首都醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室 （北京 100069）

內(nèi)容提要： 目的：建立一種基于功率譜密度頻譜分析的小鼠睡眠分期方法。方法：通過慢性埋置電極，利用在體多通道電生理記錄系統(tǒng)同時(shí)采集小鼠大腦皮層腦電和頸部肌電的電生理信號(hào)，利用數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)原始電生理信號(hào)進(jìn)行降噪處理和建立功率譜密度頻譜圖，然后結(jié)合小鼠睡眠的生理特點(diǎn)和行為視頻，從功率譜密度頻譜圖上判別小鼠各睡眠期的時(shí)間間隔。結(jié)果：與人工目測(cè)分析電信號(hào)波形的睡眠分期結(jié)果相比，基于功率譜密度頻譜分析的小鼠睡眠分期結(jié)果的符合率達(dá)91%以上。分析小鼠連續(xù)3d相同時(shí)間段的睡眠時(shí)間，發(fā)現(xiàn)變化較小。結(jié)論：本研究所建立的小鼠睡眠分期方法具有可信、穩(wěn)定和簡單的優(yōu)點(diǎn)，運(yùn)用該方法可評(píng)估小鼠的睡眠質(zhì)量，為睡眠疾病診斷提供理論依據(jù)。

睡眠對(duì)人體健康至關(guān)重要。隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快及生活方式的改變，不規(guī)律的生活和心里壓力等因素常常導(dǎo)致睡眠障礙[1]。另外許多心血管疾病及精神疾病也與睡眠障礙密切相關(guān)[2]。總之，各種睡眠障礙性疾病日益成為一個(gè)突出的醫(yī)療及公共衛(wèi)生問題，也逐漸被認(rèn)識(shí)進(jìn)而引起人們的關(guān)注。睡眠障礙的識(shí)別在很大程度上依賴于對(duì)睡眠過程的準(zhǔn)確劃分，即睡眠分期。從行為學(xué)和腦電生理學(xué)的指標(biāo)來看，睡眠過程被分為快速眼動(dòng)期、非快速眼動(dòng)期，和清醒期；根據(jù)睡眠的不同深度，非快速眼動(dòng)期期又分為N1、N2和N3期[3]。睡眠分期是研究睡眠及其相關(guān)疾病的重要手段，為睡眠質(zhì)量評(píng)估提供了診斷和分析的理論性依據(jù)。不同的睡眠期對(duì)應(yīng)著不同腦狀態(tài)，于是人們正在探索設(shè)計(jì)一個(gè)準(zhǔn)確可靠的算法來區(qū)分各睡眠期。

本文旨在進(jìn)行一種基于功率譜密度頻譜分析的睡眠分期方法的研究。主要工作為利用在體多通道電生理記錄系統(tǒng)采集小鼠大腦皮層腦電（Electroencephalogram，EEG）和頸肌電（Electromyogram，EMG），利用系統(tǒng)自配的數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)EEG和EMG進(jìn)行噪音去除和功率譜密度頻譜分析，結(jié)合小鼠睡眠的電生理特征和行為建立一種簡單、便利的小鼠睡眠分期方法。

1.資料與方法

1.1 一般資料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選取清潔級(jí)的健康成年C57BL/6雄性小鼠6只，由首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0008。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用遵循首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理細(xì)則。實(shí)驗(yàn)時(shí)間：2019年8月～2020年2月。

儀器設(shè)備：在體多通道記錄系統(tǒng)（美國Plexon公司，型號(hào)OPX-D2-128），氣體麻醉機(jī)（中國眾實(shí)科技，型號(hào)ZSMV-1）。

電極：在2×2排針上焊接3根銀絲（直徑100μm）自制而成。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物手術(shù)

小鼠通過面罩輸送異氟烷氣體麻醉后（誘導(dǎo)率為2.0%，維持率為1.0%），將其頭部固定在立體定位儀上，切開顱骨表皮并清理干凈。在顱骨表面的運(yùn)動(dòng)皮層區(qū)（前囟前1.5mm，旁開±1.5mm），和小腦區(qū)各固定1個(gè)不銹鋼螺旋螺釘。

集成電極的3根銀絲，其中1根纏繞在固定在運(yùn)動(dòng)皮層區(qū)的螺釘上用來記錄EEG，1根系在小鼠頸內(nèi)肌肉上用來記錄EMG，1根纏繞在固定在小腦區(qū)的螺釘上作為地線/參考電極；最后用牙科水泥把集成電極的銀絲隔離并固定在顱骨上。術(shù)后恢復(fù)2周，即可用于實(shí)驗(yàn)記錄。

