31 bp(Castroetal, 2006)；蓋拉頭甲腫腿蜂Cephalonomiagallicola基因間隔總長度比綠眼賽繭蜂基因間隔長，共有22處，長2 543 bp，基因重疊4處，共36 bp(魏書軍, 2009)；半閉彎尾姬蜂Diadegmasemiclausum也有13處基因間隔，共1 846 bp，14處基因重疊，共61 bp(魏書軍, 2009)。比較發(fā)現(xiàn)，基因重排發(fā)生的區(qū)域基因間隔較大，而基因重疊區(qū)基因重排發(fā)生較少。繭蜂科昆蟲常有一些較短的基因間隔區(qū)，但也存在例外，綠眼賽繭蜂有兩處較長的基因間隔，NAD1與tRNASer-2(S2)之間有236 bp的基因間隔，tRNASer-2(S2)與Cob之間有854 bp的基因間隔，推斷是由于tRNASer-2(S2)和tRNASer-1(S1)發(fā)生了位置互換產(chǎn)生的。發(fā)生重排的基因左右都有較大的基因間隔區(qū)，因此推斷基因間隔可能是昆蟲線粒體基因組產(chǎn)生重排的原因，具體原因還需要更進一步的研究。

通過不同方法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，綜合分析發(fā)現(xiàn)優(yōu)繭蜂亞科和蚜繭峰亞科的單系性得到很高的支持。窄徑繭蜂亞科和折脈繭蜂亞科互為姐妹群。寬鞘繭蜂屬Centistes、瓢蟲繭蜂屬Dinocampus和賽繭蜂屬Zele同屬于優(yōu)繭蜂亞科(Euphorinae)，這與傳統(tǒng)分類方法的結(jié)果(陳學新等, 2000)一致，但寬鞘繭蜂的兩個種并沒有聚到一起，還需要進一步研究。兩種方法都將窄徑繭蜂亞科、折脈繭蜂亞科、探繭蜂亞科、長體繭蜂亞科和毛繭蜂亞科聚于一支，說明這5種亞科之間的親緣關系較近，而與優(yōu)繭蜂亞科和蚜繭峰亞科關系較遠。

本研究對綠眼賽繭蜂線粒體基因組全序列的測定豐富了繭蜂科線粒體基因組的序列信息，為分子進化信息系統(tǒng)增添了有益的數(shù)據(jù)信息，并且為線粒體基因的結(jié)構和組成提供了基礎數(shù)據(jù)，為后續(xù)繭蜂科系統(tǒng)發(fā)生關系奠定基礎。