馮綺婷 梁瑜欽 黃雄飛 張躍紅

老年性黃斑變性(senile macular degeneration，SMD)是一種累及黃斑的神經(jīng)退行性疾病，是工業(yè)化國家50歲以上人群不可逆性盲的首要原因[1-2]。隨著中國人口老齡化加劇，SMD的發(fā)病率逐年增高。然而，到目前為止，人們對SMD的發(fā)病機(jī)制仍未完全明確，也缺乏有效的干預(yù)手段。

視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細(xì)胞功能紊亂、退化和死亡是造成視網(wǎng)膜受損和SMD發(fā)病的病理學(xué)基礎(chǔ)。RPE細(xì)胞是血-視網(wǎng)膜外屏障的重要組成部分，承擔(dān)著視網(wǎng)膜代謝物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、光感受器外節(jié)段降解以及保護(hù)視網(wǎng)膜免受光損害等重要作用[3]。由于RPE細(xì)胞需要高氧耗才能維持正常生理功能，因此，RPE細(xì)胞能產(chǎn)生大量的氧自由基。隨著年齡增長，人體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)功能下降，體內(nèi)氧自由基不能被及時清除，容易引起氧化應(yīng)激反應(yīng)。研究證明,RPE細(xì)胞的氧化損傷參與了SMD的發(fā)病過程[4-6]。在氧化應(yīng)激源攻擊后，RPE細(xì)胞出現(xiàn)線粒體功能障礙、變性甚至死亡，繼而導(dǎo)致黃斑區(qū)RPE細(xì)胞萎縮及功能改變，造成難以挽回的視力損害[7-8]。

細(xì)胞在氧化應(yīng)激應(yīng)答時，一方面，通過啟動抗氧化防御系統(tǒng)糾正失衡的氧化還原狀態(tài)[9]；另一方面，利用自我保護(hù)機(jī)制從而減緩自身損害[10]。目前，關(guān)于后者的研究較少。有文獻(xiàn)指出，P-糖蛋白是細(xì)胞自我保護(hù)機(jī)制中一個重要分子[11-12]。P-糖蛋白由多重耐藥基因編碼的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白組成，在生理條件下表達(dá)于正常的排泄器官和組織屏障，協(xié)助組織排出代謝廢物。在血-腦屏障中，已證明P-糖蛋白的高表達(dá)是氧化應(yīng)激損傷中神經(jīng)自我保護(hù)的一種表現(xiàn)[13]。本研究我們使用人RPE細(xì)胞株D407細(xì)胞模擬血-視網(wǎng)膜外屏障，利用H2O2作為氧化應(yīng)激源刺激細(xì)胞建立SMD模型，觀察細(xì)胞中P-糖蛋白的功能性表達(dá)變化以及對細(xì)胞氧化損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清和胰蛋白酶(美國Gibco BRL公司)，H2O2、羅丹明123和ATP檢測試劑盒(上海Sigma-Aldrich公司)，P-糖蛋白抗體(上海Abcam公司)，GAPDH抗體(美國Santa Cruz Biotechnology公司)，P-糖蛋白抑制劑Tariquidar(上海Selleckchem公司)，Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒(美國Bender MedSystems公司)，Accuri C6流式細(xì)胞儀(美國BD Bioscience公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組取人RPE細(xì)胞株D407細(xì)胞(購買于中山大學(xué)動物實驗中心)，放入體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)。先將細(xì)胞按H2O2濃度梯度進(jìn)行處理(0 μmol·L-1、50 μmol·L-1、100 μmol·L-1、200 μmol·L-1、400 μmol·L-1和800 μmol·L-1)，使用免疫印跡實驗和羅丹明123蓄積實驗確定H2O2對P-糖蛋白表達(dá)的最佳誘導(dǎo)濃度。將細(xì)胞隨機(jī)分為3組：對照組、H2O2模型組、H2O2+ P-糖蛋白抑制劑組(H2O2+ Tariquidar)用于后續(xù)實驗。