1.2.2 數(shù)據(jù)記錄

圖1. EEG和EMG在噪音去除前后的比較

圖2. 在各睡眠時(shí)相的EEG和EMG波形示例

圖3. EEG和EMG的功率譜密度頻譜圖示例

實(shí)驗(yàn)時(shí)把動(dòng)物移到記錄室，并放在外圍包有銅網(wǎng)的睡眠箱內(nèi)（30cm×44cm），睡眠箱上方固定著一個(gè)低電阻導(dǎo)電滑環(huán)，導(dǎo)電滑環(huán)一端的接口連接到固定在動(dòng)物頭部的集成電極接口上，另一端連接到在體多通道電生理記錄儀上。記錄室維持室溫（22±2）°C，自然明暗周期（12h/12h），在第2天燈亮?xí)r開始記錄。

數(shù)據(jù)采集程序?yàn)镻lexon?-OmniPlex?D，前置放大器采集的模擬信號(hào)（頻率：0～5000Hz，采樣率40kHz）實(shí)時(shí)轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)，然后用Bessel低通濾波器（60Hz）濾波，采樣率降到1kHz。同時(shí)用紅外攝像機(jī)記錄動(dòng)物的活動(dòng)，采樣率為25幀/s。采集的電生理信號(hào)和動(dòng)物行為視頻自動(dòng)同步化并保存到計(jì)算機(jī)內(nèi)。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

用數(shù)據(jù)分析軟件NeuroExplor5的軟件包：①連續(xù)信號(hào)的數(shù)字濾波器，對(duì)數(shù)字信號(hào)進(jìn)行4階的帶通（0.3～30Hz）IIR巴特沃斯、4dB波紋橢圓切比雪夫和50dB阻帶衰減濾波，目的是去除噪音、抑制基線漂移。圖1為小鼠清醒期的EEG和EMG噪音去除前后的示例圖。②波形復(fù)原程序，可在計(jì)算機(jī)屏幕上顯示各通道的波形，圖2為小鼠在3個(gè)睡眠期EEG和EMG的波形示例圖。③頻譜程序，EEG和EMG信號(hào)經(jīng)過短時(shí)傅里葉變換，其中時(shí)間單元10s（時(shí)間分辨率10s），頻數(shù)2048（頻率分辨率0.25Hz），功率譜密度歸一化，多維度（帶寬3，維度5），得到信號(hào)的功率譜密度頻譜圖（圖3）。結(jié)合動(dòng)物自由活動(dòng)視頻、電信號(hào)波形圖以及小鼠睡眠生理特征，可從功率譜密度頻譜圖上人為識(shí)別出小鼠各睡眠期的時(shí)間間隔。

根據(jù)記錄的小鼠腦電波特征、肌電波特征和拍攝的小鼠活動(dòng)視頻，在功率譜密度頻譜圖則表現(xiàn)為，腦電波的功率譜密度值在小鼠清醒期集中在0.5～9Hz；在非快速眼動(dòng)期集中在0.5～15Hz，其值比清醒期和快速眼動(dòng)期高；在快速眼動(dòng)期集中在5～10Hz，0.5～5Hz和10～15Hz的幾乎沒有。而肌電圖功率譜密度值在5～15Hz，清醒期比非快速眼動(dòng)期期和快速眼動(dòng)期要高很多。根據(jù)以上特點(diǎn)，從功率譜密度頻譜圖上可人為直接識(shí)別出3個(gè)睡眠期的時(shí)間間隔（圖3）。

表1. 功率譜密度頻譜圖的睡眠分期結(jié)果的符合率(±s,%)

表1. 功率譜密度頻譜圖的睡眠分期結(jié)果的符合率(±s,%)

相似度 清醒期 非快速眼動(dòng)期 快速眼動(dòng)期95.83±3.67 91.67±6.43 93.21±5.16

表2. 在不同日期內(nèi)正常小鼠各睡眠期的時(shí)間占比的比較(±s,%)

表2. 在不同日期內(nèi)正常小鼠各睡眠期的時(shí)間占比的比較(±s,%)

images/BZ_40_1287_3021_2303_3074.png清醒期(%) 非快速眼動(dòng)期(%) 快速眼動(dòng)期(%)第1天 28.89±4.76 63.52±10.15 7.59±0.89第3天 34.35±4.25 57.22±7.86 8.43±1.96

2.結(jié)果

2.1 睡眠分期的準(zhǔn)確性檢驗(yàn)

