楊潔 冉明 郜會(huì)龍

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥之一，嚴(yán)重時(shí)可致盲。隨著糖尿病病程的延長(zhǎng)，持續(xù)的高血糖刺激會(huì)破壞患者視網(wǎng)膜的毛細(xì)血管，最終大多數(shù)的糖尿病患者會(huì)發(fā)生DR[1]。目前，DR的治療非常棘手，多年來進(jìn)展甚微，因此,研究DR發(fā)病和進(jìn)展的具體分子機(jī)制十分必要。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種促進(jìn)血管生成的細(xì)胞因子。有研究顯示，VEGF參與了DR新生血管的形成[2]。

miRNA是一類長(zhǎng)為19～20 nt的小分子非編碼RNA，通過序列互補(bǔ)與各個(gè)靶基因相互結(jié)合，從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[3]。有研究報(bào)道，miRNA通過調(diào)節(jié)靶基因，參與了細(xì)胞的增殖[4]、分化[5]、癌變[6]等過程，對(duì)許多疾病的發(fā)生和發(fā)展有著重大的影響。miR-429是原癌基因的產(chǎn)物，在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)異常，有研究報(bào)道，miR-429能抑制食管癌細(xì)胞的遷移和侵襲[7]。DR的發(fā)病機(jī)制是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，但目前國(guó)內(nèi)外尚未見miR-429與DR發(fā)生和發(fā)展相關(guān)的研究。我們擬通過收集DR患者的臨床標(biāo)本，檢測(cè)其中miR-429的表達(dá)，并通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分析miR-429在DR發(fā)病中可能扮演的角色，以期為DR的發(fā)病機(jī)制、診斷和治療的靶點(diǎn)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 入選者一般資料以2017年7月至12月在我院就診的117例2型糖尿病患者為研究對(duì)象，采集其外周血全血標(biāo)本5 mL。根據(jù)病情將患者分為DR組和無DR(non-DR，NDR)組，同時(shí)選取同期在我院體檢的健康人78名作為對(duì)照組(HC組)。其中糖尿病依據(jù)WHO的診斷標(biāo)準(zhǔn)確診，DR根據(jù)眼底檢查和熒光素眼底血管造影確診。三組研究對(duì)象的一般資料見表1。三組患者間的年齡、性別構(gòu)成、體質(zhì)量指數(shù)等差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)；由于NDR組和DR組均為糖尿病患者，故空腹血糖和糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin,HbA1c)均顯著高于HC組(均為P<0.001)，但NDR組與DR組間空腹血糖、餐后2 h血糖、HbA1c及糖尿病病程差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。所有入選者均知情同意，并簽署知情同意書。本研究通過我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1 三組研究對(duì)象的一般資料及對(duì)比

1.2 細(xì)胞與主要試劑人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human retinal microvascular endothelial cell， HRMEC)購(gòu)自英國(guó)Cell System公司；上皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基購(gòu)自瑞士Lonza Group公司；TRIzol、VEGF siRNA、miR-429 scramble、miR-429 mimic和miR-429 inhibitor均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich公司；小RNA提取試劑盒、加尾法miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒和miRNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自中國(guó)康為世紀(jì)公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR GREEN試劑盒均購(gòu)自日本TOYOBO公司；VEGF抗體、Bad抗體、AKT抗體、pAKT抗體、NOS3抗體、pNOS3抗體和兔抗人抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；VEGF over-expression構(gòu)建和pcDNA3.1載體均購(gòu)自上海英駿生物技術(shù)有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與處理HRMEC在上皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，及時(shí)更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞狀態(tài)良好、密度為60%～80%時(shí)傳代并分組，其中，檢測(cè)VEGF mRNA或蛋白表達(dá)時(shí)分為5組：(1)空白對(duì)照組：細(xì)胞不作任何處理；(2)高糖組：細(xì)胞用33 mmol·L-1葡萄糖刺激24 h；(3)scramble組：細(xì)胞用33 mmol·L-1葡萄糖刺激24 h后，轉(zhuǎn)染miR-429 scramble；(4)mimic組：細(xì)胞用33 mmol·L-1葡萄糖刺激24 h后，轉(zhuǎn)染miR-429 mimic；(5)inhibitor組：細(xì)胞用33 mmol·L-1葡萄糖刺激24 h后，轉(zhuǎn)染miR-429 inhibitor。檢測(cè)Bad mRNA表達(dá)及AKT通路相關(guān)蛋白表達(dá)時(shí)分為5組：(1)空白對(duì)照組：同前處理；(2)高糖組：同前處理；(3)過表達(dá)組：細(xì)胞用33 mmol·L-1葡萄糖刺激24 h后，轉(zhuǎn)染VEGF over-expression；(4)空載組：細(xì)胞用33 mmol·L-1葡萄糖刺激24 h后，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載；(5)siRNA組：細(xì)胞用33 mmol·L-1葡萄糖刺激24 h后，轉(zhuǎn)染VEGF siRNA。其中各組轉(zhuǎn)染操作嚴(yán)格按轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行，轉(zhuǎn)染6 h后行細(xì)胞換液，用無菌PBS輕輕沖洗3次，加入適量正常的上皮細(xì)胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集各組細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 RT-PCR檢測(cè)收集三組患者的外周血檢測(cè)miR-429及VEGF mRNA的表達(dá)，收集各組細(xì)胞分別檢測(cè)VEGF、Bad mRNA的表達(dá)。主要步驟為：用TRIzol法提取總RNA，分光光度法進(jìn)行定量，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性；用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，根據(jù)SYBR GREEN試劑盒進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，其中miR-429 RNA的提取用小RNA提取試劑盒、cDNA的獲得用加尾法miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒，用miRNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒定量，用2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)。根據(jù)從NCBI獲得的基因信息設(shè)計(jì)引物(見表2)，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

