王 寧,楊澤林,吳劍榮,詹曉北

(江南大學 糖化學與生物技術教育部重點實驗室,江蘇 無錫 214122)

真核生物的蛋白質(zhì)糖基化是一種普遍的翻譯后修飾，在生命活動和結(jié)構功能關系中發(fā)揮重要作用。糖基化不僅影響蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)的折疊、運輸、定位等行為，而且通過糖-蛋白間特異性識別機制調(diào)節(jié)生物體內(nèi)受體激活、信號轉(zhuǎn)導等許多重要生物學進程[1]。唾液酸是一類九碳酮糖酸的總稱，為神經(jīng)氨酸衍生物，其中5-N-乙酰-神經(jīng)氨酸(NeuAc)是自然界存在最廣泛的唾液酸。在脊椎動物中，唾液酸存在于細胞表面復合糖鏈末端，主要以糖蛋白或糖脂形式存在[2]。由于其獨特的位置特點和結(jié)構特性，唾液酸參與調(diào)節(jié)大量生理及病理進程，例如在一些癌癥細胞中，唾液酸往往過量表達[3]。在受精過程中，唾液酸也在卵細胞與精子結(jié)合過程中扮演著重要作用[4]。此外，在一些特殊細胞表面還有聚唾液酸，主要存在于新生嬰兒、精子和部分腫瘤細胞上[5]。

唾液酸糖蛋白(SGP)是指一類富含唾液酸的糖蛋白，大部分含有分支型、復雜型的末端唾液酸化的寡糖鏈。SGP具有良好的抗結(jié)合作用，主要表現(xiàn)為抑制細菌及病毒與宿主細胞之間結(jié)合[6]，包括抑制沙門氏菌等病原菌，并能與A型流感病毒血凝素相結(jié)合。另外，SGP的唾液酸寡糖還參與機體內(nèi)的生物合成代謝反應。因此，SGP及其衍生物有望作為良好、安全的預防類藥物或功能食品，用于防止細菌或病毒感染。

富含唾液酸的糖蛋白在腦、神經(jīng)組織、血液、頜下腺、黏蛋白、初乳、精子以及部分癌細胞中存在較多，但是其含量低，純化制備困難。比較典型的富含唾液酸糖蛋白的來源是燕窩，其唾液酸含量最高，根據(jù)產(chǎn)地不同，唾液酸含量為8%～15%(質(zhì)量分數(shù))。燕窩糖蛋白上70%的糖鏈以三天線或四天線的寡糖鏈形式存在，末端唾液酸以α2-3糖苷鍵連接在半乳糖基上[7]。另外也有研究從雞蛋中提取SGP，發(fā)現(xiàn)其唾液酸量為24～29 mg/kg，主連接鍵主要是α2-6糖苷鍵[8-9]。此外，周曉春[10]發(fā)現(xiàn)鯽魚籽中唾液酸含量為2.4%，從鯽魚籽中提取唾液酸糖蛋白的唾液酸含量高可達5.9%，該唾液酸糖蛋白可以顯著促進MC3T3-E1細胞增殖、分化和礦化的作用，可用于開發(fā)抗骨質(zhì)疏松食品等[11]。陳璇[12]從豬小腸黏膜肝素加工廢棄物中提取高含唾液酸糖蛋白，結(jié)構分析表明糖蛋白為O-糖鏈修飾、高唾液酸化、GlcNAc C-6位硫酸根取代、抗原表位主要為Blood group H型的黏蛋白。

鯽魚在我國淡水魚消費量排名中名列第五，但是其魚籽常常丟棄，未能資源化利用。本研究中，筆者從唾液酸含量較高的鯽魚籽中提取和純化唾液酸糖蛋白，并對其N-糖鏈結(jié)構和生物活性進行研究，以期對其進一步資源化利用提供指導。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

SDS-PAGE相關試劑及考馬斯亮藍R-250，Bio-Rad公司；Q Sepharose Fast Flow(QFF)色譜柱，GE Healthcare公司；其他常規(guī)化學試劑，國藥集團化學試劑有限公司。鯽魚籽從市場上新鮮購買，剔除系帶和魚泡后冷凍保存待用。

