葛晨玲，蔣康富，石大麗，霍孔林，宋星星，韋德源，胡傳活，王曉曄

（1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530000；2.東營(yíng)市畜牧局，東營(yíng) 257091）

紅斑丹毒絲菌（Erysipelothx rhusiopathiae）是一種纖細(xì)或微彎曲的兼性厭氧的革蘭氏陽(yáng)性桿菌，可廣泛感染各種動(dòng)物引發(fā)丹毒[1]。豬感染紅斑丹毒絲菌后，通過(guò)扁桃體和消化道及其他淋巴組織進(jìn)入血液，主要臨床表現(xiàn)為急性敗血癥、皮膚疹塊、慢性心內(nèi)膜炎和關(guān)節(jié)炎[2]。豬丹毒曾作為我國(guó)“三大豬傳染性病”之一，嚴(yán)重影響我國(guó)畜牧業(yè)健康發(fā)展。隨著疫苗的研制與使用，我國(guó)規(guī)?；i場(chǎng)豬丹毒的發(fā)病明顯減少，僅小型豬場(chǎng)和散養(yǎng)戶有零星發(fā)病[3]。但自2012年底以來(lái)，豬丹毒在廣西多地復(fù)發(fā)[4]，與此同時(shí)，中國(guó)上海、湖南、安徽、江蘇、山東等地也頻頻報(bào)道感染豬丹毒的案例，并逐年遞增呈現(xiàn)卷土重來(lái)的趨勢(shì)。

廣西南寧市武鳴區(qū)某規(guī)模化肉豬場(chǎng)有60日齡左右保育豬700余頭，2018年7月，工作人員巡欄發(fā)現(xiàn)急性死亡豬1只，該豬體重可達(dá)百余斤，全身紅熱，耳、頸、腹部皮膚發(fā)紺，背部出現(xiàn)菱形或方形疹塊且稍隆起于皮膚表面。與病死豬同欄的大部分豬精神萎靡，不愿走動(dòng)，臥地不起，體溫可達(dá)40℃～42℃，呼吸困難，黏膜發(fā)紺，體表淋巴結(jié)腫大，背部也出現(xiàn)菱形疹塊，見圖1。

圖1 發(fā)病豬臨床癥狀Fig.1 Clinical symptoms of sick pigs

現(xiàn)場(chǎng)剖檢病死豬，眼觀呈現(xiàn)典型的急性敗血癥癥狀。腦部大量充血，腸系膜淋巴結(jié)、頜下淋巴結(jié)腫脹充血，呈現(xiàn)暗紅色；肺部鈍圓、腫大，表面覆蓋有纖維素樣物質(zhì)。脾臟呈現(xiàn)褐紅色長(zhǎng)條狀，明顯的淤血腫脹；氣管內(nèi)含有大量粉紅色泡沫，關(guān)節(jié)腔內(nèi)有積液，見圖2。本研究通過(guò)對(duì)分離到的細(xì)菌進(jìn)行生物學(xué)特性和耐藥基因分析，以期掌握其生物學(xué)特性并為臨床用藥提供指導(dǎo)性意見。

圖2 死亡豬剖檢圖Fig.2 Anatomy of a dead pig

1 材料和方法

1.1 樣品來(lái)源2018年7月，廣西武鳴區(qū)某規(guī)模化肉豬場(chǎng)病死保育豬（60日齡左右）。

1.2 主要培養(yǎng)基和試劑TSB營(yíng)養(yǎng)瓊脂、綿羊血瓊脂固體培養(yǎng)基購(gòu)自南寧百賽斯生物試劑公司；2×TaqMasterMix、DL2000 DNA marker及細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）購(gòu)自天根生物科技有限公司；藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

1.3 細(xì)菌的分離鑒定將采集的樣品在無(wú)菌操作環(huán)境下，用平板劃線的方式接種于綿羊血瓊脂固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)20 h，挑取大小一致，色澤鮮明的單個(gè)可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色并鏡檢，以觀察細(xì)菌的形態(tài)及生物學(xué)特性。

