段倩玉，蔣 蔚，陳 蕓，張曼玉，曹敬政，王 權(quán)

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，南京210095）

剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）是一種重要的機會性致病原蟲，該寄生蟲在全世界范圍存在，可以感染包括哺乳動物和鳥類在內(nèi)的幾乎所有溫血動物[1]。攝入未煮熟含包囊的肉或接觸含卵囊的貓糞都會導(dǎo)致感染。在人類中，免疫功能正常的感染者通常是無癥狀的，而免疫功能亢進的感染者可能患腦炎，免疫功能受損的感染者和經(jīng)胎盤獲得弓形蟲的先天性弓形蟲病患者可能會產(chǎn)生嚴重疾??；如果孕婦在懷孕期間感染，則會導(dǎo)致胎兒發(fā)育中的嚴重先天性疾病，造成死產(chǎn)和新生兒損失[2]。此外，家畜感染可對公共健康構(gòu)成威脅并造成巨大的經(jīng)濟損失[3]。因此，預(yù)防弓形蟲病對于人類健康和畜牧業(yè)的發(fā)展均具有重要意義。

剛地弓形蟲作為專性細胞內(nèi)寄生原蟲，必須入侵宿主細胞來獲取營養(yǎng)并在細胞內(nèi)增殖。微線體、棒狀體和致密顆粒作為弓形蟲的三種重要細胞器，可幫助弓形蟲入侵宿主細胞并誘導(dǎo)宿主細胞發(fā)生改變[4]。棒狀體是一個大的且具有細長輸送管道的細胞器，在蟲體入侵的同時，器官內(nèi)容物（棒狀體蛋白）通過管道釋放出來[5]。棒狀體蛋白（rhoptry protein，ROPs）在宿主細胞的入侵、納蟲空泡（parasitophorous vacuole，PV）的形成及弓形蟲的增殖調(diào)節(jié)中起重要作用。其中，弓形蟲棒狀體蛋白18（rhoptry protein 18，ROP18）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于ROP2（rhoptry protein 12）蛋白質(zhì)家族，對急性毒力具有重要意義。在弓形蟲感染期間，宿主細胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫相關(guān)蛋白（immunityrelated GTPases，IRGs）通過破壞納蟲空泡膜（parasitophorous vacuole membrane，PVM）的完整性來攻擊寄生蟲；而弓形蟲分泌的ROP18可通過N末端低復(fù)雜性區(qū)域結(jié)合在PVM上，并通過磷酸化宿主產(chǎn)生的GTP酶（IRGs）而防止PVM被破壞，以逃避宿主的免疫攻擊[6]。ROP18作為弓形蟲的重要毒力因子，其生物學(xué)功能有待更深入的研究，為此，本研究選擇實驗室常用的Ⅰ型強毒力蟲株RH株用來擴增截短的ROP18基因，構(gòu)建原核表達質(zhì)粒，成功獲得了重組ROP18蛋白，并利用純化后的蛋白免疫小鼠制備多克隆抗體，通過Western blot和間接免疫熒光試驗（indirect immunofluorescence assay，IFA）鑒定重組蛋白免疫活性，為深入研究其生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 弓形蟲蟲株、菌種、質(zhì)粒與小鼠剛地弓形蟲RH株由本實驗室液氮冷凍保存；大腸埃希菌（E.coli）DH5α及BL21（DE3）感受態(tài)細胞購自天根生化科技有限公司；原核表達質(zhì)粒pET-30a（+）由本實驗室保存；昆明雌性8周齡小鼠購自上海杰思捷實驗動物有限公司。

1.2 試劑與儀器高保真DNA聚合酶購自諾唯贊生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和HindⅢ、T4連接酶、DL2000 DNA marker、DL15000 DNA marker購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；樹脂型基因組DNA提取試劑盒購自上海賽百盛基因技術(shù)有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自美國AXYGEN公司；小量質(zhì)粒提取試劑盒、AlexaFluor488標記的驢抗鼠IgG、蛋白marker、ECL底物顯色液試劑盒購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物和瓊脂粉購自英國OXOID公司；卡那霉素、異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自Bio-Rad公司；WHB細胞爬片購自上海臥宏生物科技有限公司；DAPI、抗熒光淬滅劑購自上海碧云天技術(shù)有限公司；PCR擴增引物由上海睿勉生物科技有限公司合成；PCR儀購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；培英THZ-D臺式恒溫振蕩器購自北京乾明基因技術(shù)有限公司；DYY-6D型電腦三恒多用電泳儀電源購自艾科儀器設(shè)備有限公司；Bio-Rad GelDoc EZ凝膠成像系統(tǒng)、PowerPac? 通用電泳儀電源購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；細菌恒溫培養(yǎng)箱購自濟南樂瑞醫(yī)療器械有限公司；SYG-20型銀汞調(diào)合器購自上海寰熙醫(yī)療器械有限公司；蔡司激光共聚焦顯微鏡由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所中心儀器實驗室保管。