1.2 鯽魚籽中粗糖蛋白的提取和純化

將成熟的鯽魚籽(300 g)加入900 mL(液料比為3∶ 1)的0.5 mol/L NaCl溶液，用高速分散機均質(zhì)10 min，并在3 000g離心5 min后除去殘余物。將上清液與等體積的90%苯酚混合，并將混合物在4 ℃下攪拌過夜。在3 000g離心10 min后，將水相傾析到截留分子量為3 000的透析袋中，用自來水透析3 d，然后用蒸餾水透析1 d以除去苯酚，冷凍干燥后獲得粗糖蛋白。

粗糖蛋白進一步用QFF離子交換層析柱(用0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液預平衡，pH 8.2)進行純化，用含NaCl(0～1 mol/L)的0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液進行線性梯度洗脫。洗脫曲線由蛋白質(zhì)在280 nm處檢測吸光度，唾液酸可進一步采用間苯二酚方法測定[13]，己糖采用苯酚-硫酸方法測定[14]。收集含有唾液酸收集液，凍干并命名為CcSGP。

1.3 SDS-PAGE分析及PAS染色

糖蛋白樣品用含有100 g/Lβ-巰基乙醇的上樣緩沖液在100 ℃水浴下變性5 min，并通過SDS-PAGE用100 g/L溶解凝膠和50 g/L堆積凝膠在80 V下分級分離30 min，然后在100 V下持續(xù)1 h。每種樣品加載的蛋白質(zhì)量約為50 μg。將凝膠用CBB R-250進行染色，并經(jīng)常更換固定溶液(體積分數(shù)30%乙醇，體積分數(shù)10%乙酸)，直到過量的污漬消失為止。電泳后用高碘酸-希夫(PAS)進行初次染色。電泳后，將凝膠浸入體積分數(shù)12.5%三氯乙酸中20 min，然后在黑暗中浸泡10 g/L高碘酸25 min。然后將其浸入希夫品紅-亞硫酸鹽試劑中在黑暗中處理15 min，再用5 g/L的硫酸二甲酯中洗滌2次，然后在水中洗滌直至凝膠脫色并拍照分析。

1.4 鯽魚籽糖蛋白N-糖鏈的釋放和質(zhì)譜分析

在10 μL反應體系中，加入1～20 μg純化的糖蛋白，加入1 μL 10×糖蛋白變性緩沖液(含0.5%SDS，400 mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)和去離子水(如果需要))。然后在100 ℃煮沸處10 min，使糖蛋白變性。再加入2 μL 10×GlycoBuffer 2緩沖液，2 μL 10%(質(zhì)量分數(shù))乙基苯基聚乙二醇(NP-40)，1～2 μL的肽N-糖苷酶F(PNGase F)，加水至20 μL，在37 ℃溫育1 h進行N-糖鏈釋放。

進一步采用C18小柱吸附樣品中蛋白質(zhì)，使糖鏈與蛋白質(zhì)得到分離。首先用10 mL乙腈活化C18柱，用20 mL純水平衡柱子，將準備好的含糖鏈樣品加樣于C18柱，用10 mL水平衡C18柱，得到含糖鏈餾分，凍干備用。再用SPE-石墨化碳(1 000 mg，Acchrom公司)小柱進行糖鏈吸附：先用10 mL乙腈活化石墨化碳填料，再用20 mL水平衡柱子，將糖鏈餾分配制適合濃度進行上樣，采用不同濃度梯度的乙腈水溶液(5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%和50%)進行洗脫，并對洗脫餾分進行收集檢驗。

將上述收集的含糖鏈餾分采用基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF MS)進行分析(Ultrafle Xtreme型,Bruker Daltonics公司)。N-糖鏈樣品水溶液質(zhì)量濃度約為0.1 mg/mL，吸取樣液1 μL加到樣品板上，室溫下晾干，等樣品板上的液體全部揮發(fā)后，加入1 μL 2,5-二羥基苯甲酸(DHB)基質(zhì),室溫下晾干，樣品與基質(zhì)混合結(jié)晶后進行分析。

