閻學(xué)偉，龔陳媛,祝曉雯，胥孜杭，2，姚超,3，王莉新,3，朱詩(shī)國(guó),3

(上海中醫(yī)藥大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、2.經(jīng)方理論應(yīng)用研究中心、3.免疫學(xué)與病原生物學(xué)教研室，上海 201203)

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)在肺癌的組織學(xué)類(lèi)型中占比最高，在所有腫瘤中，NSCLC致死率最高[1]。酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)、間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)抑制劑等分子靶向藥物先后進(jìn)入臨床應(yīng)用，使各期NSCLC患者的生存期得到了很大提高[2]。但是，NSCLC的療效依舊存在很大的上升空間，中晚期NSCLC治療獲益相對(duì)于早期依然非常有限[3]。尋求更加有效、作用更加持久的NSCLC療法為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。

隨著對(duì)固有免疫系統(tǒng)的研究不斷深入，固有免疫系統(tǒng)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的重要地位被漸漸確立，與自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的腫瘤免疫療法也受到了關(guān)注。目前，針對(duì)NK細(xì)胞相關(guān)的抗腫瘤療法，包括NK細(xì)胞、嵌合抗原受體-NK細(xì)胞(chimeric antigen receptor-NK cells，CAR-NK)、促NK細(xì)胞因子的回輸?shù)?，另外，NK細(xì)胞抑制性受體抑制劑的應(yīng)用也對(duì)NK細(xì)胞的抗腫瘤活性產(chǎn)生了積極作用[4]。

目前，通過(guò)使用天然化合物增強(qiáng)NK細(xì)胞抗腫瘤作用的報(bào)道尚不多見(jiàn)，玫瑰樹(shù)堿(ellipticine，EPT)是一種來(lái)源于傳統(tǒng)植物玫瑰樹(shù)的吲哚并異喹啉類(lèi)生物堿，對(duì)白血病、結(jié)腸癌、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞都有抑制作用[5]。本研究旨在探討EPT促進(jìn)NK細(xì)胞識(shí)別和殺傷NSCLC細(xì)胞的作用，以期促進(jìn)擴(kuò)充基于藥物治療的NSCLC免疫療法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1藥物與試劑 EPT(陶素化學(xué)公司，批號(hào)T4614)；DMSO(Amresco公司,批號(hào)0231)；胰酶、胎牛血清(Gibco公司)；DMEM高糖培養(yǎng)液、RPMI 1640培養(yǎng)液、青霉素/鏈霉素雙抗、PBS緩沖液(Hyclone公司)；人重組白介素-2(PeproTech公司，批號(hào)200-02)；噻唑蘭(Sigma Aldrich公司，批號(hào)M2128)；CCK8試劑盒(翊圣生物公司，批號(hào)ES60)；PE標(biāo)記MICA/B抗體、APC標(biāo)記HLA-ABC抗體(Biolegend公司，批號(hào)320906、311410，)；FITC標(biāo)記CD56抗體、PE/Cy5 標(biāo)記CD107α抗體、PE-Cy5同型對(duì)照抗體(BD公司，批號(hào)318304、555802、551497)；潮霉素B(Roche公司，批號(hào) 31282)；D-luciferin底物(PerkinElmer公司，批號(hào) 2591)；ATP檢測(cè)Celltiter Glo?試劑盒(Promega公司，批號(hào)G7571)；γ-H2AX抗體(Abcam公司，批號(hào)26350)；DAPI(碧云天公司，批號(hào)C1002)。

1.1.2細(xì)胞株 人NSCLC H1299、A549細(xì)胞，由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)提供。A549-luciferase(A549-luc)和H1299-luciferase(H1299-luc)細(xì)胞，由上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與病原生物學(xué)教研室建立細(xì)胞株并提供。

1.1.3儀器 二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific公司, 1300series A2)；激光共聚焦顯微鏡(ZESS公司, LSM 800 with Airyscan)；酶標(biāo)儀(Bio Tek 公司, Synergy)；流式細(xì)胞儀(BD公司, Accuri C6)；倒置顯微鏡(OLYMPUS公司,CKX41)。

1.2 方法

1.2.1NK細(xì)胞擴(kuò)增 從上海血液中心獲人的外周血，經(jīng)分離得到人的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)。使用新鮮或者冷凍的PBMCs通過(guò)與經(jīng)輻照的基因工程細(xì)胞mbIL-21-CD137L-K562，在含有1×105U·L-1的IL-2的RPMI 1640培養(yǎng)基中共培養(yǎng)，在5%CO2，37 ℃下擴(kuò)增2周，NK細(xì)胞標(biāo)志為CD3-CD56+。