1.3 弓形蟲DNA的提取從液氮中復(fù)蘇凍存的弓形蟲RH株，于37℃水浴快速解凍，269×g離心8 min，收集沉淀，用300 μL無菌生理鹽水重懸蟲體，腹腔注射接種昆明鼠，待3 d后小鼠出現(xiàn)被毛豎立、精神不振等癥狀時，采用頸椎脫臼法將小鼠處死，無菌生理鹽水沖洗腹腔收集腹水，吸到5 mL注射針管中，以5 μm濾器過濾純化，269×g離心8 min，收集沉淀獲得弓形蟲。用樹脂型基因組DNA提取試劑盒提取RH株的基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物的設(shè)計與合成根據(jù)剛地弓形蟲RH株的ROP18蛋白編碼基因序列（GenBank登錄號：JX045330）設(shè)計合成一對含有BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位點的引物（劃線部分是酶切位點），上游引物F：5'-CGCGGATCCATGTTAGAGGGACAGCCAG CA-3'；下游引物R：5'-CCCAAGCTTTTATTCTGT GTGGAGATGTTCCTG-3'。

1.5 ROP18基因的擴增以弓形蟲RH株的基因組DNA為模板，以合成引物F/R擴增ROP18基因。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 重組質(zhì)粒pET-30a-ROP18的構(gòu)建及鑒定用小量質(zhì)粒提取試劑盒提取pET-30a（+）質(zhì)粒，將已純化的ROP18目的片段與pET-30a（+）載體分別用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ進行雙酶切，并用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收酶切后的條帶?；厥债a(chǎn)物用T4 DNA連接酶16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌（E.coli）DH5α感受態(tài)細胞中，用含70 μg/mL卡那霉素的固體LB平皿培養(yǎng)后挑取單個菌落擴增后小提質(zhì)粒，進行PCR和雙酶切鑒定，將鑒定正確的陽性重組質(zhì)粒送至蘇州金唯智生物科技有限公司測序。

1.7 重組蛋白的表達及可溶性鑒定測序正確后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌（E.coli）BL21（DE3）感受態(tài)細胞，過夜培養(yǎng)，挑取陽性BL21單克隆菌落，接種于含70μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 rpm震蕩過夜，次日以1∶50的比例擴大培養(yǎng)至A600為0.4～0.6時，加入IPTG至終濃度為0.2 mmol/L，37℃、180 rpm誘導(dǎo)表達6 h，同時設(shè)置空載對照及未誘導(dǎo)對照，9705×g離心10 min，收集菌體沉淀，用無菌1×PBS洗滌菌體沉淀3次，再用原菌液體積1/10的PBS重懸菌體沉淀，置于冰上超聲破碎，9705×g離心10 min，分別收集上清液和沉淀。SDS-PAGE電泳分析重組蛋白的存在形式。

1.8 重組蛋白ROP18的純化包涵體形式的目的蛋白以His·bind Resin純化試劑盒純化效果不佳，故采用KCl染色切膠法[7]純化目的蛋白：根據(jù)目的蛋白相對分子量配制15%的分離膠，并配一層薄層濃縮膠，不插樣品梳直接上樣進行SDS-PAGE電泳，80 V、20 min后轉(zhuǎn)120 V、60 min至溴酚藍達最底部，停止電泳。將膠塊取下置于提前配制好的預(yù)冷的KCl（0.25 mol/L）中，室溫震蕩染色5～10 min，出現(xiàn)銀白色條帶，將膠條切下，1×PBS洗3遍直至膠條無色，膠條置于-80℃保存?zhèn)溆谩⒛z條用干凈的研缽研磨成細沙狀收集于離心管中，加入適量1×PBS，振蕩混勻后依次置于-80℃、室溫反復(fù)凍融3次，9705×g離心30 min，吸取上清即為純化后目的蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。

1.9 鼠抗重組蛋白ROP18多克隆抗體的制備將純化后的足夠濃度的重組蛋白加等體積的完全佐劑乳化后，按照100 μg/只首次免疫昆明小鼠的足墊，之后按等體積加不完全佐劑乳化，依然按照100 μg/只的劑量每隔兩周加強免疫一次。其中，二免部位為皮下，三免部位為肌肉，三免10 d后尾靜脈采集血液分離血清，以ELISA法檢測多克隆抗體效價。