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1.5 DPPH自由基清除

取1.0 mL不同質(zhì)量濃度(2～10 mg/mL)糖蛋白樣品溶液和3.0 mL DPPH溶液(0.05 mmol/L甲醇溶液)。搖勻混合物，放置在黑暗的房間中30 min，然后在517 nm處測量吸光度。以抗壞血酸作為對照，DPPH自由基的清除作用按式(1)計算。

(1)

式中：A0為不含樣品的·DPPH的吸光度，A1是·DPPH和樣品的吸光度，A2為不含·DPPH的樣品吸光度。

1.6 阻止磷酸鈣沉淀實驗

采用pH-Stat法檢測唾液酸糖蛋白對磷酸鈣沉淀的抑制效果。配制唾液酸糖蛋白溶液，使質(zhì)量濃度為0、0.1和0.2 g/L。配制酪蛋白磷酸肽(CPP)溶液，使質(zhì)量濃度為0.1 g/L。取上述配制的溶液各200 mL，分別加入NaH2PO4和CaCl2，使NaH2PO4和CaCl2的濃度均為0.008 mol/L。待溶解后立即用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)反應液的pH至7.2，這段時間為2 min，并不斷滴加NaOH 溶液使pH保持在7.2。記錄不同時刻NaOH 溶液的消耗量，并以時間為橫坐標，NaOH溶液消耗量為縱坐標作圖。

1.7 鯽魚籽糖蛋白細胞增殖實驗

在倒置相差顯微鏡下觀察人體皮膚細胞(HaCat)，匯合度達到90%以上，吸去原培養(yǎng)液，PBS溶液清洗 2 遍，加入 0.25%胰酶 1 mL，37 ℃消化 1 min 后，于倒置相差顯微鏡下觀察細胞。當細胞收縮、變圓且細胞間隙變大時，加入完全培養(yǎng)基1.5 mL終止消化，反復吹打細胞成單細胞懸液，移至 15 mL離心管，1 000 r/min離心 5 min，調(diào)整細胞密度為104/mL，每孔 200 μL接種于 96 孔細胞培養(yǎng)板中，使用完全培養(yǎng)基，37 ℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h，并根據(jù)實驗設計不同時間點加入不同試驗藥物，每組 3個復孔，培養(yǎng)12～72 h，鏡下觀察 HaCat細胞形態(tài)，當培養(yǎng)時間到達72 h時，各孔中加入 5 mg/mL 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，吸出上清，每孔中加入 150 μL二甲基亞砜(DMSO)，搖床振蕩15 min，充分溶解結(jié)晶，用酶聯(lián)免疫測試儀測定570 nm的每孔細胞OD值。細胞存活率的計算見式(2)。

細胞存活率=(實驗組OD值/對照組OD值)×100%

(2)

1.8 鯽魚籽糖蛋白凝血實驗

活化部分凝血活酶時間(APTT)測定。取新鮮兔血于3 000 r/min離心15 min，將上清樣品75 μL和待測樣品25 μL混勻，加入37 ℃預熱的100 μL APTT試劑，在37 ℃水浴孵育5 min，然后加入預熱的25 mmol/L的CaCl2溶液100 μL，迅速啟動秒表記錄凝固時間。以生理鹽水作為空白對照，平行實驗3次。

凝血酶原時間(PT)測定。將兔血離心的上清樣品75 μL和待測樣品25 μL混勻，于37 ℃孵育3 min，加入37 ℃預熱的PT試劑200 μL，迅速啟動秒表記錄凝固時間。以生理鹽水作為空白對照，平行實驗3次。

凝血酶時間(TT)測定。分別取37 ℃預熱的待測血漿150 μL和50 μL的待測樣品進行混合，加入TT試劑200 μL，記錄凝固時間。以生理鹽水作為空白對照，平行實驗3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 鯽魚籽糖蛋白的粗提取

