郝娟，吳婕，佘之蘊(yùn)，張娟

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510610；2.廣州力衡臨床營養(yǎng)品有限公司，廣州510610；3.廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，廣東佛山528300）

0 引 言

克羅諾桿菌（Cronobacter spp.）是一類革蘭氏陰性無芽孢桿菌，一種重要的條件致病菌?？肆_諾桿菌屬于2008年由Iversen等建立[1-3]，之前被稱作阪崎腸桿菌（Enterbacter sakazakii）。Strydom等于2012年根據(jù)DNA雜交、表型分型、16SrRNA測序和多序列分析法對該屬菌株進(jìn)行重新分類，確定其包括7個(gè)種和3個(gè)亞種[4]。該菌感染新生兒可引起腦膜炎、菌血癥、壞死性小腸結(jié)腸炎等疾病[5]，并可引起嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥和較高的死亡率。嬰幼兒配方乳粉是感染克羅諾桿菌的主要渠道。我國國家標(biāo)準(zhǔn)中均明確規(guī)定0～6月齡嬰幼兒配方食品不得檢出克羅諾桿菌，而嬰幼兒輔助食品中克羅諾桿菌的限量在國內(nèi)外均未做出相應(yīng)規(guī)定?；诖?，針對免疫力低下的群體，該菌的污染存在一定的風(fēng)險(xiǎn)。

目前，克羅諾桿菌的實(shí)驗(yàn)室檢測方法主要是傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法，但因?yàn)闄z測周期長，無法及時(shí)應(yīng)對突發(fā)事件。隨著分子生物學(xué)檢測技術(shù)的發(fā)展，各種快速檢測技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，縮短了檢測時(shí)間，提高了檢測效率[6-7]。但這些技術(shù)存在需要使用復(fù)雜的儀器，對操作人員要求高等問題，限制了其在應(yīng)急檢測中的應(yīng)用。核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)由于無需特殊設(shè)備，反應(yīng)速度快，靈敏度高等特點(diǎn)，在諸多領(lǐng)域已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification，RPA）作為一種新型的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，反應(yīng)模式與PCR類似，但不需要加熱變性步驟，而是利用重組酶代替高溫解鏈，采用單鏈結(jié)合蛋白防止DNA復(fù)性，整個(gè)反應(yīng)僅需15～20 min完成。相對比較成熟的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，RPA引物設(shè)計(jì)簡單，無需加熱反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物可進(jìn)行后續(xù)分析。本研究以重組酶聚合酶擴(kuò)增法為主要檢測技術(shù)，對比國家標(biāo)準(zhǔn)方法和熒光定量檢測方法的結(jié)果，調(diào)查嬰幼兒食品中克羅諾桿菌的污染狀況。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

樣品采購自大型商場、超市、母嬰店、藥店及網(wǎng)購的國產(chǎn)和進(jìn)口嬰幼兒配方乳粉以及嬰幼兒谷物食品，共196個(gè)品牌560份樣品，樣品包裝完整且均在保質(zhì)期內(nèi)。

1.2 材料與設(shè)備

培養(yǎng)基：BPW 培養(yǎng)基、改良月桂基硫酸鹽蛋白胨肉湯—萬古霉素(mLST-Vm)肉湯、胰蛋白大豆瓊脂(TSA)、阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基(DFI)。

試劑：Premix Taq DNA聚合酶；食品基因組提取試劑盒；細(xì)菌基因組提取試劑盒；RAA熒光檢測試劑盒；所用引物和探針由上海生工生物公司合成。

設(shè)備：CL-40M高壓滅菌鍋；GHP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱；AC2-6S1生物安全柜；玻璃熱珠滅菌器；Easy-mix拍擊式均質(zhì)器；dilumat S電子稀釋器；Nanodrop 2000微量紫外分光光度計(jì)；QuantStudio 7 Flex熒光PCR儀；DK-8D電熱恒溫水槽；3-30K高速冷凍離心機(jī)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 國家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測克羅諾桿菌

按照GB 4789.40-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）檢驗(yàn)》的檢測流程進(jìn)行檢驗(yàn)。無菌條件下取檢樣100 g加入900 mL已預(yù)熱至44℃的緩沖蛋白胨水中，充分溶解后于36±1℃培養(yǎng)18±2 h。移取1m L轉(zhuǎn)種于10 mL（mLST-Vm）肉湯，44±0.5℃培養(yǎng)24±2 h。各取增菌液1環(huán)，分別劃線接種于兩個(gè)阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基平板，36±1℃培養(yǎng)24±2h。挑取可疑菌落劃線接種于TSA平板，25±1℃培養(yǎng)48±4 h。自TSA平板上直接挑取黃色可疑菌落，用VITEK2全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行生化鑒定。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測克羅諾桿菌

