邱東茹

(中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所, 武漢 430072)

隨著我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展和城市化進(jìn)程加速, 大量工業(yè)生產(chǎn)廢水、城鎮(zhèn)生活污水和農(nóng)業(yè)面源污染帶來(lái)的氮和磷等營(yíng)養(yǎng)元素進(jìn)入河流湖泊和近海水體, 水體富營(yíng)養(yǎng)化進(jìn)程加速。藻類水華和赤潮頻繁發(fā)生, 嚴(yán)重影響多個(gè)大中城市飲用水供水安全及水產(chǎn)養(yǎng)殖等其他水體功能[1], 污染型缺水問(wèn)題愈演愈烈。近幾年有毒微囊藻(Microcystis)水華在江蘇太湖、安徽巢湖和昆明滇池的頻繁大規(guī)模發(fā)生引發(fā)全社會(huì)的關(guān)注和政府的高度重視。微囊藻毒素具有肝毒性和致癌性高、穩(wěn)定性高、可生物積累和生物放大的特性, 對(duì)公眾健康帶來(lái)嚴(yán)重的危害和潛在風(fēng)險(xiǎn)。近年來(lái)我國(guó)學(xué)者對(duì)微囊藻水華暴發(fā)機(jī)理進(jìn)行深入研究, 并試驗(yàn)了一系列控制的物理、化學(xué)和生物措施, 取得了可喜的進(jìn)展, 但形勢(shì)依然嚴(yán)峻。另一方面, 某些富營(yíng)養(yǎng)化湖泊如武漢東湖藍(lán)藻水華卻突然消失并很少?gòu)?fù)發(fā)。20世紀(jì)80年代中期武漢東湖持續(xù)10余年的微囊藻水華突然消失, 此后雖然水體污染有增無(wú)減, 主體湖區(qū)卻沒(méi)有發(fā)生大規(guī)模藍(lán)藻水華。我所淡水生態(tài)學(xué)家劉建康院士認(rèn)為可能歸因于東湖大水面放養(yǎng)鰱、鳙等濾食性魚(yú)類。此后劉建康院士和謝平研究員用生態(tài)圍隔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)湖沼學(xué)研究, 證實(shí)濾食性魚(yú)類的濾食對(duì)微囊藻水華的控制作用[2]。藍(lán)藻水華生物防治的可能途徑包括生物操縱(Biomanipulation, 如鰱、鳙魚(yú)濾食藍(lán)藻)、利用溶藻細(xì)菌(Algicidal bacteria, 或稱algae-lysing bacteria)和藍(lán)藻噬藻體(Cyanophage)來(lái)控藻等[3,4]。我們?cè)噲D基于在活性污泥菌膠團(tuán)形成菌中的研究結(jié)果, 從藍(lán)藻群體形成及其可能的分子機(jī)制出發(fā), 探討微囊藻水華形成的分子機(jī)理和防治對(duì)策。