為了進一步研究魚籽中糖蛋白的N-糖鏈結(jié)構，筆者采用苯酚浸提除去酯類物質(zhì)，化學法測定蛋白、總糖和唾液酸的含量。蛋白、總糖和唾液酸的回收率分別為58.2%、36.0%和72.0%。進一步采用SDS-PAGE分析魚籽細胞破碎液和提取的粗蛋白的分子量分布，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，鯽魚籽蛋白組成比較復雜，主要分子量部分在1.97×105、2.7×104和2.2×104，與夏光華等[15]所得到的結(jié)果類似。對粗糖蛋白采用間苯二酚法測量，測得唾液酸含量占干質(zhì)量的2%左右，與文獻[16]報道的最高略有差距，可能是魚籽未發(fā)育成熟所致。對鯽魚籽粗蛋白進行電泳膠條進行切割和PAS染色，發(fā)現(xiàn)條帶上蛋白四周呈紅色(條帶3)，可以判定鯽魚籽提取的粗蛋白含有寡糖鏈。

M—標準蛋白；1—魚籽細胞破碎上清液；2—粗糖蛋白；3—PAS染色

2.2 唾液酸糖蛋白的色譜分離純化

對上述提取的鯽魚籽粗蛋白進行陰離子交換柱層析分離，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，色譜分離峰有2個洗脫峰，經(jīng)積分發(fā)現(xiàn)貫穿峰、峰1和峰2分別占了44.9%、11.0%和44.0%。經(jīng)檢測，峰1和峰2的蛋白都含有唾液酸，因此選擇量多的峰2進行下一步研究。

圖2 鯽魚籽唾液酸糖蛋白離子交換色譜分離

2.3 鯽魚籽唾液酸糖蛋白上寡糖鏈結(jié)構分析

將上述經(jīng)過陰離子交換純獲得峰2收集液透析除鹽，凍干。先用PNGase F酶切處理，獲得鯽魚籽糖蛋白的游離糖鏈，再用MALDI-TOF質(zhì)譜進行分析，N-糖鏈結(jié)構推測結(jié)果如表1所示。由表1結(jié)果可以推斷，鯽魚籽糖蛋白上的寡糖鏈呈分支狀，包括雙天線型和三天線型。含唾液酸糖鏈大約有4種結(jié)構類型，糖鏈末端分布有1～2個NeuAc，連接在半乳糖(Gal)或半乳糖胺上(GalNAc)。

表1 鯽魚籽糖蛋白上含唾液酸的N-糖鏈結(jié)構

2.4 鯽魚籽糖蛋白的生物活性

由于鯽魚籽富含唾液酸糖蛋白，唾液酸糖蛋白有利于預防骨質(zhì)疏松癥[10]。采用磷酸鈣沉淀實驗進行定性實驗測試其阻止磷酸鈣沉淀的能力，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，在空白實驗中，Ca3(PO4)2沉淀在5～10 min迅速生成;而在加入酪蛋白磷酸肽(CPP)和鯽魚籽糖蛋白(0.1 g/L)后，Ca3(PO4)2沉淀生成的時間延遲至20～30 min。這說明酪蛋白磷酸肽和鯽魚籽糖蛋白的加入都能有效延遲Ca3(PO4)2沉淀的生成，表明酪蛋白磷酸肽和鯽魚籽糖蛋白與Ca2+有很好的絡合能力。因此，鯽魚籽糖蛋白具有較好的阻止磷酸鈣沉淀的能力，可用于預防骨質(zhì)疏松癥。

圖3 鯽魚籽唾液酸糖蛋白阻止磷酸鈣沉淀測定

一般來說，多糖和寡糖具有較強的自由基清除能力[17-18]。因此進一步評測鯽魚籽糖蛋白的DPPH自由基清除能力?！PPH是一種穩(wěn)定的自由基，其醇溶液呈現(xiàn)強紫色在517nm波長處有強吸收，加入抗氧化劑后517nm波長處的吸光度減弱。結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，酪蛋白磷酸肽(CPP)和鯽魚籽糖蛋白都具有一定的·DPPH清除能力，隨著反應不斷進行，·DPPH清除率不斷增加，而參照物酪蛋白磷酸肽最高達到了28.1%，鯽魚籽糖蛋白的·DPPH清除率最高達到了14.3%。鯽魚籽糖蛋白的自由基清除能力雖然只有為CPP的一半，但是也表現(xiàn)出有較好的自由基清除能力，通過增加糖蛋白濃度和純度可進一步提高自由基清除能力。