1.4 細(xì)菌的16S rRNA的PCR檢測(cè)參照細(xì)菌DNA提取試劑盒說(shuō)明書方法提取分離菌株基因組DNA。設(shè)計(jì)16S rRNA通用引物。上游引物：5'-AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3'，下游引物：5'-ACGGCTACC TTGTTACGACTT-3'，引物由華大基因合成。反應(yīng)體系（25 μL）：2×TaqMaster Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，用ddH2O補(bǔ)至25μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性50 s，52℃退火30 s，72℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。將PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后膠回收后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中參考株的基因序列進(jìn)行同源性比較。

1.5 生物被膜體外形成測(cè)定參考文獻(xiàn)[5]利用TSB肉湯培養(yǎng)分離菌株20 h后，按1∶1000稀釋后，加入到聚丙乙烯無(wú)菌培養(yǎng)板中，每孔200 μL；以無(wú)菌肉湯作陰性對(duì)照。將培養(yǎng)孔分別在28℃和37℃靜置培養(yǎng)24 h，棄菌液洗滌烘干后，采用結(jié)晶紫染色，用乙酸充分溶解后測(cè)定570 nm處D值。將陰性對(duì)照的平均D值加上其標(biāo)準(zhǔn)差定義為ODC，待測(cè)菌株D值與ODC比較，將生物膜形成能力分為4個(gè)等級(jí)，陰性（-）：D5704ODC。

1.6 毒力基因檢測(cè)參考文獻(xiàn)[6-7]擴(kuò)增神經(jīng)氨酸酶（Sialidase）、莢膜多糖（CPS-A）、黏附素（RspA）、表面保護(hù)性抗原（SPaA）4種毒力因子，具體信息見表1，由華大基因合成。反應(yīng)體系（25 μL）：2×TaqMaster Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，用ddH2O補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，相應(yīng)的退火溫度具體見表1；退火30 s，72℃延伸60 s，共34個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5 min。

表1 毒力基因引物序列信息Table 1 Sequence information of the primers for virulence gene

1.7 藥敏試驗(yàn)采用WTO推薦的Kirby-Bauer（K-B）紙片瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定22種抗菌藥物的耐藥性，參照美國(guó)臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）文件（M100-S21）進(jìn)行結(jié)果判定。

1.8 耐藥基因檢測(cè)參考文獻(xiàn)[8-9]擴(kuò)增β-內(nèi)酰胺酶類blaOXA、blaSHV、blaTEM和磺胺類Sul1、Sul2共5種耐藥基因，具體信息見表2，由華大基因合成。反應(yīng)體系（25 μL）：2×TaqMaster Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，用ddH2O補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，相應(yīng)的退火溫度見表1；退火30 s，72℃延伸60 s，共34個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5 min。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離鑒定該菌落在含有5%胎牛血清和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）的綿羊血瓊脂固體培養(yǎng)基上表現(xiàn)為灰白色、半透明、邊緣齊整、如針尖麥芒樣細(xì)小的菌落。經(jīng)鏡檢，該菌呈現(xiàn)稍直或稍彎的桿狀，以單個(gè)或鏈狀存在，有絲狀菌毛，無(wú)芽孢，無(wú)運(yùn)動(dòng)性的革蘭氏陽(yáng)性菌，疑似豬紅斑丹毒絲菌，將其命名為GXWMZD1，見圖3。

表2 耐藥基因引物Table2 Primers for drug resistance genes

圖3 細(xì)菌的分離鑒定Fig.3 Isolation and identification of bacteria

2.2 細(xì)菌的16S rRNA的PCR檢測(cè)分離菌株經(jīng)16S rRNA PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，擴(kuò)增出1條1437 bp的條帶（圖4），與預(yù)期目標(biāo)條帶大小一致，與陽(yáng)性對(duì)照相同，且陰性未擴(kuò)增出條帶，將測(cè)序得到的序列與NCBI公布的序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果表明，分離菌株與豬紅斑丹毒絲菌在基因關(guān)系上最接近，同源性高達(dá)99.9%，證實(shí)該分離菌株為豬紅斑丹毒絲菌。