1 胞外多聚物與藍(lán)藻群體形成

能形成水華的微囊藻和魚(yú)腥藻等常見(jiàn)藍(lán)藻是原核生物, 又稱之為藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacterium), 其細(xì)胞結(jié)構(gòu)屬于革蘭氏陰性菌型, 即具有細(xì)胞外膜(Outer membrane), 由少數(shù)肽聚糖層組成的細(xì)胞壁位于細(xì)胞外膜與細(xì)胞質(zhì)膜(Cytoplasmic membrane,或稱內(nèi)膜Inner membrane)之間的周質(zhì)空間內(nèi), 受到保護(hù), 不易受到溶菌酶的攻擊。與許多革蘭氏陰性細(xì)菌一樣, 藍(lán)細(xì)菌(藍(lán)藻)也大量合成胞外多聚物(Extracellular polymeric substance, 縮寫(xiě)為EPS),主要是胞外多糖, 形成包裹在細(xì)胞外的莢膜(Capsule)、膠鞘(Sheath)和黏液層(Slime layer), 其中黏液層容易脫落; 莢膜和膠鞘則與細(xì)胞緊密相連。許多微囊藻細(xì)胞的胞外膠狀物質(zhì)共同形成公共莢膜將多個(gè)細(xì)胞聚集成團(tuán), 即所謂的藍(lán)藻群體(Colonial cells, 或稱聚集體, aggregates), 可以有效抵抗原生動(dòng)物和其他浮游動(dòng)物的攝食[5,6], 也可提高對(duì)環(huán)境脅迫和噬藻體侵染的抗性。攝食壓力、細(xì)菌及某些環(huán)境理化因子則能夠促進(jìn)微囊藻群體的形成和體積增大[7—9]。濾食性的鰱和鳙也因?yàn)樗{(lán)藻群體外膠質(zhì)層難以消化藻細(xì)胞?；跒V食性魚(yú)類和枝角類濾食作用的生物操縱手段對(duì)控制微囊藻水華的效果受到極大的限制[2], 水華藍(lán)藻資源的開(kāi)發(fā)利用也非常困難。更為重要的是, 在微囊藻中, 群體細(xì)胞加之細(xì)胞中的偽空胞使得細(xì)胞成團(tuán)漂浮、積聚在水面上, 即發(fā)生微囊藻水華。群體的形成、增大和形態(tài)的持續(xù)維持是微囊藻獲得種群優(yōu)勢(shì)進(jìn)而形成水華并維持優(yōu)勢(shì)的前提之一[10]。如果能夠控制藍(lán)藻胞外多聚物的大量合成和藍(lán)藻群體的形成, 就有可能有效控制微囊藻水華的發(fā)生和發(fā)展。

藍(lán)藻胞外多糖的合成是藍(lán)藻群體形成的關(guān)鍵因素, 藍(lán)藻群體的形成和維持是藍(lán)藻水華發(fā)生的前提。藍(lán)藻多糖成分和結(jié)構(gòu)分析以及生物合成途徑的了解還不夠深入, 至目前為止我們對(duì)細(xì)菌胞外多糖生物合成了解主要來(lái)源大腸桿菌等模式菌、少數(shù)工業(yè)微生物和假單胞菌等病菌的研究工作。莢膜胞外多糖(K-抗原)的生物合成與脂多糖(LPS)的O-抗原(由多個(gè)寡糖重復(fù)單位組成多糖鏈, 是細(xì)菌菌體抗原的抗原決定簇)的合成有相似之處。糖基轉(zhuǎn)移酶的催化下寡糖單位在細(xì)胞質(zhì)中合成, 翻轉(zhuǎn)酶的作用翻轉(zhuǎn)穿過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜(內(nèi)膜)進(jìn)入周質(zhì)空間, 在聚合酶作用下形成多糖鏈穿過(guò)細(xì)胞外膜分泌到胞外。對(duì)藍(lán)藻胞外多糖的單糖組成、糖鏈和結(jié)構(gòu)所知甚少。水華微囊藻(Microcystis flos-aquae)C3-40株的黏液層多糖的單糖組成為乳糖(重量占比1.5%)、葡萄糖(2.0%)、木糖(3.0%)、甘露糖(5.0%)、鼠李糖(5.5%)和半乳糖醛酸(83%)[11]。聚合形成微囊藻胞外多糖的寡糖單位中包含鼠李糖、巖藻糖和木糖等單糖[12]。藍(lán)藻所合成和分泌的胞外多糖一部分溶于水中, 即所謂的溶解性多糖;另一部分結(jié)合在藻細(xì)胞表面, 即結(jié)合性多糖, 對(duì)于藍(lán)藻群體形成是必需成分[6,9, 13,14]。多糖中醛酸含量越高, 其黏附性越大[15]。通常認(rèn)為二價(jià)鈣離子通過(guò)鹽橋作用促進(jìn)胞外多糖形成黏性膠質(zhì), 進(jìn)而包裹細(xì)胞形成群體[16,17]。組成胞外多聚物的其他生物大分子, 特別是胞外蛋白質(zhì), 在藍(lán)藻膠質(zhì)層(Mucilage)和藍(lán)藻群體形成中也可能具有重要作用, 形成的機(jī)制更為復(fù)雜。