1.2.2MTT法檢測(cè)EPT對(duì)肺癌細(xì)胞增殖的影響 A549和H1299細(xì)胞，胰酶消化后，制備成單細(xì)胞懸液，鋪于96孔板，細(xì)胞濃度為3 000個(gè)細(xì)胞每孔，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)過(guò)夜后，加入不同濃度的EPT(0.125、0.25、0.5、1、2、4、8 μmol·L-1)，設(shè)立DMSO溶劑對(duì)照組和空白組，每組設(shè)3復(fù)孔。培養(yǎng)24、48、和72 h后，每孔加入20 μL MTT溶液(5 g·L-1)，在培養(yǎng)箱中反應(yīng)4 h后，棄上清，每孔加入150 μL DMSO溶液，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm吸光度。計(jì)算細(xì)胞活力/%：(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值/對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100%

1.2.3免疫熒光檢測(cè)EPT對(duì)肺癌細(xì)胞DNA的影響 A549、H1299細(xì)胞消化，調(diào)整細(xì)胞密度為1×108個(gè)·L-1，鋪免疫熒光成像專(zhuān)用皿，每皿加入1 mL細(xì)胞懸液，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜。每皿加入1 mL終濃度為0、1、2 μmol·L-1的EPT培養(yǎng)24 h后，PBS洗1遍，每皿加入1 mL 4%多聚甲醛室溫固定10 min。PBS清洗1遍，加入1 mL破膜劑(0.2%Triton X-100+0.5%BSA PBS)20 min進(jìn)行破膜。PBS洗1遍，加1 mL 3%馬血清室溫封閉1 h。PBS洗1遍，每皿加80 μL一抗(1 ∶200，mouse anti human γ-H2AX)4 ℃過(guò)夜后PBS洗3遍，加入100 μL二抗(1 ∶350，goat anti mouse Alexa Fluro 488)室溫避光孵育1 h。PBS洗3遍，加入120 μL DAPI(1 ∶2 000)室溫避光染色10 min。PBS洗3遍，每皿加入1mL PBS后使用激光共聚焦25倍鏡進(jìn)行拍攝(Alexa Fluro 488及DAPI熒光)。

1.2.4CCK8法檢測(cè)EPT對(duì)NK細(xì)胞增殖的影響 取NK細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×108個(gè)·L-1。將NK細(xì)胞懸液加入96孔板，100 μL每孔。加入終濃度分別為0.125、0.25、0.5、1、2、4、8 μmol·L-1的EPT，設(shè)DMSO對(duì)照組和空白組，每組3復(fù)孔。于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h、48 h后每孔加入20 μL CCK8溶液，4 h后，酶標(biāo)儀上檢測(cè)450 nm處吸光度。計(jì)算細(xì)胞活力/%：(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值/對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100%

1.2.5化學(xué)發(fā)光法(ATP法)檢測(cè)EPT對(duì)NK細(xì)胞殺傷功能的影響 A549和H1299細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度1×108個(gè)·L-1, 將NK細(xì)胞取出調(diào)整濃度，以NK細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的效靶比為1 ∶1或2 ∶1進(jìn)行和藥物于白底96孔板共孵育。分為單腫瘤細(xì)胞組，單NK細(xì)胞組和腫瘤細(xì)胞+NK細(xì)胞組，每組3復(fù)孔。EPT(終濃度0、0.25、0.5、1、2 μmol·L-1)，每孔細(xì)胞懸液加藥物總體積100 μL，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后。每孔加入底物100 μL，反應(yīng)10 min。使用酶標(biāo)儀測(cè)定。 計(jì)算殺傷效力/%：1-[(NK細(xì)胞+腫瘤細(xì)胞組)-(單獨(dú)NK細(xì)胞組)]/單獨(dú)腫瘤細(xì)胞組×100%

1.2.6 化學(xué)發(fā)光法(Luciferase法)檢測(cè)EPT對(duì)NK細(xì)胞殺傷肺癌細(xì)胞作用的影響使用潮霉素B進(jìn)行抗性篩選處理培養(yǎng)A549-luciferase(A549-luc)和H1299-luciferase(H1299-luc)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度1×108個(gè)·L-1。同時(shí)將NK細(xì)胞取出調(diào)整濃度，以NK細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的效靶比分別為1 ∶1和2 ∶1進(jìn)行和藥物于白底96孔板共孵育。設(shè)定3個(gè)組，Spontaneous(單腫瘤細(xì)胞組)，腫瘤細(xì)胞+NK細(xì)胞組和Maximum組。即DMSO組和1 μmol·L-1、2 μmol·L-1的EPT組，Spontaneous組是加培養(yǎng)基，Maximum組是2%TritonX-100，每孔終體積200 μL，培養(yǎng)24 h后，每孔加入2 μL luciferase熒光底物，用酶標(biāo)儀檢測(cè)。計(jì)算殺傷效力/%：1-[(NK細(xì)胞+腫瘤細(xì)胞組)-Maximum組)/(Spontaneous組-Maximum組)]×100%