圖4 細(xì)菌的16S rRNA的PCR檢測(cè)Fig.4 PCR detection of bacterial 16S rRNA

2.3 分離菌株的同源性及進(jìn)化樹分析利用DNAStar軟件對(duì)所測(cè)序列和GenBank中公布的國(guó)內(nèi)外豬丹毒桿菌的16S rRNA序列進(jìn)行比對(duì)，具體菌株信息見表2，該菌株與比對(duì)菌株的同源性基本為91.9%～99.6%（圖6），與中國(guó)廣西2014年分離株Er.GXGG-1同源性最高，可達(dá)99.6%。經(jīng)遺傳進(jìn)化樹分析，結(jié)果表明，分離菌株GXWMZD1與來(lái)自中國(guó)廣東的GD-GZ菌株位于同一分支上，與ZYL、SY1027、WC14.1、QY13.1、Er.GXGG-1等菌株分離地同為中國(guó)，且處于同一分支上（圖7）。

表3 同源關(guān)系比對(duì)菌株信息表Table 3 Homologous relationship comparison strain information table

圖5 16S rRNA基因核苷酸序列同源性比對(duì)Fig.5 Homology comparison of 16S rRNA gene nucleotide sequence

圖6 16S rRNA基因核苷酸序列遺傳進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree of nucleotide sequence of 16S rRNA gene

2.4 生物被膜體外形成測(cè)定結(jié)果采用微孔板半定量粘附法對(duì)生物被膜體外形成進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，分離菌株在28℃培養(yǎng)24 h后，D570的平均值為1.615，標(biāo)準(zhǔn)差為0.322，陰性對(duì)照為0.157，標(biāo)準(zhǔn)差為0.090，表明分離菌株在28℃形成能力適中（4+），分離菌株在37℃培養(yǎng)24 h后，D570的平均值為0.517，標(biāo)準(zhǔn)差為0.177，陰性對(duì)照為0.090，標(biāo)準(zhǔn)差為0.011，表明菌株在37℃形成能力適中（4+），比較分離菌株在28℃和37℃形成生物被膜的能力顯示，28℃更有利于分離菌株的生物被膜形成（圖7、8）。

圖7 生物被膜體外形成結(jié)果Fig.7 Results of biofilm formation in vitro

圖8 生物被膜體外形成結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖Fig.8 Results of statistical graph biofilm formation

2.5 毒力基因檢測(cè)結(jié)果通過(guò)PCR的方法擴(kuò)增莢膜多糖（CPS-A）、黏附素（RspA）、表面保護(hù)性抗原（SPaA）、神經(jīng)氨酸酶（Sialidase）4種毒力因子。結(jié)果表明，擴(kuò)增出CPS-A（1168 bp）、RspA（1186 bp）、SPaA（1800 bp）3種毒力因子，條帶大小與預(yù)期目標(biāo)條帶大小一致，與陽(yáng)性對(duì)照相同，且陰性未擴(kuò)增出條帶，神經(jīng)氨酸酶（Sialidase）未擴(kuò)增出條帶，具體結(jié)果見圖9。

圖9 毒力因子檢測(cè)結(jié)果Fig.9 Results of virulence factor test

2.6 藥物敏感性檢測(cè)結(jié)果通過(guò)WTO推薦的Kirby-Bauer（K-B）紙片瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定22種抗菌藥物的耐藥性，參照美國(guó)臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）文件（M100-S21）進(jìn)行結(jié)果判定。見表3，其中總耐藥率為68.18%（15/22）中介率為13.64%（3/22），僅對(duì)米諾環(huán)素、多西環(huán)素、恩諾沙星、氟苯尼考4種藥物敏感，敏感率只有18.18%（4/22）。對(duì)于氨基糖胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類7種藥物的耐藥率可到100.00%，β-內(nèi)酰胺類藥物除頭孢哌酮外，對(duì)其余的4種藥物均耐藥，占受試藥物的80.00%，但頭孢哌酮的抑菌環(huán)直徑可達(dá)20 mm，屬于中介的邊緣，其敏感度有進(jìn)一步向耐藥轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)。

2.7 耐藥基因檢測(cè)藥敏結(jié)果顯示分離菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺類、磺胺類的藥物耐藥率較高，進(jìn)行針對(duì)性的耐藥基因擴(kuò)增，擴(kuò)增β-內(nèi)酰胺酶類blaOXA、blaSHV、blaTEM，磺胺類Sul1、Sul2共5種耐藥基因。PCR結(jié)果顯示（圖10），擴(kuò)增出blaTEM（788 bp），Sul2（435 bp）2種耐藥基因，與目標(biāo)條帶的大小一致，陰性未擴(kuò)增出條帶，該結(jié)果與藥敏實(shí)驗(yàn)的結(jié)果呈現(xiàn)正相關(guān)。