1.10 重組蛋白ROP18的Western blot分析取蛋白純化后樣品于EP管中，加適量蛋白上樣緩沖液，充分混勻后煮沸10 min，進行SDS-PAGE。電泳結(jié)束后，將目的蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜，以5%脫脂乳室溫封閉1.5 h，加入1∶500倍稀釋犬陽性血清，室溫孵育3 h，1×PBST洗滌3次后，加入1∶2000倍稀釋的HRP標記的山羊抗犬IgG作為二抗室溫孵育1.5 h，充分洗滌后進行ECL顯影反應(yīng)，化學(xué)發(fā)光成像觀察結(jié)果。

1.11 重組蛋白ROP18的間接免疫熒光試驗分析將Vero細胞接種于提前備好的帶有WHB細胞爬片的24孔細胞板內(nèi)，顯微鏡下觀察細胞生長至鋪滿細胞板80%時，按速殖子與Vero細胞比例為1∶1接種弓形蟲速殖子，繼續(xù)置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；感染24 h后用鑷子取出爬片，1×PBS洗滌3遍；用4%多聚甲醛于4℃固定20 min；洗滌后，用0.5%的TritonX-100處理15 min，1×PBS洗滌3遍；于濕盒內(nèi)用1% BSA（PBS稀釋）37℃封閉30 min；充分洗滌后加入1% BSA稀釋的鼠抗ROP18抗血清（1∶1000）作為一抗，37℃孵育1 h，1×PBS洗滌3次；避光加入Alexa Fluor 488標記的驢抗鼠IgG（1∶2000）作為二抗，37℃孵育1 h，1×PBS洗滌3次；細胞爬片經(jīng)DAPI復(fù)染細胞核后充分洗滌風(fēng)干，滴加抗熒光淬滅劑封片，通過激光共聚焦顯微鏡的油鏡觀察并采集圖像。

2 結(jié)果

2.1 ROP18基因的擴增以剛地弓形蟲RH株的基因組DNA為模板，采用PCR方法擴增ROP18截短基因，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，出現(xiàn)單一目的條帶，大小為678 bp，與預(yù)期大小一致，且陰性對照處無特異性條帶（圖1）。

圖1 ROP18基因的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of ROP18 gene

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定

2.2.1 重組質(zhì)粒的PCR鑒定 以構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-30a-ROP18為模板，以F/R為引物進行PCR擴增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，出現(xiàn)與預(yù)期大小一致的目的片段（圖2）。

2.2.2 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定 構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-30a-ROP18經(jīng)BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切得到約5400 bp與678 bp 2條片段，與預(yù)期大小一致（圖3），說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 pET-30a-ROP18重組質(zhì)粒的PCR鑒定Fig.2 Identification of pET-30a-ROP18 by PCR amplication

圖3 pET-30a-ROP18重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.3 Identification of pET-30a-ROP18 by double enzyme digestion

2.3 重組蛋白的表達及可溶性鑒定取超聲破碎后的上清液和沉淀經(jīng)SDS-PAGE鑒定，可看出在沉淀中約31 kDa處有一條明顯的蛋白條帶，重組蛋白分子量大小與預(yù)期相符，且以包涵體形式存在于沉淀（圖4），獲得的重組蛋白命名為rROP18。

圖4 pET-30a-ROP18表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of pET-30a-ROP18 expression

2.4 重組蛋白rROP18純化后SDS-PAGE分析采用KCl染色切膠法純化包涵體形式表達的目的蛋白，將膠條研磨至細沙狀依次置于-80℃、室溫反復(fù)凍融3次，離心后收集上清，成功獲得高純度的重組蛋白rROP18（圖5）。

2.5 重組蛋白rROP18的Western blot分析將純化后的重組蛋白rROP18進行Western blot分析（圖6）。結(jié)果顯示，該蛋白能夠被弓形蟲感染的犬陽性血清識別，在31 kDa處有特異性條帶。說明重組蛋白rROP18有良好的反應(yīng)原性。

2.6 間接免疫熒光試驗分析用重組蛋白rROP18免疫小鼠制備的多克隆抗體進行間接免疫熒光試驗。通過激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)制備的多克隆抗體能特異性識別弓形蟲的天然蛋白ROP18，其主要分布在弓形蟲速殖子的胞漿內(nèi)，且棒狀體常存在的部位呈現(xiàn)較強熒光（圖7）。

3 討論

圖5 rROP18純化后的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of the purified recombinant protein ROP18