1.3 免疫印跡實驗收集各組細(xì)胞樣本，加入含蛋白酶抑制劑的裂解液后，離心提取總蛋白。測定蛋白濃度，用SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜并用脫脂牛奶封閉1 h后分別用抗P-糖蛋白抗體和GAPDH抗體于4 ℃孵育過夜。洗膜并加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，在室溫下孵育1 h。采用Bio-Rad公司的膠片凝膠成像。

1.4 羅丹明123蓄積實驗通過測量細(xì)胞內(nèi)P-糖蛋白熒光性底物羅丹明123蓄積量檢測P-糖蛋白功能活性。當(dāng)P-糖蛋白功能增強(qiáng)時，細(xì)胞內(nèi)羅丹明123外排增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蓄積量減少，表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度降低；反之，當(dāng)P-糖蛋白功能受抑制，則表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度增加。在利用H2O2刺激D407細(xì)胞前，預(yù)先使用1 μmol·L-1P-糖蛋白抑制劑Tariquidar處理細(xì)胞1 h。使用胰蛋白酶收集細(xì)胞，經(jīng)PBS清洗后置入500 nmol·L-1羅丹明123在常溫下避光孵育1 h。用BD Accuri C6流式細(xì)胞儀檢測并分析細(xì)胞內(nèi)羅丹明123熒光強(qiáng)度，通過平均熒光強(qiáng)度衡量羅丹明123蓄積量。

1.5 ATP水平檢測使用ATP測定法檢測細(xì)胞內(nèi)ATP水平。將400 μmol·L-1H2O2與生長在96孔板的D407細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)或與1 μmol·L-1P-糖蛋白抑制劑Tariquidar共同培養(yǎng)24 h 后，用50 μL ATP釋放試劑滲透細(xì)胞膜并與含有熒光素-熒光素酶的混合試劑在室溫下共同反應(yīng)10 min。通過ATP熒光檢測儀測定發(fā)光量。

1.6 Annexin V-FITC凋亡檢測實驗通過Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒檢測細(xì)胞凋亡率。將細(xì)胞以每孔106個細(xì)胞的密度接種在6孔板中。然后收集細(xì)胞用PBS重懸并離心5 min。將細(xì)胞重懸于含有5 μL Annexin V-FITC的195 μL的結(jié)合緩沖液中，并在室溫下避光孵育10 min。離心5 min后，棄上清液并用190 μL結(jié)合緩沖液和10 μL碘化丙啶(PI)在黑暗中對細(xì)胞染色。然后立即用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞。綠色熒光表示Annexin V-FITC 陽性，而紅色熒光表示PI陽性。左下象限中的細(xì)胞(Annexin V-FITC陰性/PI陰性)表示正常活細(xì)胞；細(xì)胞在左上象限(Annexin V-FITC陰性/PI陽性)屬于允許的檢測誤差；在右上象限(Annexin V-FITC陽性/PI陽性)代表晚期凋亡和壞死細(xì)胞；在右下象限(Annexin V-FITC陽性/PI陰性)代表早期凋亡細(xì)胞。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 16.0軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用方差分析或組間兩兩比較進(jìn)行檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗。檢驗水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 H2O2對人RPE細(xì)胞P-糖蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用免疫印跡實驗結(jié)果顯示，隨著H2O2濃度的增加，P-糖蛋白相對表達(dá)量呈劑量依賴性增加并在400 μmol·L-1時達(dá)到最高值，0 μmol·L-1、50 μmol·L-1、100 μmol·L-1、200 μmol·L-1、400 μmol·L-1和800 μmol·L-1H2O2處理細(xì)胞后P-糖蛋白相對表達(dá)量分別為0.39±0.02、0.77±0.05、1.38±0.20、1.70±0.14、2.71±0.19和1.45±0.12。與0 μmol·L-1H2O2相比，200 μmol·L-1、400 μmol·L-1和800 μmol·L-1H2O2處理細(xì)胞后P-糖蛋白的表達(dá)均明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.01)(見圖1)。

