黃 劍，徐晶晶，程雪飛，李國(guó)新，高 飛，童光志

（1.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福州350002；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

非洲豬瘟（african swine fever，ASF）是非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起豬的一種出血性高度接觸性疫病，最急性和急性病毒感染死亡率高達(dá)100%，ASFV是唯一已知的蟲(chóng)媒DNA病毒[1]，持續(xù)感染的野豬和軟蜱是家豬感染ASF的重要傳染源[2]。

該病自1921年在非洲的肯尼亞被首次報(bào)道后，開(kāi)始在非洲蔓延，后傳入歐洲和南美洲。2007年，格魯吉亞報(bào)道ASF疫情后，迅速擴(kuò)散到波蘭、俄羅斯，至今仍在暴發(fā)和流行[3]。2018年8月初，在遼寧某豬場(chǎng)發(fā)生我國(guó)首例ASF疫情，隨后幾個(gè)月，遼寧省、安徽省、浙江省、上海市、重慶市等全國(guó)各省市均報(bào)道發(fā)生ASF疫情，這無(wú)疑給我國(guó)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。

ASFV是雙鏈閉合性DNA病毒，是非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬的唯一成員[1,5-6]。ASFV基因組長(zhǎng)度為170～190 kb，有150多個(gè)開(kāi)放閱讀框（opening reading frame，ORF）[7]，編碼50多種結(jié)構(gòu)蛋白和100多種非結(jié)構(gòu)蛋白。ASFV病毒粒子由里到外主要由5部分組成：含病毒基因組DNA的擬核、內(nèi)核芯殼（core shell）、內(nèi)膜（inner envelope）、衣殼（capsid）和囊膜（external envelope）[8]。其結(jié)構(gòu)主要包含中間約130 kb比較穩(wěn)定的基因區(qū)（stable region），兩邊是約20～40 kb的由串聯(lián)重復(fù)序列和多基因家族（multigene families，MGF）構(gòu)成的可變區(qū)（variable region），末端是有37 nt部分堿基互補(bǔ)配對(duì)的發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu)（hairpin loop）[7]。CP204L基因位于中間穩(wěn)定的基因區(qū)，編碼的p30蛋白主要有參與病毒內(nèi)化的功能，在病毒DNA合成開(kāi)始之前就已經(jīng)產(chǎn)生并持續(xù)表達(dá)至病毒生命周期的結(jié)束[9]，在病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞時(shí)期具有重要作用，具有良好的抗原性[10]。鑒于此，本研究表達(dá)和純化了具有生物學(xué)活性的p30蛋白，為ASFV早期診斷試劑盒的研發(fā)、p30蛋白結(jié)構(gòu)功能研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物pColdI以及Vero細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；含有p30序列的質(zhì)粒pIRES-p30由公司合成；6～8周齡Balb/c小鼠購(gòu)自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑限制性?xún)?nèi)切酶EcoR I、NheI和XbaI購(gòu)自NEB公司；BL21(DE3)、膠回收試劑盒和同源重組酶購(gòu)clonExpress自南京諾唯贊（Vazyme）公司；2×PrimeSTAR? HS DNA Polymerase購(gòu)自TaKaRa公司；細(xì)胞培養(yǎng)液（DMEM）、胎牛血清（FBS）、胰酶和磷酸鹽緩沖液（PBS）購(gòu)自Gibco公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑和IPTG購(gòu)自Sigma公司；去內(nèi)毒素中提質(zhì)粒試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000和Goat anti-Mouse IgG conjugated FITC熒光二抗購(gòu)自上海英濰捷基公司；HRP-conjugated goat Anti-mouse購(gòu)自Protech公司；SDS-PAGE Gel Kit和超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；PierceTMRIPA Buffer購(gòu)自Thermo公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)根據(jù)中國(guó)流行的ASFV毒株（SY18株）p30基因序列（GenBank登錄號(hào)：MH766894.1），設(shè)計(jì)1對(duì)p30基因的特異性引物，由上海桑尼科技有限公司合成。EcoRI-pColdI-p30-F：5'-accctcgagg gatccgaattcATGGATTTTATTTTAAATATATCCAT GAAA-3'；EcoRI-pColdIp30-R：5'-caggtcgacaagc ttgaattcTTAAATGTAGGTGAGAAAAAAGCTTAT TT-3'（其中小寫(xiě)的序列為酶切位點(diǎn)附近的同源臂序列）。