3 討論

本研究從某規(guī)?；庳i場(chǎng)急性死亡的保育豬（60日齡左右）中成功分離出1株豬紅斑丹毒絲菌，通過(guò)細(xì)菌的分離鑒定、16S rRNA的擴(kuò)增、生物被膜的形成條件等方法對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行分析。細(xì)菌生物膜可作為一種生物屏障系統(tǒng)，使存在于其中的菌體（被膜菌）相對(duì)于其單個(gè)浮游狀態(tài)的菌體（浮游菌）對(duì)抗菌藥物表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗性[10]，而胞外基質(zhì)能有效的抑制免疫細(xì)胞的吞噬作用[11]。生物膜一旦形成，膜內(nèi)細(xì)菌比浮游細(xì)菌耐藥性增加100～1000倍以上[12-13]。當(dāng)致病菌通過(guò)群體感應(yīng)效應(yīng)形成生物膜，則會(huì)導(dǎo)致頑固性疾病難以根治[14-15]。相較于37℃，該分離菌株在28℃時(shí)生物被膜體外形成的能力更強(qiáng)。夏季豬場(chǎng)的飼養(yǎng)環(huán)境的平均室溫可達(dá)28℃，一些圈舍設(shè)備、飼槽上的細(xì)菌可能乘機(jī)肆意生長(zhǎng)，體外被膜的形成助長(zhǎng)其對(duì)消毒劑的抗性，為疾病的形成提供了溫床。

表4 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of drug sensitivity test

圖10 分離細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)Fig.10 Detection of isolated bacterial resistance genes

本研究通過(guò)藥物敏感性試驗(yàn)、耐藥基因的檢測(cè)等試驗(yàn)方法，對(duì)分離菌株的耐藥情況進(jìn)行鑒定。對(duì)于受試的22種藥物來(lái)說(shuō)，該菌株僅對(duì)米諾環(huán)素、多西環(huán)素、恩諾沙星、氟苯尼考4種藥物敏感，敏感率僅為18.18%（4/22），且擴(kuò)增出β-內(nèi)酰胺酶類blaTEM（788 bp），磺胺類Sul2（435 bp）2種耐藥基因。由此可見，該菌株的藥物敏感性差，耐藥譜廣，多重耐藥情況嚴(yán)重。本研究與陸英杰等[16]對(duì)從廣東分離的5株豬紅斑丹毒絲菌均對(duì)林可霉素耐藥、恩諾沙星敏感的結(jié)果一致，與陸萍等[17]對(duì)安徽分離到的28株豬紅斑丹毒絲菌對(duì)氨 西林、青霉素敏感的試驗(yàn)結(jié)果略有差異，與唐愛明等[18]對(duì)湖南長(zhǎng)沙分離到的3株豬紅斑丹毒絲菌對(duì)磺胺類藥物耐藥的結(jié)果一致，與曾文斌等[19]從江西分離到的2株豬丹毒桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺酶類藥物高度敏感的試驗(yàn)結(jié)果并不相符，這可能與臨床用藥習(xí)慣有關(guān)[20]。目前，大多數(shù)對(duì)于豬丹毒紅斑絲菌的研究?jī)H停留于各種藥物的敏感性，并未對(duì)耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)。本研究表明耐藥表型與耐藥基因呈現(xiàn)正相關(guān)，該菌株為復(fù)合基因型耐藥菌株，應(yīng)加強(qiáng)耐藥性檢測(cè)，謹(jǐn)防敏感菌轉(zhuǎn)化為耐藥菌。

綜上所述，本研究已成功分離出1株豬紅斑丹毒絲菌，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行測(cè)定，該菌株生長(zhǎng)迅速，生物被膜體外形成能力強(qiáng)，擴(kuò)增出莢膜多糖CPS-A、黏附素RspA、表面保護(hù)性抗原SPaA共3種毒力基因，多重耐藥情況嚴(yán)重，擴(kuò)增出β-內(nèi)酰胺酶類blaTEM、磺胺類Sul2 2種耐藥基因。