王子謹(jǐn)，張曉膺

（蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)學(xué)院心胸外科，江蘇 常州 213003）

目前，人類所有癌癥中以肺癌的發(fā)病率最高，2018年全球新增肺癌病例占所有癌癥的11.6%[1]。肺癌也是死亡率最高的癌癥，2018年全球肺癌患者死亡例數(shù)占全部死亡例數(shù)的18.4%[2]。肺癌分為2種組織學(xué)亞型：小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）。NSCLC約占所有肺癌的85%，是最主要的肺癌亞型。深入研究肺癌的發(fā)生、發(fā)展，探尋新的獨(dú)立標(biāo)志物對(duì)肺癌的診療有重大意義。載脂蛋白M（apolipoprotein M，apo M）是1999年被XU等[3]從乳糜微粒中分離并克隆的一種新型載脂蛋白。近年來，有許多研究結(jié)果顯示，載脂蛋白家族參與了多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后[4-6]。為此，apo M對(duì)NSCLC發(fā)生、發(fā)展的影響值得進(jìn)一步研究。另外，基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）家族與肺癌的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移相關(guān)[7]，其中MMP-3、MMP-10、MMP-11在NSCLC中過表達(dá)[8]，且MMP-10已被證明是NSCLC發(fā)生、發(fā)展所必需的[9]。本研究旨在探討apo M對(duì)NSCLC A549細(xì)胞株增殖、遷移、侵襲能力的影響及其與MMP-10的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系和主要試劑

NSCLC A549細(xì)胞系購自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫。Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM）購自美國(guó)康寧公司。胎牛血清購自美國(guó)賽默飛世爾公司 。慢病毒包裝及相關(guān)轉(zhuǎn)染試劑購自上海吉?jiǎng)P基因公司。RNA提取試劑盒（RNAiso Plus Reagent）購自上海申能博彩試劑公司?？偟鞍滋崛≡噭┖?、二喹啉甲酸（bicinchonininc acid，BCA）蛋白定量試劑盒購自上海貝博生物公司。apo M、MMP-10抗體購自英國(guó)abcam公司。CCK-8試劑盒購自日本DojinDo公司。CX43型電子顯微鏡購自日本OLYMPUS公司。DM2500型共聚焦熒光顯微鏡購自德國(guó)Leica 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及慢病毒轉(zhuǎn)染

將A549細(xì)胞置于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。顯微鏡下估計(jì)細(xì)胞密度，當(dāng)細(xì)胞密度為70%時(shí)，胰酶消化后重懸細(xì)胞，原細(xì)胞皿數(shù)∶傳代后細(xì)胞皿數(shù)按1∶5傳代繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)試劑說明書要求進(jìn)行apo M過表達(dá)和空載慢病毒感染。將A549細(xì)胞接種于6孔板中（2×105個(gè)細(xì)胞/mL），細(xì)胞達(dá)到50%融合度后，更換含有慢病毒的細(xì)胞培養(yǎng)基，并加入慢病毒感染增強(qiáng)液[ENI.S和polybrene，即Polybrene（E）]4 μL，以促進(jìn)慢病毒轉(zhuǎn)染。成功感染的細(xì)胞為綠色熒光蛋白陽性，72 h后在熒光顯微鏡下觀察并使用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）評(píng)估apo M過表達(dá)的效率。以轉(zhuǎn)染空慢病毒的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)

采用Trizol試劑提取總RNA，然后采用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA）。 使用SYBR Premix Ex Taq試劑（日本TAKARA公司）進(jìn)行qRT-PCR。循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。檢測(cè)儀器為QuantStudio 6實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)ThermoFisher Scientific公司）。采用2-△△Ct計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。apo M、MMP-10基因及內(nèi)參基因的引物及探針序列見表1。

表1 apo M基因、MMP-10基因及內(nèi)參基因的引物及探針序列

1.4 采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖倍數(shù)

