蔡蓮君 李歡 徐麗琿 郭玉 蘆曉紅 羅明秀 張茜 姚青

糖尿病性白內(nèi)障是患病人數(shù)逐年增多的糖尿病并發(fā)癥之一[1]，是導(dǎo)致糖尿病患者視力下降甚至失明的重要原因[2]。由于糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且研究進(jìn)展緩慢，臨床上缺乏有效的治療藥物，目前主要靠手術(shù)置換人工晶狀體的方式治療，但有些術(shù)后并發(fā)癥又會(huì)對(duì)患者視力造成新的損傷。糖尿病性白內(nèi)障發(fā)生的病理學(xué)基礎(chǔ)為高濃度葡萄糖造成晶狀體上皮細(xì)胞的損傷,且體外研究顯示高糖可以導(dǎo)致晶狀體上皮細(xì)胞損傷[3]。因此，維持晶狀體上皮細(xì)胞的正常功能對(duì)維持正常視功能極其重要。沉默信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白6(silent information regulator 6，SIRT6)是哺乳動(dòng)物中Sirtuins(SIRT1-SIRT7)蛋白家族的成員之一[4]，主要定位在細(xì)胞核[5]，具有依賴(lài)煙堿胺腺嘌呤二核苷酸的去乙?；负虯DP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性，可參與調(diào)節(jié)多條信號(hào)通路[6]。SIRT6蛋白可通過(guò)組蛋白去乙?；饔谜{(diào)控某些基因表達(dá)及DNA修復(fù)[7]，還可以通過(guò)核糖基化修飾作用提高DNA雙鏈斷裂后的核酸修復(fù)功能[8]，維持基因組穩(wěn)定，尤其在各種衰老相關(guān)性疾病，如神經(jīng)退行性疾病、糖尿病、腫瘤、炎癥等疾病的發(fā)生、發(fā)展中具有正向調(diào)節(jié)作用[9]。但是在糖尿病性白內(nèi)障中，人晶狀體上皮細(xì)胞中SIRT6蛋白的表達(dá)變化及作用機(jī)制目前還未完全清楚。本研究旨在以高糖干預(yù)人源晶狀體上皮細(xì)胞為模型，探討糖尿病性白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞中SIRT6蛋白表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株和主要試劑人源晶狀體上皮細(xì)胞永生系SRA01/04(北京協(xié)和細(xì)胞中心)，DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)，胎牛血清(以色列BI公司)，2.5 g·L-1胰蛋白酶(美國(guó)Hyclone公司)，蛋白含量檢測(cè)試劑盒及蛋白提取試劑盒(中國(guó)凱基生物技術(shù)股份有限公司)，SIRT6多克隆抗體(Affinity,DF12739，美國(guó))、β-actin多克隆抗體(Biossion,bs-0061R，中國(guó))、 LC3多克隆抗體(Proteintech,14600，美國(guó))、Beclin1單克隆抗體(Proteintech,66665，美國(guó))、ATG5多克隆抗體(Proteintech,60061，美國(guó))、ATG12多克隆抗體(Proteintech,11122，美國(guó))、Bcl-2多克隆抗體(Proteintech,12789，美國(guó))、 Bax多克隆抗體(Proteintech,50599，美國(guó))。

1.2 SRA01/04細(xì)胞的培養(yǎng)從液氮罐的凍存盒中取出SRA01/04的凍存管后，迅速進(jìn)行復(fù)蘇，接種于預(yù)先準(zhǔn)備好的含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，放入含體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h后換液，待細(xì)胞長(zhǎng)至瓶底80%后用2.5 g·L-1胰蛋白酶進(jìn)行消化，以14進(jìn)行傳代。