2 PEP-CTERM蛋白質(zhì)的翻譯后加工和分選

除了胞外多糖, 藍(lán)藻群體胞外膠質(zhì)層中還存在蛋白質(zhì)和其他生物大分子。例如, 江和龍實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)藍(lán)藻胞外多聚物中水溶性、與細(xì)胞松散相連的成分多為蛋白質(zhì), 胞外多糖則與藻細(xì)胞緊密相連[18]。20世紀(jì)90年代末發(fā)現(xiàn)在革蘭氏陽(yáng)性菌(無(wú)細(xì)胞外膜)中, 蛋白分選酶(Sortase)可將擁有C端LPXTG基序的表面蛋白和菌毛通過(guò)共價(jià)鍵錨定到細(xì)胞壁的肽聚糖分子上[19]。經(jīng)過(guò)對(duì)大量細(xì)菌基因組的生物信息學(xué)分析在革蘭氏陰性細(xì)菌(包括藍(lán)藻)中也鑒別出類似的分選酶同源基因, 這個(gè)分選酶基因(以前稱之為epsH)和推測(cè)的表面蛋白基因通常與胞外多糖合成基因簇相互關(guān)聯(lián), 所鑒別的表面蛋白中通常具有C端的PEP基序, 而且富含可與糖基相連的絲氨酸和蘇氨酸(O-linked)和天冬酰胺(N-linked)殘基,因此將這種蛋白分選系統(tǒng)稱為PEP-CTERM/Exosortase(Exo意指胞外多糖)系統(tǒng)[20]。Exosortase (EpsH)為八次穿膜的膜蛋白, 可能與革蘭氏陽(yáng)性的分選酶相似具有轉(zhuǎn)肽酶功能。PEP-CTERM基因的表達(dá)可能受到鄰近的RpoN(或稱Sigma 54)依賴的二組分系統(tǒng)PrsK/PrsR的調(diào)節(jié)。此外, 研究發(fā)現(xiàn)某些環(huán)境細(xì)菌中長(zhǎng)鏈N-?；被岷铣擅??；D(zhuǎn)移酶)基因也多與PEP-CTERM/Exosortase分選系統(tǒng)基因連鎖, 因此長(zhǎng)鏈N-酰基氨基酸有可能是組氨酸激酶PrsK的活化信號(hào), 這類?；D(zhuǎn)移酶被稱為ExoAT[21]。