參照SN/T 1632.3-2013《出口奶粉中阪崎腸桿菌（克羅諾桿菌屬）檢驗(yàn)方法第3部分：熒光PCR方法》的檢測方法進(jìn)行。取2.1中的增菌液用于細(xì)菌基因組的提取，操作按照細(xì)菌基因組提取試劑盒的操作說明進(jìn)行。熒光PCR檢測依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)要求操作，根據(jù)檢測樣品Ct值報(bào)告陽性或陰性結(jié)果。

1.3.3 RPA法檢測克羅諾桿菌

按照RRA熒光檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作。反應(yīng)體系為50μL，向裝有干粉酶制劑的反應(yīng)管中加入45.5μL反應(yīng)緩沖液，再分別加入2.0μL待測DNA、陽性對照或陰性對照，在反應(yīng)管蓋上加入2.5μL的醋酸鎂溶液，蓋上管蓋，上下顛倒充分混勻5～6次，低速離心10 s。RAA反應(yīng)干粉酶制劑包含SSB單鏈結(jié)合蛋白、重組酶蛋白、DNA聚合酶、Exo核酸外切酶和輔酶等。

擴(kuò)增反應(yīng)程序：預(yù)熱，39℃，40 s，一個(gè)循環(huán)；擴(kuò)增，39℃，30 s，30個(gè)循環(huán)，收集熒光信號(hào)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種類嬰幼兒食品中克羅諾桿菌的污染狀況

本次檢測嬰幼兒食品主要包括嬰幼兒配方食品、較大嬰兒和幼兒配方食品以及嬰幼兒谷類輔助食品三大類。由表1可看出，克羅諾桿菌的總體檢出率為2.68%，其中嬰幼兒配方食品以及較大嬰兒和幼兒配方食品的檢出率為0，嬰幼兒谷類輔助食品檢出率為4.84%。本次嬰幼兒食品中克羅諾桿菌的檢出情況相比之前的國內(nèi)報(bào)道，均表現(xiàn)在嬰幼兒谷類輔助食品的檢出率普遍較高，而嬰幼兒配方食品以及較大嬰兒和幼兒配方食品則相對穩(wěn)定，檢出率低，總體污染情況處于相對較低的水平[8-10]。

表1 不同種類嬰幼兒食品中克羅諾桿菌的檢出情況

2.2 不同檢測方法在嬰幼兒食品中克羅諾桿菌的檢測情況

本次檢測主要運(yùn)用RPA方法，輔以傳統(tǒng)培養(yǎng)法和實(shí)時(shí)熒光PCR法加以驗(yàn)證檢測結(jié)果。對560份樣品檢測發(fā)現(xiàn)，3種檢測方法的定性結(jié)果一致。如表2所示，在檢測結(jié)果一致的前提下，對比3種檢測方法發(fā)現(xiàn)，RPA方法大大提高了檢測效率，雖然鑒于檢測原理是核酸擴(kuò)增，會(huì)出現(xiàn)假陽性的結(jié)果，但對于樣品初篩可以提供很大的便利性。

表2 3種檢測方法的比較

3 結(jié) 論

本研究確定了RPA方法檢測嬰幼兒食品中克羅諾桿菌的可行性及準(zhǔn)確性，與傳統(tǒng)培養(yǎng)法和實(shí)時(shí)熒光PCR法獲得一致的結(jié)果。與上述兩種方法相比較，RPA法體現(xiàn)出了在檢測效率方面的優(yōu)越性，適于樣品初篩和現(xiàn)場快速檢測，有利于及時(shí)應(yīng)對食品突發(fā)事件。

基于本次檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，嬰幼兒配方食品以及較大嬰兒和幼兒配方食品克羅諾桿菌未檢出，而嬰幼兒谷類輔助食品則檢出率較高。有研究顯示，淀粉成分相比其他配方成分更容易引起克羅諾桿菌的污染[11]，因此，以淀粉原料為主的谷類輔食更容易受到該菌的污染。目前國家標(biāo)準(zhǔn)中對較大嬰兒和幼兒配方食品和嬰幼兒谷類輔助食品中克羅諾桿菌未規(guī)定限量標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合該類產(chǎn)品的食用方法及污染情況，對嬰幼兒的健康會(huì)產(chǎn)生潛在的危害。國外曾有報(bào)道由于該類產(chǎn)品污染克羅諾桿菌引起較大嬰兒發(fā)病的案例[8]，基于此，食品安全監(jiān)管部門應(yīng)考慮將該類產(chǎn)品納入風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測的范圍，保障特殊人群的食用安全。