圖1 免疫印跡實驗檢測不同濃度H2O2處理后RPE細(xì)胞P-糖蛋白表達(dá)情況 以GAPDH為內(nèi)參，當(dāng)H2O2濃度為200 μmol·L-1時，P-糖蛋白表達(dá)開始增加，并于400 μmol·L-1達(dá)到峰值

2.2 H2O2增加人RPE細(xì)胞P-糖蛋白功能活性檢測細(xì)胞內(nèi)羅丹明123熒光強(qiáng)度可以了解P-糖蛋白的功能活性。結(jié)果顯示，與0 μmol·L-1H2O2相比，200 μmol·L-1、400 μmol·L-1和800 μmol·L-1H2O2處理細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度均下降，并在400 μmol·L-1濃度時出現(xiàn)最低值，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.01)(見圖2)。這提示200 μmol·L-1、400 μmol·L-1和800 μmol·L-1H2O2能有效增加P-糖蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)活性。H2O2在濃度400 μmol·L-1時對P-糖蛋白表達(dá)和功能均有最明顯的誘導(dǎo)作用，該濃度為最佳處理濃度，后續(xù)實驗均以400 μmol·L-1H2O2作為模型誘導(dǎo)濃度。

圖2 羅丹明123蓄積實驗檢測不同濃度H2O2處理細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)羅丹明123熒光強(qiáng)度 與0 μmol·L-1 H2O2相比，**P<0.01，***P<0.001

2.3 P-糖蛋白對RPE細(xì)胞內(nèi)ATP水平的影響P-糖蛋白非競爭性抑制劑Tariquidar抑制效果見圖3。結(jié)果顯示，H2O2+ P-糖蛋白抑制劑組中細(xì)胞內(nèi)羅丹明123水平較H2O2模型組增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，Tariquidar能有效抑制P-糖蛋白功能。

圖3 羅丹明123蓄積實驗中檢測熒光強(qiáng)度驗證P-糖蛋白抑制劑Tariquidar的抑制效果 **P<0.01

細(xì)胞內(nèi)ATP水平檢測結(jié)果見圖4，H2O2模型組ATP水平較對照組顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；而H2O2+ P-糖蛋白抑制劑組ATP水平則較H2O2模型組更低，差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示抑制P-糖蛋白功能可進(jìn)一步加劇氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的ATP水平下降。

圖4 熒光素/熒光素酶ATP檢測實驗檢測各組D407細(xì)胞內(nèi)ATP水平 ***P<0.001；*P<0.05

2.4 P-糖蛋白對RPE細(xì)胞凋亡的影響細(xì)胞凋亡情況見圖5，與對照組相比，H2O2模型組細(xì)胞凋亡率顯著增加，而H2O2+ P-糖蛋白抑制劑組細(xì)胞凋亡率則較H2O2模型組增加，提示抑制P-糖蛋白功能可加重氧化應(yīng)激下的細(xì)胞凋亡。

圖5 流式細(xì)胞儀檢測各組D407細(xì)胞凋亡情況

3 討論

目前，探討SMD病程中RPE細(xì)胞氧化損傷以及功能失調(diào)是研究SMD發(fā)病機(jī)制的重要切入點(diǎn)[14-16]。研究發(fā)現(xiàn)，在氧化應(yīng)激情況下組織屏障中P-糖蛋白的高表達(dá)可能是細(xì)胞自我保護(hù)的重要機(jī)制[17-18]。本實驗在不同濃度H2O2誘導(dǎo)下檢測人RPE細(xì)胞中P-糖蛋白的表達(dá)和功能活性以確定最佳誘導(dǎo)濃度，并在P-糖蛋白功能受抑制的情況下檢測細(xì)胞氧化損傷情況(以細(xì)胞內(nèi)ATP水平和細(xì)胞凋亡率為觀察指標(biāo))，證實在氧化應(yīng)激下RPE細(xì)胞中P-糖蛋白的高表達(dá)能有效減緩細(xì)胞的氧化損傷。