我們?cè)诨钚晕勰辔⑸锵矘?shù)脂動(dòng)膠菌(Zoogloea resiniphila)MMB株中成功構(gòu)建轉(zhuǎn)座子插入突變株庫(kù), 篩選多個(gè)與菌膠團(tuán)形成相關(guān)的突變株, 鑒定出一些與胞外多糖生物合成與組裝及菌膠團(tuán)形成相關(guān)基因, 包括一個(gè)約40千堿基(KB)的大型基因簇, 并發(fā)現(xiàn)該基因簇中糖基轉(zhuǎn)移酶基因組成上存在種間和種內(nèi)差異。還發(fā)現(xiàn)其中兩個(gè)編碼天冬酰胺合成酶的旁系同源基因在菌膠團(tuán)形成過(guò)程中具有重要功能, 這2個(gè)基因突變或敲除后能夠阻斷或推遲菌膠團(tuán)的形成[22]。我們還鑒定出另外一個(gè)由7個(gè)基因組成、參與菌膠團(tuán)形成的基因簇, 其中3個(gè)基因(糖基轉(zhuǎn)移酶基因epsB2、脂蛋白基因prsT和參與合成甘露糖的尿苷二磷酸-N-乙酰-D-氨基葡萄糖胺脫氫酶基因ugd)插入失活或者敲除后基本檢測(cè)不到胞外多糖, 說(shuō)明其參與多糖中的單糖成分合成或者胞外多糖的生物合成和分泌。敲除編碼二組分系統(tǒng)(Two-component system)的感受器組氨酸激酶(Sensor histidine kinase)基因prsK或者響應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白(Response regulator)基因prsR后, 胞外多糖的合成依然存在, 所合成的大量胞外多糖被分泌和溶解到培養(yǎng)基中, 不能包裹細(xì)菌細(xì)胞群形成菌膠團(tuán)。我們進(jìn)一步的研究表明一些PEP-CTERM蛋白質(zhì)基因參與喜樹(shù)脂動(dòng)膠菌的菌膠團(tuán)形成, 其中2個(gè)基因pepA和pepE轉(zhuǎn)錄水平高, 并且受到RpoN、PrsK和PrsR的調(diào)節(jié)[23]。在prsK或者prsR基因敲除突變株中過(guò)量表達(dá)pepA基因可以恢復(fù)菌膠團(tuán)形成表型, 胞外多糖也不再溶解到培養(yǎng)基中而是包裹到細(xì)胞團(tuán)上。PepA蛋白質(zhì)的氨基(氮)端具有典型的分泌信號(hào)肽, 首先通過(guò)II型分泌系統(tǒng)到周質(zhì)空間, 其羧基(碳)端肽段也被切割下來(lái)形成成熟肽, 切割位點(diǎn)位于PEP基序下游, 其進(jìn)一步分選和修飾則有待進(jìn)一步研究[23,24]。

此前, 我們?cè)诹硪恢昃z團(tuán)(絮團(tuán))形成菌解叔丁醇水居菌(Aquincolatertiaricarbonis)RN12株中,大量篩選絮狀物形成缺失的突變株, 鑒定到一個(gè)類似的胞外多糖合成基因簇以及一些其他基因,rpoN1 sigma因子(σ54)基因, 利用遺傳互補(bǔ)分析確定RpoN1是菌膠團(tuán)形成的主要調(diào)控基因之一。有趣的是, 該基因插入突變株中所合成的大量胞外多糖也被分泌和溶解到培養(yǎng)基中, 不能包裹細(xì)菌細(xì)胞群形成菌膠團(tuán)。分析發(fā)現(xiàn)RpoN1并不影響胞外多糖合成基因的轉(zhuǎn)錄, 說(shuō)明RpoN1所調(diào)控的基因在表達(dá)后也可能通過(guò)調(diào)節(jié)PEP-CTERM蛋白質(zhì)的表達(dá)和分選機(jī)制使胞外多糖鏈緊密地結(jié)合在細(xì)菌群體的表面以形成菌膠團(tuán), 而不是直接調(diào)控胞外多糖的合成。RN12菌株有rpoN1、rpoN2、rpoN3和rpoN4等4個(gè)旁系同源基因, 但只有RpoN1能調(diào)控菌膠團(tuán)的形成, 并且RpoN1調(diào)節(jié)該菌株的群集運(yùn)動(dòng)(Swarming motility)和生物被膜形成(Biofilm formation)[25]。由于擁有4個(gè)rpoN基因,rpoN1的敲除并沒(méi)有造成象動(dòng)膠菌rpoN敲除突變株那樣生長(zhǎng)緩慢, 也幾乎檢測(cè)不到胞外多糖[23]。無(wú)獨(dú)有偶, 該菌基因組擁有數(shù)十個(gè)編碼PEP-CTERM蛋白質(zhì)的基因。這些結(jié)果說(shuō)明動(dòng)膠菌和水居菌等Beta變形菌形成菌膠團(tuán)(或稱絮狀物)的機(jī)理非常相似。我們進(jìn)一步揭示這些基因和基因簇在其他的菌膠團(tuán)形成菌包括解殼聚糖松江菌(Mitsuaria chitosanitabida)和Pseudoduganella eburnean中也發(fā)揮同樣的功能[26,27]。胞外多糖和PEP-CTERM結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)共同介導(dǎo)的菌膠團(tuán)/絮團(tuán)形成是多種微生物所共同擁有的一個(gè)普遍現(xiàn)象,藍(lán)藻極可能也是如此。