表2 基因引物信息

1.5 ELISA檢測(cè)將各組細(xì)胞培養(yǎng)上清加入到96孔板中，每孔100 μL，4 ℃過夜，PBS洗滌兩次后晾干。體積分?jǐn)?shù)5%BSA 37 ℃封閉1 h，PBS洗滌2次。加入VEGF抗體37 ℃孵育1 h，PBST洗滌5次，晾干。將兔抗人抗體按合適比例稀釋后加入微孔，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h后PBST洗滌5次，晾干。加入TMB顯色液每孔100 μL，室溫顯色10～20 min。每孔加入2 mmol·L-1H2SO450 μL終止反應(yīng)，終止后10 min內(nèi)，檢測(cè)其450 nm波長(zhǎng)處光密度值。

1.6 Western blot檢測(cè)收集各組細(xì)胞，用SDS Loading Buffer處理蛋白樣品，之后行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)至PVDF膜，體積分?jǐn)?shù)5% BSA 4 ℃封閉過夜，洗滌后加入一抗(Bad、NOS3、AKT、pNOS3 s1177、pAKT s473抗體稀釋比例均為11000)，于37 ℃孵育1 h，洗滌3次，加入二抗(稀釋比例為1500)，于37 ℃孵育30 min，洗滌后顯影。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用Graphpad prism 6對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較用方差分析，兩兩比較用t檢驗(yàn)，計(jì)量資料之間的關(guān)聯(lián)性用Pearson相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 miR-429和VEGF mRNA在DR患者外周血中表達(dá)收集三組研究對(duì)象的外周血，RT-PCR檢測(cè)其中miR-429和VEGF mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，DR組患者外周血中miR-429和VEGF mRNA的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于NDR組和HC組，NDR組均高于HC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.001)(見表3)。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，DR組患者外周血中miR-429和VEGF mRNA的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)為0.804，P<0.001)。

表3 RT-PCR檢測(cè)三組研究對(duì)象外周血中miR-429和VEGF mRNA的相對(duì)表達(dá)量

2.2 miR-429對(duì)細(xì)胞中VEGF表達(dá)影響RT-PCR和ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，高糖組VEGF的mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白水平均顯著高于空白對(duì)照組(均為P<0.05)，而mimic組VEGF的mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白水平均較scramble組顯著升高(均為P<0.01)，inhibitor組VEGF的mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白水平均較scramble組顯著降低(均為P<0.05)(見表4)。

表4 各組HRMEC中VEGF mRNA的相對(duì)表達(dá)量和蛋白水平

2.3 VEGF對(duì)AKT通路影響RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,高糖組Bad mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于空白對(duì)照組，過表達(dá)組Bad mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于空載組，siRNA組Bad mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于空載組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)(見圖1A)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，高糖組Bad、pNOS3 s1177和pAKT s473蛋白的表達(dá)水平均顯著高于空白對(duì)照組，過表達(dá)組Bad、pNOS3 s1177和pAKT s473蛋白的表達(dá)水平均顯著高于空載組，siRNA組Bad、pNOS3 s1177和pAKT s473 蛋白的表達(dá)水平均顯著低于空載組(見圖1B)。