P-糖蛋白是腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中的一員。在生理條件下，P-糖蛋白表達(dá)于排泄器官和組織屏障，除了轉(zhuǎn)運(yùn)藥物、毒素等外源性物質(zhì)外，P-糖蛋白也負(fù)責(zé)一些內(nèi)源性物質(zhì)的排出，如淀粉樣蛋白、神經(jīng)酰胺等，參與維持組織細(xì)胞的生理功能[19]。然而，在某些病理情況下，如氧化應(yīng)激時，P-糖蛋白的表達(dá)和功能可出現(xiàn)上調(diào)，這在血-腦屏障[13]和腎近曲小管細(xì)胞[17]中均已證實。最近，我們在人RPE細(xì)胞株D407細(xì)胞中已發(fā)現(xiàn)H2O2可以誘導(dǎo)線粒體P-糖蛋白高表達(dá)[20]。相似地，本實驗中也觀察到H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激上調(diào)了人RPE細(xì)胞中P-糖蛋白的表達(dá)和功能。實際上，氧化應(yīng)激和P-糖蛋白的調(diào)控關(guān)系一直是學(xué)者們研究的熱點(diǎn)，同時也存在較大爭議。一方面，有報道提出與我們實驗結(jié)果相似的結(jié)論，即氧化應(yīng)激促進(jìn)P-糖蛋白表達(dá)上調(diào)及功能增強(qiáng)[17]；而另一方面，也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)短時間的氧化應(yīng)激可減弱P-糖蛋白的表達(dá)及轉(zhuǎn)運(yùn)功能[21]。目前，這一大爭議仍未能闡述清楚，我們認(rèn)為這些差異可能與實驗中氧化應(yīng)激的誘導(dǎo)條件(包括處理因素、處理時間、處理強(qiáng)度等)以及不同的細(xì)胞類型有關(guān)。

關(guān)于P-糖蛋白在氧化應(yīng)激時對受損細(xì)胞的保護(hù)作用，Thévenod等[17]研究發(fā)現(xiàn)在腎近曲小管細(xì)胞中，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的P-糖蛋白表達(dá)以及功能上調(diào)能抑制金屬鎘離子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。與此同時，Wang等[13]發(fā)現(xiàn)在氧化應(yīng)激下，血-腦屏障和血-脊髓屏障中P-糖蛋白的高表達(dá)和外排功能增強(qiáng)均與神經(jīng)細(xì)胞自我保護(hù)機(jī)制相關(guān)。這提示在病理情況下屏障組織中高表達(dá)的P-糖蛋白可能起著排泄代謝毒物的保護(hù)性作用。然而，該保護(hù)性作用在血-視網(wǎng)膜屏障中仍未研究清楚。本研究中，我們觀察到P-糖蛋白抑制劑Tariquidar能顯著抑制P-糖蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)活性，并進(jìn)一步加重氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的ATP水平下降和細(xì)胞凋亡，這說明P-糖蛋白功能性表達(dá)的增強(qiáng)能有效減緩細(xì)胞線粒體損傷并增強(qiáng)細(xì)胞對凋亡的抵抗，從而保護(hù)細(xì)胞。但這其中的具體機(jī)制仍不明確，需要進(jìn)一步研究。有文獻(xiàn)曾指出這可能與死亡受體介導(dǎo)的caspase 3依賴的凋亡通路受阻有關(guān)，通過抑制caspase 3的激活能有效地阻斷瀑布式級聯(lián)的程序性死亡過程[22]。也有報道認(rèn)為，P-糖蛋白高表達(dá)可抑制caspase 8的激活，但并不能影響死亡信號通路[23]。盡管現(xiàn)在眾多假說仍未得以證實，但是這些研究仍然提示我們P-糖蛋白對細(xì)胞氧化損傷確實起著一定的抑制和抵抗作用。

綜上所述，在H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激SMD模型中，P-糖蛋白的表達(dá)增加和功能增強(qiáng)在一定程度上抑制了RPE細(xì)胞凋亡，這對于進(jìn)一步了解SMD的發(fā)生發(fā)展來說是一個新的切入點(diǎn)，給SMD視網(wǎng)膜損傷防治提供了新的研究方向。