除原綠球藻(Prochlorococcus)外, 微囊藻等大多數(shù)藍(lán)藻中均存在類似的PEP/Exosortase分選酶系統(tǒng)[28]。藍(lán)藻中的分選酶分為2個(gè)亞族, 命名為藍(lán)藻外分選酶A(Cyanoexosortase A, 簡(jiǎn)稱CrtA)和B(cyanoexosortase B, 簡(jiǎn)稱CrtB)[28]。微囊藻中擁有CrtB,在我所已完成基因組測(cè)序的太湖和滇池微囊藻藻株中也發(fā)現(xiàn)crtB基因[29]。我們從產(chǎn)微囊藻毒素的銅綠微囊藻(Microcytis aeruginosa)NIES-843株基因組中可初步鑒定出33個(gè)編碼PEP-CTERM結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的基因[30]。而不產(chǎn)毒的Microcytissp. MC19株基因組中也編碼45個(gè)PEP-CTERM結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)[31]。從太湖梅梁灣分離的片狀微囊藻(Microcystis panniformis)FACHB1757株基因組中也編碼32個(gè)PEPCTERM蛋白質(zhì)[32]。魚(yú)腥藻(Anabaena variabilisATCC 29413)和念珠藻(Nostocsp. PCC 7120)中分別擁有36和42個(gè)PEP-CTERM蛋白質(zhì)編碼基因。Daniel H. Haft還從一些藍(lán)藻(包括Cyanothece,Nostoc,Trichodesmium,Lyngbya,Arthospira)中鑒定出一個(gè)亞類, 稱之為cyano_PEP(TIGR04155), 在CTERM的跨膜區(qū)有典型的GXXXXGXG(X指任意氨基酸殘基)基序。這些PEP-CTERM家族基因所編碼的蛋白質(zhì)可能分泌和錨定到細(xì)胞表面, 其功能完全未知。這些PEP-CTERM基因大概占許多藍(lán)藻基因組基因總數(shù)的1/20強(qiáng), 絕非偶然現(xiàn)象。我們有理由推測(cè)這些PEP-CTERM蛋白質(zhì)可能通過(guò)特殊的分選系統(tǒng)分泌到細(xì)胞表面, 與胞外多糖通過(guò)糖基化作用形成結(jié)構(gòu)更復(fù)雜的胞外多聚物, 介導(dǎo)細(xì)胞群體的形成和水華發(fā)生。

3 群體感應(yīng)、微囊藻毒素與藍(lán)藻群體形成

藍(lán)藻群體和微生物菌膠團(tuán)(絮團(tuán))是一種微生物細(xì)胞的群體行為, 可以被認(rèn)為是一種特殊的生物被膜, 只不過(guò)不需要附著在物理和生物表面而已。群體感應(yīng)(Quorum sensing, 縮寫(xiě)為QS)是微生物細(xì)胞間信息交流的一種方式, 可根據(jù)種群密度閾值(Quorum)來(lái)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。細(xì)菌可感知自身合成的自誘導(dǎo)分子(Autoinducer, 簡(jiǎn)稱AI)的濃度(反映細(xì)胞密度)變化, 當(dāng)信號(hào)分子濃度達(dá)到臨界閾值后,QS系統(tǒng)可調(diào)控特定基因表達(dá)過(guò)程。革蘭氏陰性菌主要利用不同的長(zhǎng)鏈N-?；呓z氨酸內(nèi)酯(N-acylhomoserine lactones, 簡(jiǎn)稱AHLs)作為群體感應(yīng)系統(tǒng)的AI分子(AI-1)。QS可調(diào)控多種生理過(guò)程如生物發(fā)光、質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移、感受態(tài)與孢子形成、抗生素合成、胞外酶和毒素產(chǎn)生、生物被膜形成和細(xì)胞分化等。人工干擾細(xì)菌QS有助于控制病菌的感染, 同理可能控制微囊藻水華的形成和微囊藻毒素的產(chǎn)生。藍(lán)藻中群體感應(yīng)現(xiàn)象研究較少。在附著生長(zhǎng)的黏桿藻(Gloeothece)無(wú)菌株P(guān)CC6909中存在C8 N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯[33], C8-AHL的積累可以調(diào)節(jié)糖代謝、氨基酸代謝和生物被膜形成。在固氮絲狀藻魚(yú)腥藻PCC 7120中存在一個(gè)具有AHL分解功能的酯酶基因(aiiC), 該酶可以分解一系列的AHL分子, 可能淬滅QS信號(hào)(Quorum quenching, 群體感應(yīng)淬滅)[34]。多種AHL分子可以抑制魚(yú)腥藻的固氮反應(yīng)[35]。微囊藻中是否存在QS尚無(wú)定論, 南京大學(xué)學(xué)者在微囊藻無(wú)菌株P(guān)CC-7820代謝產(chǎn)物中檢測(cè)到AHL信號(hào)分子[36]。群體感應(yīng)是否參與藍(lán)藻群體形成也無(wú)定論。