1.3 不同濃度葡萄糖對(duì)細(xì)胞活性的影響常規(guī)培養(yǎng)SRA01/04后以 10×103mL-1接種于 96 孔板中，常規(guī)培養(yǎng)貼壁固定24 h后，棄去常規(guī)培養(yǎng)基，PBS洗3遍后，分別加入含5.5 mmol·L-1、15.5 mmol·L-1、25.5 mmol·L-1、35.5 mmol·L-1、45.5 mmol·L-1、55.5 mmol·L-1、75.5 mmol·L-1葡萄糖的DMEM 培養(yǎng)液，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，干預(yù)48 h后每孔加入 10 μL CCK-8試劑，37 ℃培養(yǎng)箱孵育2 h后，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔光密度(D)值，每組取4個(gè)復(fù)孔的平均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 不同濃度葡萄糖對(duì)SRA01/04細(xì)胞SIRT6蛋白表達(dá)的影響常規(guī)培養(yǎng)SRA01/04細(xì)胞貼壁固定24 h后，分別加入含5.5 mmol·L-1、15.5 mmol·L-1、25.5 mmol·L-1、35.5 mmol·L-1、45.5 mmol·L-1、55.5 mmol·L-1、75.5 mmol·L-1葡萄糖的DMEM 培養(yǎng)液干預(yù)各組細(xì)胞48 h，用顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)變化并拍照記錄。收集各組細(xì)胞，按凱基全蛋白提取試劑盒說(shuō)明提取全蛋白，蛋白定量好后，將各組樣品進(jìn)行100 g·L-1SDS-PAGE電泳,280 mA電流濕轉(zhuǎn)45 min,100 g·L-1脫脂奶粉室溫封閉4 h,TBST洗膜3次后孵育一抗：兔抗SIRT6抗體( 11000 稀釋)、兔抗β-actin抗體(17000稀釋),4 ℃孵育過(guò)夜，二抗孵育1.5 h，用Image Lab凝膠成像圖像分析系統(tǒng)顯色并采集圖像分析灰度值。

1.5 高糖干預(yù)晶狀體上皮細(xì)胞不同時(shí)間后SIRT6蛋白表達(dá)常規(guī)培養(yǎng)SRA01/04細(xì)胞貼壁固定24 h后，用含55.5 mmol·L-1葡萄糖的培養(yǎng)基分別干預(yù)SRA01/04細(xì)胞0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h后收集細(xì)胞，按上述方法提取蛋白、蛋白定量以及Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞SIRT6蛋白和β-actin的表達(dá)。

1.6 免疫熒光檢測(cè)高糖對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞SIRT6蛋白定位和表達(dá)的影響將放有爬片的6孔板加入含100×103個(gè)SRA01/04細(xì)胞的培養(yǎng)基，貼壁固定24 h后將細(xì)胞隨機(jī)分為：對(duì)照組：含5.5 mmol·L-1葡萄糖的培養(yǎng)基干預(yù)培養(yǎng)；高糖組：含55.5 mmol·L-1葡萄糖培養(yǎng)基干預(yù)培養(yǎng)48 h后取出細(xì)胞爬片，用多聚甲醛室溫固定30 min，Triton-100破膜20 min，封閉30 min，SIRT6多克隆抗體(1100稀釋)一抗 4 ℃ 孵育過(guò)夜，二抗孵育1.5 h，DAPI染核封片并避光5 min后在熒光顯微鏡下觀(guān)察并拍照記錄。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。兩組間比較采用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 高糖對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞活性的影響將SRA01/04細(xì)胞用不同濃度葡萄糖干預(yù)后，隨著葡萄糖濃度的增加，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力結(jié)果顯示，隨著葡萄糖濃度的增加，SRA01/04細(xì)胞的增殖活性逐漸降低，與5.5 mmol·L-1葡萄糖組比較，15.5 mmol·L-1葡萄糖組、25.5 mmol·L-1葡萄糖組及35.5 mmol·L-1葡萄糖組與其細(xì)胞活性的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)見(jiàn)圖1)；45.5 mmol·L-1葡萄糖組、55.5 mmol·L-1葡萄糖組及75.5 mmol·L-1葡萄糖組與其細(xì)胞活性的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05，見(jiàn)圖1),提示高濃度葡萄糖可以降低SRA01/04細(xì)胞的增殖活性。