轉(zhuǎn)染成功24 h后收集細(xì)胞，將細(xì)胞分為陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染空慢病毒）及apo M-OE組（轉(zhuǎn)染apo M慢病毒）。根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，用完全培養(yǎng)基將2個(gè)組的細(xì)胞制成4×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。取4塊96孔板，每孔加入100 μL制備好的細(xì)胞懸液，分別于0、24、48、72 h使用CCK-8法檢測(cè)apo M-OE組和陰性對(duì)照組的細(xì)胞增殖倍數(shù)。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將CCK-8溶液按1∶9比例稀釋，以此稀釋液代替待測(cè)孔中的培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～4 h，檢測(cè)450 nm處的吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞增殖倍數(shù)。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染24 h后，在6孔板中接種（2×105個(gè)細(xì)胞/mL）并孵育48 h，細(xì)胞密度達(dá)到70%后，用10 μL加樣槍槍頭在孔板中心軸處劃痕過底板，使用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）快速清洗2遍后，加入含1%血清的培養(yǎng)液，于0、24、48、72和96 h取樣攝片，記錄劃痕間距并計(jì)算閉合速率。

1.6 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染成功24 h后收集細(xì)胞，將細(xì)胞分為陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染空慢病毒）及apo M-OE組（轉(zhuǎn)染apo M慢病毒）。將所有細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后消化，PBS清洗2遍，重懸于含10 g/L牛血清白蛋白的無血清培養(yǎng)基中。Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)在24孔8 mm Transwell板中進(jìn)行，上室加入1×105個(gè)細(xì)胞，無血清培養(yǎng)，下室加入10%血清培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h。甲醇固定，結(jié)晶紫染色，PBS清洗，在DM2500型共聚焦熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

1.7 免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞apo M和MMP-10相對(duì)表達(dá)量

收集陰性對(duì)照組和apo M-OE組細(xì)胞，PBS清洗3次后，使用含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液提取總蛋白，采用BCA法進(jìn)行定量檢測(cè)。100 ℃變性5 min后采用10%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）分離30 mg蛋白質(zhì)樣本。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，采用5%BSA 4 ℃封閉過夜后，依次孵育相應(yīng)的一抗和二抗。最后進(jìn)行顯色并統(tǒng)計(jì)灰度值，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 apo M-OE組與陰性對(duì)照組apo M表達(dá)的比較

apo M-OE組和陰性對(duì)照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況見圖1（a）。與陰性對(duì)照組相比，apo M-OE組apo MmRNA相對(duì)表達(dá)量明顯上調(diào)（P＜0.01），約為陰性對(duì)照組的28倍，見圖1（b）。

圖1 A549細(xì)胞的轉(zhuǎn)染情況及apo M mRNA的表達(dá)水平

2.2 過表達(dá)apo M對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

轉(zhuǎn)染24及48 h后，apo M-OE組細(xì)胞增殖倍數(shù)明顯高于陰性對(duì)照組（P＜0.001）；轉(zhuǎn)染72 h時(shí)，apo M-OE組增殖速率與陰性對(duì)照組一致，推測(cè)為細(xì)胞增殖過多堆疊所致。見圖2。

圖2 過表達(dá)apo M對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

2.3 過表達(dá)apo M對(duì)A549細(xì)胞遷移、侵襲的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組比較，從48 h開始，apo M-OE組A549細(xì)胞空白視野顯著減少，閉合速率顯著加快，即細(xì)胞遷移率更大（P＜0.001）。見圖3。

Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，培養(yǎng)48 h后，apo M-OE組A549細(xì)胞侵襲率顯著高于陰性對(duì)照組（P＜0.001）。見圖3。

圖3 過表達(dá)apo M對(duì)A549細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響

2.4 apo M-OE組和陰性對(duì)照組細(xì)胞中MMP-10的表達(dá)

采用qRT-PCR及免疫印跡法檢測(cè)apo MOE組和陰性對(duì)照組細(xì)胞MMP-10 mRNA及蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，apo M-OE組MMP-10 mRNA及apo M、MMP-10蛋白表達(dá)量顯著高于陰性對(duì)照組（P＜0.05）。見圖4、圖5。

圖4 apo M-OE組和陰性對(duì)照組apo M的表達(dá)

圖5 apo M-OE組和陰性對(duì)照組MMP-10的表達(dá)