圖6 rROP18的Western blot分析Fig.6 Western blot analysis of rROP18

圖7 針對rROP18的多克隆抗體IFA結(jié)果Fig.7 IFA results of rROP18 polyclonal antibody

弓形蟲屬于專性細胞內(nèi)寄生原蟲，能在世界范圍內(nèi)感染幾乎所有溫血動物和人類，引起人獸共患弓形蟲病，嚴重威脅著人類健康且對畜牧業(yè)的發(fā)展造成巨大的經(jīng)濟損失[8]。弓形蟲與宿主天然免疫系統(tǒng)之間存在著精妙的平衡關(guān)系。弓形蟲病的防治，除了篩選有效的抗弓形蟲藥物外，開發(fā)研制有效的疫苗是防治本病的重點，而對其天然免疫影響因素的了解是研制開發(fā)新型疫苗的第一步。當弓形蟲感染發(fā)生時，宿主天然免疫系統(tǒng)被激發(fā)，激活樹突細胞和巨噬細胞分泌促炎細胞因子（如IL-12）刺激自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）和CD4/CD8 T細胞分泌γ-干擾素[9]。IFN-γ是宿主控制弓形蟲感染的關(guān)鍵因素，它誘導(dǎo)產(chǎn)生的IRGs通過破壞PVM的完整性來攻擊寄生蟲[10-13]。對于無毒力的弓形蟲蟲株而言，IRGs可高效聚集到PVM上，因此，它們的速殖子能有效地被宿主清除。然而，Ⅰ型強毒株如RH株在PVM上分泌防御因子來阻斷宿主細胞的清除機制，因此，他們能繁殖并導(dǎo)致急性弓形蟲病[14-16]。近些年來，弓形蟲用于抵抗宿主免疫清除的因子被廣泛研究。其中，ROP18屬于ROP2家族中真正的絲氨酸/蘇氨酸激酶，在調(diào)控宿主免疫和細胞凋亡中起關(guān)鍵作用，這可能有助于弓形蟲的免疫逃逸及在宿主細胞內(nèi)寄生[17]。ROP18可定位在PV上，一些部位富含精氨酸，推測可能與該蛋白錨定在PVM表面有關(guān)；另外，ROP18通過特異性結(jié)合不同的宿主免疫相關(guān)分子介導(dǎo)宿主先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的抑制[18]：例如ROP18可與IRG6結(jié)合，使其磷酸化喪失活性，不能聚積于PVM上并破壞弓形蟲周圍的PVM，使蟲體逃避宿主免疫系統(tǒng)的清除在宿主體內(nèi)生存并繁殖；ROP18還可磷酸化Smad1 Ser-187以觸發(fā)其蛋白酶體依賴性降解[19]。綜上所述，ROP18在弓形蟲的入侵和逃避宿主天然免疫清除方面起重要作用，是弓形蟲的重要毒力因子。弓形蟲還具有介導(dǎo)宿主細胞線粒體與PVM結(jié)合的能力，宿主細胞線粒體和PVM之間的接觸可能為弓形蟲蛋白和宿主線粒體的相互作用提供更好的通道，其中，ROP18就具有維持宿主細胞線粒體膜完整性和操縱宿主細胞線粒體凋亡的潛力[20]。本研究對弓形蟲RH株ROP18基因的表達及免疫活性鑒定，為ROP18功能和運用的深入研究提供基礎(chǔ)材料。

本研究從GenBank中查找弓形蟲RH株編碼ROP18的基因序列，設(shè)計特異性引物，選擇330～555 aa片段構(gòu)建重組質(zhì)粒，插入的弓形蟲基因片段測序結(jié)果與GenBank參考序列比對，同源性為100%。在IPTG終濃度為0.2 mmol/L，37℃、180 rpm誘導(dǎo)6 h時能成功以包涵體形式大量表達目的蛋白；采用KCl切膠法純化后，可獲得高濃度的目的蛋白，并且免疫小鼠后成功制備出ROP18的多克隆抗體。Western blot結(jié)果表明：該重組蛋白能與感染弓形蟲的犬陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)；IFA結(jié)果顯示：ROP18主要分布在弓形蟲速殖子的胞漿內(nèi)，且棒狀體常存在的部位呈現(xiàn)較強熒光。荊振宇[21]將截短的ROP18基因連接到pET-30a(+)構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒，表達的重組蛋白有非常好的免疫活性，初步建立了弓形蟲病ELISA檢測方法。本研究制備的重組表達蛋白rROP18有良好免疫活性，為今后深入研究弓形蟲的入侵機制及ROP18在抵抗宿主天然免疫方面功能的研究奠定了堅實基礎(chǔ)。