我所研究人員發(fā)現(xiàn)產(chǎn)毒微囊藻細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中釋放到胞外的微囊藻毒素(MCs)可能具有信號(hào)物質(zhì)的功能, 可激活產(chǎn)毒及非產(chǎn)毒微囊藻細(xì)胞中某些與多糖合成相關(guān)基因的表達(dá)和誘導(dǎo)胞外多糖產(chǎn)物的釋放, 進(jìn)而促進(jìn)微囊藻群體的聚集。如果及時(shí)、持續(xù)地清除釋放到胞外的微囊藻毒素分子, 微囊藻群體的尺寸則會(huì)顯著減小。微囊藻毒素在微囊藻群體形態(tài)的維持中可能具有重要作用[10]。有趣的是, 藍(lán)藻中并無(wú)sigma54家族的RpoN sigma因子(表 1)。微囊藻中作為信號(hào)分子的微囊藻毒素所結(jié)合的受體分子應(yīng)該與其他擁有RpoN的革蘭氏陰性細(xì)菌有所不同, 需要進(jìn)一步研究加以揭示。

表1 水華藍(lán)藻銅綠微囊藻和菌膠團(tuán)形成菌喜樹(shù)脂動(dòng)膠菌胞外多聚生物合成與藍(lán)藻群體/細(xì)菌菌膠團(tuán)形成相關(guān)基因比較Tab. 1 Comparison of between bloom-forming cyanobacterium Microcystis aeruginosa NIES-842 and floc-forming proteobacterium Zoogloea resiniphila MMB strain

4 展望

微囊藻的分子遺傳操作非常困難, 迄今為止只有一項(xiàng)報(bào)道在微囊藻成功進(jìn)行基因失活的研究[37]。這極大地限制了微囊藻遺傳分析和基因功能的鑒定, 某些遺傳分析不得不在集胞藻(Synechocystis)中進(jìn)行[38]。盡管如此, 面對(duì)國(guó)家需求, 為闡明微囊藻水華發(fā)生機(jī)制, 我國(guó)學(xué)者已作出極大的努力, 在微囊藻基因組學(xué)、微囊藻越冬機(jī)制和微囊藻群體形成和維持機(jī)理方面取得了顯著進(jìn)展。希望在不久的將來(lái), 建立微囊藻遺傳操作方法和系統(tǒng), 特別是CRISPR-Cas9基因技術(shù)在藍(lán)藻中的應(yīng)用, 深入開(kāi)展微囊藻胞外多聚物生物合成、表面蛋白分選、群體感應(yīng)和水華發(fā)生機(jī)制相關(guān)分子遺傳和功能基因組學(xué)研究, 揭示藍(lán)藻群體形成的分子機(jī)制, 探索控制微囊藻水華發(fā)生的新型途徑。