圖1 不同濃度葡萄糖干預(yù)48 h后晶狀體上皮細(xì)胞(SRA01/04)的增殖活性(×200) A：5.5 mmol·L-1葡萄糖；B：55.5 mmol·L-1葡萄糖；C：75.5 mmol·L-1葡萄糖；D：SRA01/04在不同濃度葡萄糖中的增殖活性

2.2 不同濃度葡萄糖對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞SIRT6蛋白表達(dá)的影響Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，隨著葡萄糖濃度的增加，SRA01/04細(xì)胞中SIRT6蛋白表達(dá)量逐漸下降，且呈劑量依賴(lài)性，與 5.5 mmol·L-1葡萄糖組SRA01/04細(xì)胞中SIRT6蛋白的表達(dá)量比較，15.5 mmol·L-1葡萄糖組、25.5 mmol·L-1葡萄糖組及35.5 mmol·L-1葡萄糖組與其差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)；45.5 mmol·L-1葡萄糖組、55.5 mmol·L-1葡萄糖組及75.5 mmol·L-1葡萄糖組與其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)(見(jiàn)圖2)，結(jié)合上述CCK-8檢查結(jié)果表明，55.5 mmol·L-1葡萄糖組使SRA01/04細(xì)胞中SIRT6蛋白表達(dá)下降有顯著差異，同時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞損傷達(dá)到后期可進(jìn)行干預(yù)的程度，所以確定后期高糖干預(yù)的有效合適濃度為55.5 mmol·L-1。

圖2 不同濃度葡萄糖對(duì)SRA01/04細(xì)胞SIRT6蛋白表達(dá)的影響 與5.5 mmol·L-1葡萄糖組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.3 高糖干預(yù)不同時(shí)間對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞SIRT6蛋白表達(dá)的影響將SRA01/04細(xì)胞隨機(jī)分為6組，用含55.5 mmol·L-1葡萄糖的培養(yǎng)基分別干預(yù)0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h后，Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，在同樣的高濃度葡萄糖干預(yù)下，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，SRA01/04細(xì)胞中SIRT6蛋白的表達(dá)量逐漸下降，呈時(shí)間依賴(lài)性，與0 h組SIRT6蛋白表達(dá)量比較，6 h組和12 h組與其差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)；24 h組、48 h組及72 h組與其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)(見(jiàn)圖3)。提示高糖干預(yù)時(shí)間越久，SRA01/04細(xì)胞中SIRT6蛋白表達(dá)量越低，因?yàn)楦咛歉深A(yù)SRA01/04細(xì)胞48 h后，SIRT6蛋白的下降有顯著差異，所以把48 h作為后期的高糖干預(yù)時(shí)間。

圖3 高糖干預(yù)不同時(shí)間對(duì)SRA01/04細(xì)胞SIRT6蛋白表達(dá)的影響 與0 h組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.4 高糖對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞SIRT6蛋白定位和表達(dá)的影響免疫熒光結(jié)果顯示，SIRT6蛋白主要在細(xì)胞核表達(dá)(見(jiàn)圖4)，相比對(duì)照組，高糖組細(xì)胞SIRT6蛋白表達(dá)量明顯下降，且高糖組細(xì)胞出現(xiàn)明顯的核固縮、核碎裂現(xiàn)象。

圖4 對(duì)照組和高糖組SRA01/04細(xì)胞中SIRT6蛋白定位和表達(dá)情況(×200)