1.4 重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定以實(shí)驗(yàn)室保存的含有目的片段 p30的pIRES質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體反應(yīng)體系如下：2×GC Buffer 25 μL，4 μL 10 mmol/L dNTP，16.5 μL ddH2O，0.5 μL PrimeStar? HS DNA，分別使用引物EcoRI-pColdI-p30-F/ EcoRI-pColdIp30-R擴(kuò)增出用于連接的p30片段，反應(yīng)過(guò)程：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物，回收目的片段。將目的片段與EcoR I單酶切后的pCold I載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至TOP10感受態(tài)細(xì)胞；挑取單菌落，進(jìn)行PCR、酶切鑒定，并送上海桑尼科技有限公司測(cè)序，挑選陽(yáng)性質(zhì)粒，命名為pColdI-p30。

1.5 p30的誘導(dǎo)表達(dá)及純化將構(gòu)建好的pColdI-p30質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落，搖菌，當(dāng)菌液D值為0.6時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，16℃條件下誘導(dǎo)16 h，經(jīng)超聲儀破碎裂解細(xì)胞后，離心獲得上清和沉淀，經(jīng)SDS-PAGE獲取p30的表達(dá)情況。將超聲裂解獲取的沉淀分別經(jīng)過(guò)洗液Ⅰ（2 mol/L尿素、0.1%Triton100、50 mmol/L NaCl、0.2 mmol/L EDTA）和洗液Ⅱ（2 mol/L尿素、0.1%Triton100）清洗離心后，最終使用8 mol/L的尿素（8 mol/L尿素、0.5 mol/L NaCl、20 mmol/L Na2HPO4、20 mmol/L NaH2PO4）[11]溶解純化后的p30蛋白，然后使用BCA測(cè)定法測(cè)p30蛋白的濃度。

1.6 多克隆抗體制備免疫10只Balb/c小鼠，每只小鼠皮下免疫100 ng p30蛋白，共免4次，間隔2周，蛋白與佐劑等體積混合均勻，初免使用弗氏完全佐劑，后3免使用弗氏不完全佐劑，3免和4免后4 d采集小鼠血清。

1.7 免疫熒光檢測(cè)使用pCAGGS-p30和pCAGGS空載分別轉(zhuǎn)染至Vero細(xì)胞，24 h后取出細(xì)胞，用PBS清洗1遍，每孔加入1 mL冰甲醇，-20℃孵育30 min；再用PBS清洗3遍，每遍5 min，每孔加入1 mL多抗（1∶100稀釋?zhuān)?7℃孵育1 h；然后再用PBS清洗3遍，每遍5 min，每孔加入1 mL FITC標(biāo)記的山羊抗鼠的熒光二抗，37℃孵育1 h；接著再用PBS清洗3遍，每遍5 min。最后置于倒置式熒光顯微鏡下觀察。

1.8 Western blot檢測(cè)使用pCAGGS-p30和pCAGGS空載分別轉(zhuǎn)染至Vero細(xì)胞，24 h后收獲細(xì)胞，使用PierceTMRIPA Buffer（含蛋白酶抑制劑）細(xì)胞裂解液冰上裂解15 min，離心收取上清，加入SDSPAGE上樣緩沖液于沸水中煮10 min。然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后半干轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜(NC膜)。將NC膜用含5%脫脂乳的TBST溶液37℃封閉2 h，TBST洗3次，每次10 min；使用陽(yáng)性血清作為一抗孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min；使用HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗（1∶6000）孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min；最后在ECL發(fā)光顯色。

2 結(jié)果

2.1 pColdI-p30的構(gòu)建PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳顯示，在500～750 bp有1條單一的條帶，大小為606 bp，條帶大小與預(yù)期符合。將PCR產(chǎn)物回收，與EcoR I單酶切后的線性化載體pColdI連接并轉(zhuǎn)化TOP10，挑取單菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定和雙酶切鑒定。雙酶切后，條帶大小與預(yù)期符合，并且測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤，命名為pColdI-p30。

