王燕云 張棟彥 耿園園 吳鵬程

葡萄膜炎是一種眼內(nèi)炎癥性疾病，葡萄膜炎患者占全世界失明人數(shù)的10%～25%。它主要影響葡萄膜，但也可能涉及鄰近的結(jié)構(gòu)，如視網(wǎng)膜和玻璃體。盡管自身免疫性疾病和感染是主要病因，但確切的發(fā)病機(jī)制仍未完全清楚[1]。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，可在動(dòng)物玻璃體內(nèi)產(chǎn)生急性炎癥反應(yīng)。LPS可誘導(dǎo)促炎因子的釋放，包括一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和單核細(xì)胞趨化蛋白-1等[2]。LPS的炎癥反應(yīng)也可引起氧化應(yīng)激[3]。血管生成素(angiogenin,ANG)又稱核糖核酸酶5，含有123個(gè)氨基酸，是淚液的天然成分。有研究指出，ANG與先天免疫及殺菌作用相關(guān)[4]。最近，有研究報(bào)道ANG在眼表具有抗炎作用[5]。因此，本研究旨在評(píng)估ANG 在LPS誘導(dǎo)的小鼠急性葡萄膜炎模型中的抗炎作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器手術(shù)顯微鏡(德國(guó)蔡司公司)；裂隙燈數(shù)碼圖像處理系統(tǒng)(美國(guó)晴樂公司)；分光光度計(jì)(北京世紀(jì)科信科學(xué)儀器有限公司)；ANG(上海賽默選擇生物發(fā)展有限公司)；LPS(美國(guó)Sigma公司)；NO、TNF-α、IL-6、總氧化狀態(tài)(total oxidant status,TOS)和總抗氧化狀態(tài)(total oxidant status,TAS)ELISA試劑盒(上海內(nèi)含子生物科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組雄性BALB/c小鼠(體質(zhì)量22～28 g)，購(gòu)于蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。室溫下自由飲食和飲水。將BALB/c小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、模型組和ANG組，每組各10只。ANG組小鼠給予ANG滴眼液(ANG溶于生理鹽水，100 mg·L-1·d-1)，對(duì)照組和模型組均給予等體積生理鹽水。連續(xù)給藥3 d后，模型組和ANG組小鼠在玻璃體內(nèi)注射125 mg·L-1的LPS 2 μL建立急性葡萄膜炎模型。LPS給藥24 h后，各組小鼠分別在顯微鏡下用30號(hào)針頭前房穿刺，收集雙眼房水(15～25 μL)。其中一眼在室溫下用40 g·L-1多聚甲醛液固定進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)價(jià)，另一眼在-80 ℃下保存進(jìn)行生物化學(xué)分析。

1.3 裂隙燈觀察及評(píng)分造模 24 h 后，對(duì)各組小鼠采用裂隙燈顯微鏡觀察炎癥反應(yīng)，拍照并記錄臨床體征。臨床分級(jí)如下：0級(jí)定義為沒有明顯的炎癥反應(yīng)；1級(jí)為虹膜血管輕度擴(kuò)張；2級(jí)為虹膜血管中度擴(kuò)張，伴輕度前房閃輝；3級(jí)為虹膜血管顯著擴(kuò)張伴重度前房閃輝；4級(jí)為3級(jí)的臨床表現(xiàn)伴纖維性滲出。

1.4 生物化學(xué)檢測(cè)將房水樣本懸浮在等量的Turk染色液中，并在光學(xué)顯微鏡下用血細(xì)胞儀進(jìn)行浸潤(rùn)細(xì)胞檢測(cè)。細(xì)胞數(shù)量是從每個(gè)樣本中隨機(jī)選擇4個(gè)視野的平均計(jì)數(shù)。用Lowry法測(cè)定微蛋白水平。用ELISA試劑盒測(cè)定NO、TNF-α和IL-6的濃度。