選實(shí)驗(yàn)用小鼠（3只），每只隨機(jī)選取4h睡眠（10:00～12:00，22:00～24:00），并從中隨機(jī)抽取4段，每段5min，共計(jì)1200s。將睡眠期的基于EEG和EMG波形的人工目測(cè)分析與基于功率譜密度頻譜圖人工分析得到結(jié)果進(jìn)行比較，各睡眠期的符合率見表1（符合率=功率譜密度頻譜圖分析秒數(shù)/人工分析秒數(shù)×100%）。

2.2 功率譜密度頻譜圖在睡眠分期分析中的穩(wěn)定性檢驗(yàn)

小鼠各睡眠期在每日的相同時(shí)間相對(duì)穩(wěn)定，功率譜密度頻譜圖分析睡眠分期結(jié)果應(yīng)該較好地反映出這種穩(wěn)定性，才能保證自身對(duì)照有意義。故分析了小鼠第1天至第3天10:00～16:00的3個(gè)睡眠期的時(shí)間分布情況，結(jié)果見表2。從表上可以看出，小鼠不同日子同一時(shí)間段內(nèi)各睡眠期的時(shí)間比例相差不大（標(biāo)準(zhǔn)差均較小，或P＜0.05），故可認(rèn)為此睡眠分期的分析方法進(jìn)行小鼠睡眠研究是比較穩(wěn)定的。

3.討論

利用本實(shí)驗(yàn)室的在體多通道電生理記錄系統(tǒng)和系統(tǒng)配套的數(shù)據(jù)分析軟件，記錄和分析小鼠睡眠過程的腦電和頸肌電的電生理信號(hào)，建立的基于功率譜密度頻譜分析的小鼠睡眠分期方法，具有可信、穩(wěn)定和簡單的優(yōu)點(diǎn)，運(yùn)用該方法可評(píng)估小鼠的睡眠質(zhì)量，為睡眠疾病診斷提供理論依據(jù)。

研究睡眠分期，對(duì)疾病的檢測(cè)、預(yù)防和治療有重要的臨床意義。臨床上通常用多導(dǎo)睡眠儀記錄患者整晚的電生理信號(hào)如腦電、肌電、眼電、和心電等，通過對(duì)電信號(hào)的判別來進(jìn)行睡眠分期?；陔娚硇盘?hào)的睡眠分期，早期的臨床睡眠分析主要是人工目測(cè)分析，這種方法效率低且存在人為主觀性誤判的缺點(diǎn)[5]。

隨著數(shù)字信號(hào)處理技術(shù)的發(fā)展，人們開始探索以計(jì)算機(jī)輔助的自動(dòng)睡眠分期方法，目前已取得一定成果的方法主要可分為兩類。一類是通過提取電生理信號(hào)的線性動(dòng)力學(xué)特征參數(shù)（如幅值、均值、峭度、功率等）和閾值比較的方法來進(jìn)行自動(dòng)睡眠分期，如以腦電圖為主的時(shí)域分析和頻域分析，這些方法不能同時(shí)兼顧時(shí)間和頻率的分辨率，且還需隨時(shí)調(diào)整閾值[5,6]。另一類是通過提取電生理信號(hào)的非線性動(dòng)力學(xué)特征（離散度、相關(guān)維數(shù)、復(fù)雜度等）和分類的方法來建立自動(dòng)睡眠分期模型，如人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析、聚類分析、線性判斷分析等[7,8]。這些方法往往需要大量的數(shù)據(jù)才能建立可靠的模型，且更適用于一些大型數(shù)據(jù)集，以解決遺傳學(xué)、流行病學(xué)或精密醫(yī)學(xué)方面的問題[9]?？傊?，目前還沒有公認(rèn)的可用于人類或動(dòng)物的自動(dòng)睡眠分期的金標(biāo)準(zhǔn)。

本文建立的基于功率譜密度頻譜分析小鼠睡眠的分期方法是利用系統(tǒng)自配的數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)EEG和EMG進(jìn)行短時(shí)傅里葉變換后創(chuàng)建功率譜密度頻譜圖。短時(shí)傅里葉變換的基本思想是：把信號(hào)劃分成許多小的時(shí)間間隔，用傅里葉變換分析每一個(gè)時(shí)間間隔內(nèi)的頻率[10]。這樣即可彌補(bǔ)時(shí)域分析時(shí)忽略頻率分辨率、而頻域分析時(shí)又忽略時(shí)間分辨率的缺點(diǎn)。由于是對(duì)每一只動(dòng)物建立自己的功率譜密度頻譜圖，這樣就避免了因動(dòng)物個(gè)體差異導(dǎo)致睡眠特征變化而帶來的睡眠分期結(jié)果的誤差。