圖1 非洲豬瘟病毒p30基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR-amplified p30 gene from ASFV

圖2 pColdI-p30的酶切鑒定Fig.2 Identification of the recombinant plasmid pColdI-p30 by restriction enzymes digestion

2.2 SDA-PAGE鑒定p30表達(dá)當(dāng)IPTG濃度為1mmol/L，在16℃誘導(dǎo)16 h后，pColdI-p30的沉淀出現(xiàn)1條非常明顯的條帶（圖3），大小在25～35 kDa，與預(yù)測(cè)的30 kDa相差不大。pColdI空載、未誘導(dǎo)的pColdI-p30和誘導(dǎo)的pColdI-p30的上清均未出現(xiàn)條帶，說(shuō)明p30蛋白主要在包涵體中大量表達(dá)，包涵體可在8 mol/L尿素溶解。

圖3 p30蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of p30 protein

2.3 多克隆抗體的特異性為驗(yàn)證多克隆抗體的特異性，將pCAGGS和pCAGGS-p30質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至Vero細(xì)胞，進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)（immunofluorescence assay，IFA）和Western blot分析。IFA結(jié)果顯示，p30蛋白多克隆抗體可特異性識(shí)別Vero細(xì)胞中表達(dá)的p30蛋白，而與空白對(duì)照沒(méi)有反應(yīng)（圖4）。針對(duì)p30蛋白多克隆抗體可識(shí)別蛋白分子量約為25 kDa大小的特異性蛋白條帶（圖5）。

3 討論

ASFV是OIE法定報(bào)告的烈性傳染病之一，給全球養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)將其列為動(dòng)物一類(lèi)傳染病，目前還沒(méi)有有效的商品化疫苗問(wèn)世。自2018年8月份以來(lái)，我國(guó)的ASFV疫情形勢(shì)一直在擴(kuò)展，現(xiàn)有ASF的防控方法主要包括流行病學(xué)監(jiān)測(cè)、劃定疫區(qū)以及撲殺受感染動(dòng)物等。目前，在ASF的疫苗研究中，今年5月，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所自主研發(fā)非洲豬瘟疫苗取得了階段性成果，具有良好的生物安全性和免疫保護(hù)性；今年10月，饒子和、王祥喜和步志高團(tuán)隊(duì)合作采用了單顆粒三維重構(gòu)的方法首次解析了非洲豬瘟病毒全顆粒的三維結(jié)構(gòu)[12]，對(duì)新型疫苗研發(fā)、優(yōu)化具有指導(dǎo)意義。

p30是ASFV在感染過(guò)程中引起體液免疫應(yīng)答的1個(gè)重要抗原蛋白，p30產(chǎn)生抗體可阻止病毒內(nèi)吞[13]，已有研究表明，p30蛋白在病毒DNA合成之前就已經(jīng)產(chǎn)生并持續(xù)表達(dá)至病毒生命周期的結(jié)束。李杰等[14]通過(guò)融合表達(dá)方式制備出非洲豬瘟病毒p30-54的多克隆抗體。

本研究針對(duì)ASFV SY18毒株的p30基因，構(gòu)建了重組真核表達(dá)質(zhì)粒和含有His-tag的重組原核表達(dá)質(zhì)粒。在原核表達(dá)系統(tǒng)中，低溫誘導(dǎo)時(shí)，p30蛋白主要呈不可溶性表達(dá)，純化后，用8 mol/L的尿素溶液將包涵體變性溶解，然后用稀釋復(fù)性法將變性的p30蛋白復(fù)性。經(jīng)過(guò)Western blot檢測(cè)和IFA檢測(cè)，制備的p30多克隆抗體具有很好的反應(yīng)原性和特異性，為實(shí)驗(yàn)室后續(xù)進(jìn)一步研究蛋白的生物學(xué)功能以及重組病毒P30的表達(dá)鑒定奠定了基礎(chǔ)。