1.5 房水和眼組織氧化應(yīng)激標(biāo)志物分析造模 24 h 后，每組隨機(jī)麻醉并處死 5只小鼠，立即取出雙眼眼球，其中一眼用于測(cè)量氧化應(yīng)激標(biāo)志物。由于晶狀體中有高濃度谷胱甘肽，所以從摘除的眼球中移除。測(cè)量眼部虹膜組織的質(zhì)量，將其分解成小的碎片，放入空的玻璃管中，然后每克組織加入140 mmol·L-1KCL溶液1 mL，混合均勻，離心(12 000 r·min-1)10 min。采用相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒在上清液和眼部組織樣本中測(cè)量TOS、TAS，并計(jì)算氧化應(yīng)激指數(shù)(oxidant stress index,OSI)。

1.6 病理學(xué)檢查將取出的另一眼球固定于40 g·L-1多聚甲醛液中過夜。然后進(jìn)行蔗糖梯度脫水包埋，制作眼球石蠟組織切片，厚度為 4 μm，進(jìn)行 HE 染色。病理分級(jí)如下：0級(jí)為正常組織；1級(jí)為虹膜血管擴(kuò)張、虹膜基質(zhì)增厚、滲出物、蛋白和(或)前房散在少量炎癥細(xì)胞；2級(jí)為炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)到虹膜和(或)睫狀體基質(zhì)，前房有中等數(shù)量炎癥細(xì)胞；3級(jí)為虹膜基質(zhì)、睫狀體和前房?jī)?nèi)炎癥細(xì)胞大量浸潤(rùn)；4級(jí)為細(xì)胞大量滲出，前房蛋白密集聚集，角膜內(nèi)皮炎癥細(xì)胞沉積[6]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析,然后進(jìn)行Tukey多重比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠眼內(nèi)炎癥臨床評(píng)分對(duì)照組未觀察到炎癥反應(yīng)，模型組顯示炎癥反應(yīng)包括充血和水腫，伴有瞳孔縮小，ANG組可抑制炎癥反應(yīng)(見圖1)。與對(duì)照組臨床評(píng)分(0分)比較， 模型組注射LPS后24 h臨床評(píng)分[(3.5±0.5)分]顯著增高(P<0.05)。而ANG組[(2.3±0.3)分]較模型組降低(P<0.05)。

圖1 注射LPS后24 h裂隙燈顯微鏡下觀察各組炎癥情況

2.2 各組小鼠房水浸潤(rùn)細(xì)胞數(shù)和蛋白濃度與對(duì)照組相比，模型組小鼠LPS注射24 h后房水浸潤(rùn)細(xì)胞數(shù)增加(P<0.05)。與模型組相比，ANG組小鼠細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)。與對(duì)照組相比，模型組小鼠房水蛋白濃度升高(P<0.05)。與模型組相比，ANG組蛋白濃度降低(P<0.05)(見表1)。

表1 3組小鼠房水浸潤(rùn)細(xì)胞數(shù)和蛋白濃度比較(n=5)

2.3 各組小鼠房水中炎癥細(xì)胞因子模型組小鼠房水中NO、TNF-α和IL-6濃度均明顯高于對(duì)照組(均為P<0.05)(見表2)。而ANG組小鼠房水中NO、TNF-α和IL-6濃度均較模型組顯著降低(均為P<0.05)。

表2 3組小鼠房水中炎癥細(xì)胞因子比較(n=5)

2.4 各組小鼠房水及眼組織OSI模型組小鼠房水及眼組織OSI均高于對(duì)照組(均為P<0.05)，而ANG組小鼠房水及眼組織OSI均較模型組降低(均為P<0.05)(見表3)。

表3 3組小鼠房水及眼組織OSI比較(n=5)