圖4 鯽魚籽糖蛋白的抗DPPH·能力測定

2.5 鯽魚籽糖蛋白的細胞增殖實驗

唾液酸糖蛋白具有一定的生理活性，如能夠促進皮膚細胞的有絲分裂[19]。進一步選取HaCat進行細胞培養(yǎng)實驗，檢測其對細胞增長的作用，結(jié)果如圖5所示。由圖5可以看出，隨著鯽魚籽SGP濃度的增加，細胞的存活率在隨之上升，并且增值率最高達到了160%，表明鯽魚籽SGP對HaCat細胞具有促生長作用。但是培養(yǎng)時間超過72 h后，鯽魚籽SGP的HaCat細胞促生長作用沒有不顯著，推測為細胞本身的正常凋亡過程。

圖5 鯽魚籽糖蛋白的細胞增殖能力

2.6 鯽魚籽糖蛋白的凝血活性評價

進一步測定鯽魚籽糖蛋白的凝血活性，結(jié)果如表3所示。由表3可知，添加不同濃度的鯽魚卵糖蛋白能使APTT、PT、TT均出現(xiàn)凝血時間提前的現(xiàn)象。當鯽魚籽SGP為5.0 mg/mL時，APTT時間為對照的20.8%，PT時間為對照的30.7%，TT時間為對照的28.6%。該結(jié)果表明鯽魚籽SGP可以通過內(nèi)源性途徑、外源性途徑和纖維蛋白原轉(zhuǎn)化等影響凝血過程，具有顯著的促凝血活性。

表2 鯽魚籽糖蛋白的凝血活性時間

對于食材來源唾液酸糖蛋白，目前僅對燕窩和雞蛋的N-糖鏈結(jié)構進行詳細解析，其中燕窩的富含唾液酸糖鏈70%是3天線型和4天線型分叉糖鏈結(jié)構[7]，而禽蛋的N-糖鏈主要是以雙天線型糖鏈結(jié)構為主，有較為復雜的糖鏈結(jié)構，主要分布在IgG等抗體蛋白上[20]。鯽魚籽中唾液酸含量較高，本研究通過分析發(fā)現(xiàn)其含有雙天線和三天線型的糖鏈結(jié)構。另外，在鯽魚籽糖蛋白N-糖鏈上，筆者發(fā)現(xiàn)唾液酸不僅僅連接在半乳糖基上，還連接在GalNAc上。在抗菌方面，SGP中唾液酸化的α-2,6-GalNAc殘基可以作為配體與A型人流感病毒的血凝集素結(jié)合，從而抑制流感病毒與人宿主細胞結(jié)合[21]；而糖蛋白末端含唾液酸的三糖結(jié)構Neu5Ac-α2,3Gal-β1,4GlcNA則能與幽門螺桿菌產(chǎn)生抗結(jié)合作用從而發(fā)揮抗菌作用[22]。鯽魚籽SGP含有α-2,6和α-2,3連接的唾液酸化糖鏈，因此在未來具有廣闊的應用空間。此外，鯽魚籽SGP糖鏈上可能存在巖藻糖，而且部分巖藻糖連接在糖鏈分叉端的GlcNAc上，研究表明動物卵細胞巖藻糖化形成的多種不同抗原，對生殖和發(fā)育具有重要作用[23]。由于鯽魚籽SGP對皮膚細胞HaCat具有促生長作用，因此它也有可能用于護膚品領域；另外，它還具有凝血活性，也可以用于止血材料中。

3 結(jié)論

鯽魚籽糖蛋白分子量主要分布在1.97×105、2.7×104和2.2×104左右。結(jié)構分析表明鯽魚籽主要糖蛋白的N-糖鏈結(jié)構為雙天線和三天線2種分支結(jié)構，大部分N-糖鏈含有唾液酸。生物活性分析表明，鯽魚籽糖蛋白具有阻止磷酸鈣沉淀能力和一定的DPPH自由基清除能力，另外鯽魚籽SGP對HaCat細胞的增值有顯著性促進作用，最高可達到160%，而且還具有較強的凝血活性。