3 討論

截止到2015年，在我國(guó)成年男性中，肺癌的年發(fā)病率及年死亡率均居第1位，每年新發(fā)病例為73.3萬，其中男性為48.9萬例；每年約有59.1萬例患者死于肺癌，其中男性為40.2萬例[10]。由此可見，深入研究肺癌的發(fā)生、發(fā)展，探尋新的獨(dú)立標(biāo)志物刻不容緩。

有研究結(jié)果顯示，apo M可能參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[11-12]。JIANG等[11]的研究結(jié)果顯示，肝癌患者血漿apo M水平高于正常對(duì)照組（P＜0.01）。有研究結(jié)果顯示，腸癌組織中apo MmRNA及蛋白水平明顯低于正常組織及良性病變組織（P＜0.05），結(jié)直腸癌組織中apo MmRNA表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[12]。由此可見，apo M與腫瘤的發(fā)展有關(guān)，且在不同腫瘤中表現(xiàn)出促進(jìn)或抑制作用。本研究結(jié)果顯示，apo M過表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力均表現(xiàn)出促進(jìn)作用，這提示apo M可能通過某些復(fù)雜機(jī)制促進(jìn)NSCLC的發(fā)展。

MMP與腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)。有研究結(jié)果顯示，MMP-10在NSCLC和經(jīng)Kras轉(zhuǎn)化的BASC肺癌起始細(xì)胞中過表達(dá)[13]。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MMP-10是NSCLC轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)及侵襲所必需的[8]。MMP-10在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中也表現(xiàn)出同樣重要的作用[13]。

ZHANG等[14]的研究結(jié)果顯示，與正常組織比較，肺癌組織MMP-10 mRNA水平顯著降低（P＜0.05），MMP-10蛋白水平顯著升高（P＜0.01）。ZHU等[15]的研究結(jié)果顯示，肺癌組織中apo MmRNA及蛋白水平均顯著高于正常組織，apo M可促進(jìn)A549細(xì)胞的增殖和侵襲，其機(jī)制為apo M通過上調(diào)鞘氨醇-1-磷酸受體-1（sphingosine-1-phosphate receptor-1，S1P1）并激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK1/2）和磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositide-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱Akt）通路來參與NSCLC的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)。PI3K/Akt通路可調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子，并參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[16]。另外，apo M還可通過與1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate，S1P）結(jié)合等作用參與動(dòng)脈粥樣硬化和炎癥刺激等[17]，且MMP-10也與此相關(guān)[18]。提示apo M與MMP-10可能存在某種聯(lián)系。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)apo M的A549細(xì)胞中MMP-10 mRNA和蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。這提示在A549細(xì)胞中，apo M與MMP-10存在聯(lián)系，并有可能存在復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制。

ZHANG等[19]的研究結(jié)果顯示，IL-6可通過人肺腺癌細(xì)胞系中兩面神激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子-3（signal transducer and activator of transcription，STAT3）信號(hào)通路調(diào)節(jié)MMP-10的表達(dá)。還有研究結(jié)果顯示，apo M的表達(dá)受激素水平、炎性因子及生長(zhǎng)因子等諸多因素的調(diào)節(jié)[20-21]，其與IL-6呈負(fù)性調(diào)節(jié)關(guān)系。本研究分別對(duì)轉(zhuǎn)染apo M慢病毒的A549細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空慢病毒的A549細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，過表達(dá)apo M可促進(jìn)A549細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，還可上調(diào)MMP-10的表達(dá)。但apo M在NSCLC中的作用機(jī)制及通路尚待進(jìn)一步研究。除了本研究進(jìn)行的apo M過表達(dá)研究外，干擾A549細(xì)胞中的apo M表達(dá)是否會(huì)產(chǎn)生影響，apo M對(duì)除A549外的其他肺癌細(xì)胞系是否具有相似作用，均是下一步研究的目標(biāo)。另外，后續(xù)將對(duì)apo M與MMP-10相互作用的信號(hào)通路進(jìn)行研究，包括在過表達(dá)apo M的A549細(xì)胞中使用MMP-10阻滯劑，觀察其細(xì)胞功能學(xué)改變以及擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用多種處理因素觀察結(jié)果等。

綜上所述，apo M過表達(dá)可促進(jìn)A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并上調(diào)A549細(xì)胞中MMP-10的表達(dá)。