2.5 各組小鼠眼內(nèi)炎癥組織病理學(xué)評(píng)分對(duì)照組小鼠眼組織切片未見浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞，模型組大量炎癥細(xì)胞(黑箭頭)浸潤(rùn)葡萄膜組織，ANG組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少(見圖2)。與對(duì)照組組織病理學(xué)評(píng)分(0分)比較，模型組組織病理學(xué)評(píng)分[(2.0±0.2)分]顯著增高(P<0.05)。而ANG組組織病理學(xué)評(píng)分[(0.8±0.1)分]較模型組降低(P<0.05)。

圖2 注射LPS后24 h 各組HE染色(×200) 黑箭頭示炎癥細(xì)胞

3 討論

以往研究證實(shí)，ANG在血管生成、細(xì)胞增殖、遷移和分化中起重要作用[7]。盡管近年來(lái)的研究多關(guān)注ANG在癌癥治療方面的潛力，但ANG也以其抗菌活性與多種炎癥疾病和先天性免疫有關(guān)[8]。至今，還沒有證據(jù)來(lái)闡明ANG與炎癥的關(guān)系。以往研究證實(shí)，ANG通過降低TNF-α和NF-κB核轉(zhuǎn)運(yùn)在角膜成纖維細(xì)胞中具有抗炎作用[5]。葡萄膜炎是一種炎癥性眼內(nèi)疾病，主要損傷葡萄膜。由于自身免疫性葡萄膜炎的形成和發(fā)展的病因尚未完全清楚，目前尚無(wú)明確的治療方法。目前臨床上主要治療藥物是皮質(zhì)類固醇，但類固醇可能導(dǎo)致嚴(yán)重并發(fā)癥，如青光眼和白內(nèi)障[9]。因此，為了減少皮質(zhì)類固醇引起的并發(fā)癥，需要尋找新的抗炎化合物，評(píng)估葡萄膜炎的非類固醇治療策略已成為熱點(diǎn)。LPS通過激活TNF-α、IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白-1和NO等炎癥細(xì)胞因子表達(dá)和釋放，刺激炎癥反應(yīng)[10]。除了LPS直接激活炎癥細(xì)胞因子外，由此產(chǎn)生的氧化應(yīng)激還可以調(diào)節(jié)炎癥信號(hào)[11]。此外，NO會(huì)加劇氧化損傷。因此，我們假設(shè)ANG可能抑制葡萄膜炎，本研究首次證明了ANG在小鼠急性葡萄膜炎模型中具有顯著的抗炎作用。房水細(xì)胞計(jì)數(shù)和蛋白濃度是急性葡萄膜炎模型血-房水屏障完整性的有用指標(biāo)，LPS可使兩者升高。與以往的葡萄膜炎研究[2]一致，LPS誘導(dǎo)的急性葡萄膜炎小鼠房水中NO、TNF-α和IL-6濃度升高，ANG組這3種炎癥因子的水平降低了。與抑制炎癥因子一致，ANG也顯著改善了急性葡萄膜炎模型的臨床嚴(yán)重程度和組織病理學(xué)征象。ANG組房水和眼組織的OSI也降低了，但這種效果在房水中表現(xiàn)更顯著，可能是由于眼組織接觸受限。鑒于氧化應(yīng)激有助于LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，氧化應(yīng)激減少可能解釋急性葡萄膜炎模型炎癥的臨床和組織病理學(xué)癥狀改善。ANG對(duì)LPS刺激的抗炎作用依賴于抑制NO和IL-6產(chǎn)生，以及抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄活性及其下游途徑[12]。本研究與這些研究結(jié)果一致，證實(shí)ANG的抗炎活性是通過抑制TNF-α、NO和IL-6的產(chǎn)生來(lái)介導(dǎo)的，從而減輕葡萄膜炎癥。

綜上所述，本研究首次證明，ANG預(yù)處理可以緩解LPS誘導(dǎo)的小鼠急性葡萄膜炎模型的炎癥和氧化應(yīng)激。因此，ANG可能有助于葡萄膜炎的治療，同時(shí)消除類固醇治療的不良影響。