3 討論

隨著人們生活水平的提高，糖尿病性白內(nèi)障患者的人數(shù)隨著糖尿病患者的人數(shù)增多而逐年增加[2]。糖尿病性白內(nèi)障是導(dǎo)致糖尿病患者視力逐漸降低的主要原因之一，從一開(kāi)始的視力模糊影響患者閱讀、開(kāi)車(chē)等，到后期的視力完全喪失，視力的缺陷嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量及身心健康[10-11]。雖然超聲乳化、飛秒激光等人工置換晶狀體手術(shù)有明顯治療效果，但術(shù)后并發(fā)癥，如玻璃體混濁、眼底出血等又會(huì)對(duì)患者視力造成新的損傷。既往研究表明，糖尿病性白內(nèi)障患者晶狀體摘出術(shù)后的并發(fā)癥高于普通白內(nèi)障手術(shù)患者[12]。由于糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，雖然近年來(lái)研究者提出了多元醇途徑、糖基化學(xué)說(shuō)，并以此開(kāi)發(fā)出了糖基化抑制劑、醛糖還原酶抑制劑等西藥以及水蛭素、丁基苯酞、黃酮類(lèi)化合物等中成藥，但因其療效差、毒副作用大，而且多數(shù)實(shí)驗(yàn)還停留在動(dòng)物模型階段而未能投入臨床應(yīng)用[13-14]。

人類(lèi)長(zhǎng)壽蛋白SIRT6 基因位于SSC19，長(zhǎng)39.1 kb，含8個(gè)外顯子，主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，在肝臟、腎臟等多種組織細(xì)胞中高度表達(dá)[15]。既往研究發(fā)現(xiàn)SIRT6蛋白具有多種生物學(xué)功能：調(diào)控某些基因表達(dá)，對(duì)損傷后的核酸進(jìn)行修復(fù)，維持基因組穩(wěn)定，維持體內(nèi)葡萄糖的穩(wěn)態(tài)，延長(zhǎng)機(jī)體壽命[8，16-19]。有研究發(fā)現(xiàn)[16]，分別敲除小鼠的SIRT1-SIRT7基因后，只有SIRT6基因缺陷的小鼠出現(xiàn)明顯的衰老表現(xiàn)。Liu等[8]發(fā)現(xiàn)，在糖尿病腎病小鼠體內(nèi)，腎臟足細(xì)胞中的SIRT6蛋白表達(dá)明顯下降，體外高糖或糖基化終末產(chǎn)物干預(yù)后，足細(xì)胞中SIRT6蛋白的表達(dá)也會(huì)明顯下降,SIRT6蛋白還能夠通過(guò)抗炎、抗凋亡調(diào)控足細(xì)胞自噬進(jìn)而對(duì)足細(xì)胞起保護(hù)作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，和正常組相比，高糖組細(xì)胞凋亡率明顯上升，且高糖組細(xì)胞中SIRT1蛋白表達(dá)明顯下降[20]。SIRT1蛋白是SIRT6蛋白的同源蛋白，且相關(guān)研究已證實(shí)SIRT1蛋白對(duì)SIRT6蛋白具有正向調(diào)節(jié)作用[21]。

本研究結(jié)果表明，在高糖干預(yù)下，晶狀體上皮細(xì)胞的增殖活性明顯下降；在不同濃度葡萄糖干預(yù)下，SIRT6蛋白的表達(dá)隨著葡萄糖濃度的增加而逐漸下降，我們確定了合適的高糖干預(yù)濃度為55.5 mmol·L-1；在同一高糖濃度干預(yù)不同時(shí)間后，SIRT6蛋白的表達(dá)隨著高糖干預(yù)的時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低，我們確定了合適的高糖干預(yù)時(shí)間為48 h；高濃度葡萄糖使晶狀體上皮細(xì)胞的細(xì)胞核出現(xiàn)明顯核固縮、核碎裂現(xiàn)象，且與5.5 mmol·L-1葡萄糖組比較晶狀體上皮細(xì)胞SIRT6蛋白的表達(dá)下調(diào)。

綜上所述，高糖會(huì)導(dǎo)致人源晶狀體上皮細(xì)胞損傷、增殖活性下降且凋亡明顯，同時(shí)會(huì)降低SIRT6蛋白的表達(dá)，而SIRT6蛋白可以維持體內(nèi)葡萄糖穩(wěn)態(tài)，SIRT6蛋白可能是糖尿病性白內(nèi)障導(dǎo)致晶狀體上皮細(xì)胞損傷的關(guān)鍵靶基因之一。但其確切的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。