圖1 RT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果 A:RT-PCR檢測(cè)各組Bad mRNA相對(duì)表達(dá)量(與空白對(duì)照組相比，#P<0.05;與空載組相比，*P<0.05)；B:Western blot檢測(cè)各組各因子蛋白表達(dá)電泳圖。1:空白對(duì)照組；2：高糖組；3：空載組；4：過表達(dá)組；5：siRNA組

3 討論

DR發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，具體表現(xiàn)為眼底微血管病變，眼底微環(huán)境發(fā)生多種變化，如細(xì)胞自噬、氧化應(yīng)激[8]、血管的炎性改變[9]等，同時(shí)因?yàn)闄C(jī)體對(duì)血管損傷的修復(fù)，會(huì)導(dǎo)致血管再生[10]，從而使眼底微環(huán)境中VEGF、TNF-α、IL-1β等多種細(xì)胞因子表達(dá)增加[11]。血管受到多種細(xì)胞因子的作用，發(fā)生復(fù)雜的病變，且隨著發(fā)病時(shí)間的延長(zhǎng)，血管會(huì)徹底失去功能，嚴(yán)重影響眼底組織和細(xì)胞的血供，從而導(dǎo)致視力受損。

miRNA在DR的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了不同的作用。有研究報(bào)道，miR-21通過下調(diào)過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)來促進(jìn)DR的發(fā)生[12]。本研究結(jié)果表明，miR-429和VEGF在DR患者外周血中表達(dá)上調(diào)，而且miR-429可促進(jìn)VEGF在HRMEC中的表達(dá)。Gong等[13]研究表明，VEGF在DR中表達(dá)上調(diào)，而miR-15a可通過下調(diào)VEGF的表達(dá)來抑制DR的進(jìn)展，這與本研究結(jié)果有類似之處。本研究結(jié)果還表明，VEGF可能是miR-429的靶基因。經(jīng)靶基因預(yù)測(cè)軟件TargetScan預(yù)測(cè)顯示，miR-429與VEGF有可以互補(bǔ)結(jié)合的序列，這可能是miR-429促進(jìn)VEGF表達(dá)上調(diào)的分子基礎(chǔ)。當(dāng)然，本研究有一定的局限性，NDR組和DR組患者的選取不夠嚴(yán)格，許多臨床資料沒有進(jìn)一步細(xì)化分析，尚需進(jìn)一步研究。

在DR的發(fā)病機(jī)制中，血管的增生和炎性病變是不可忽略的因素。有研究報(bào)道[14]，在DR動(dòng)物模型中，NF-κB的亞基受到O-糖苷的糖基化修飾增加，并且會(huì)促進(jìn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的死亡。這可能是因?yàn)楦咛堑拇碳?dǎo)致體內(nèi)的糖苷和糖配體增加，從而導(dǎo)致多種功能蛋白的糖基化修飾水平增加。本研究結(jié)果表明，在高糖的刺激下，AKT的磷酸化水平是增加的，即高糖刺激可激活A(yù)KT通路，這與文獻(xiàn)[14]報(bào)道基本相符。而本研究還發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染VEGF over-expression后AKT的磷酸化水平進(jìn)一步增加，這說明VEGF可促進(jìn)AKT通路的激活，其具體的機(jī)制可能是VEGF促進(jìn)下游分子的表達(dá)或功能的活化，而其下游分子參與了AKT通路的激活，或者VEGF通過反饋抑制或促進(jìn)某些miRNA的功能，進(jìn)而影響到AKT通路中關(guān)鍵分子的活化，導(dǎo)致AKT通路激活。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，在DR患者中，miR-429和VEGF的表達(dá)顯著增加。在HRMEC中，miR-429可促進(jìn)VEGF的表達(dá)上調(diào)，而且VEGF可促進(jìn)AKT通路的激活。TargetScan分析發(fā)現(xiàn)miR-429可與VEGF結(jié)合，VEGF可能是miR-429的靶基因，說明miR-429有可能成為DR的治療靶點(diǎn)。我們下一步將通過基因敲除、動(dòng)物模型和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)VEGF與miR-429的相互作用，并研究其相互作用的具體分子機(jī)制，以期進(jìn)一步闡明miR-429在DR發(fā)生和發(fā)展中的具體作用。