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EPT對(duì)NK細(xì)胞脫顆粒作用的影響A549和H1299細(xì)胞，胰酶消化后，制備成單細(xì)胞懸液加入6孔板，細(xì)胞濃度3×108個(gè)·L-1。每孔需2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液。培養(yǎng)箱內(nèi)過(guò)夜，加入濃度分別為0、1、2 μmol·L-1的EPT。加藥24 h后取出6孔板，將細(xì)胞消化并計(jì)數(shù)。與NK細(xì)胞效靶比為1 ∶1共孵育，以細(xì)胞數(shù)為2×105個(gè)，加入到48孔板中。向單NK細(xì)胞組和NK細(xì)胞+腫瘤細(xì)胞組，加入CD107α抗體和同型對(duì)照抗體孵育4 h。收集細(xì)胞于1.5 mL EP管中，用wash buffer洗兩遍。每個(gè)EP管再加入CD56抗體的，置于4 ℃冰箱孵育30 min。用wash buffer溶液洗兩遍，每孔加入200 μL的PBS，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EPT對(duì)肺癌細(xì)胞MICA/B與HLA-ABC表達(dá)的影響取A549和H1299細(xì)胞，胰酶消化后，制備單細(xì)胞懸液，以細(xì)胞密度為3×108個(gè)·L-1加入6孔板。每孔需2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液。在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜，d2加入濃度分別為0、1、2 μmol·L-1的EPT，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后。將細(xì)胞消化并計(jì)數(shù)。每管1×105個(gè)/50 μL細(xì)胞加入1.5 mL的EP管中。每管加入PE-MICA/B和APC-HLA-ABC抗體，同時(shí)設(shè)同型對(duì)照,于4 ℃冰箱染色30 min。用wash buffer洗一遍，再加入200 μL wash buffer溶液，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 EPT對(duì)NSCLC細(xì)胞和NK細(xì)胞的增殖的影響MTT結(jié)果顯示EPT可以明顯抑制NSCLC A549和H1299細(xì)胞的增殖(P<0.05)，并且有濃度和時(shí)間依賴(lài)性，如Fig 1 A、B所示。 A549細(xì)胞在24、48、72 h的IC50分別是12.06、3.76、1.65 μmol·L-1。H1299細(xì)胞在24、48、72 h的IC50分別是12.9、8.56、4.80 μmol·L-1。CCK-8的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EPT對(duì)NK細(xì)胞的增殖抑制作用較弱，如Fig 1 C所示。其在24，48 h的IC50是112.71、72.03 μmol·L-1。

Fig 1 Effect of EPT on proliferation of non-small cell lung cancer cells and NK cells n=3)A-B: A549 and H1299 cells were treated with different concentrations of EPT for 24 h, 48 h and 72 h, and cell viability was measured by MTT assay. C: NK cells were treated with different concentrations of EPT shown in the figure for 24 h, 48 h, the activity of NK cells was detected by CCK8; *P<0.05,**P<0.01 vs vehicle group.

2.2 EPT對(duì)肺癌細(xì)胞DNA的影響Fig 2顯示，EPT能夠誘導(dǎo)NSCLC A549和H1299細(xì)胞產(chǎn)生DNA損傷。EPT處理A549、H1299細(xì)胞24 h后，免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞中DNA損傷的標(biāo)志物γ-H2AX的表達(dá)增加(P<0.01)。

Fig 2 EPT induces DNA damage in A549 and H1299 cellsA: Immunofluorescence detection of γ-H2AX expression in A549 cells treated with EPT (culture time: 24 h). B: Percentage of γ-H2AX positive area in A549 n=3); **P<0.01 vs vehicle group.

2.3 EPT對(duì)NK細(xì)胞殺傷NSCLC細(xì)胞的作用的影響如Fig 3A所示，ATP法實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明EPT可以增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷活性。EPT不同濃度作用A549、H1299細(xì)胞24 h，效靶比1 ∶1，結(jié)果顯示隨著藥物濃度的升高，NK細(xì)胞的殺傷作用增加(P<0.05)。如Fig 3B-C所示，以1 ∶1、2 ∶1不同效靶比，可以看出在相同濃度下，效靶比增加，NK細(xì)胞殺傷活性增加(P<0.05)。Luciferase法檢測(cè)結(jié)果如Fig 3D-E所示，EPT可以增強(qiáng)NK的殺傷活性。選用0，1和2 μmol·L-1EPT處理A549-luc和H1299-luc細(xì)胞(效靶比為1 ∶1、2 ∶1)，同一效靶比下，殺傷能力隨藥物濃度遞增(P<0.01)；相同的濃度下，效靶比越大，殺傷效應(yīng)越強(qiáng)(P<0.01)，顯示出在這兩個(gè)細(xì)胞中，EPT可以明顯增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷活性。

Fig 3 Effect of EPT on killing of A549 and H1299 cells by NK cellsA: The special lysis percentage of A549/H1299 cells was incubated with NK cells for 4 h at an effector-to-target ratio of 1 ∶1 after treatment with different EPT concentrations for 24 h n=3);*P<0.05, **P<0.01vs vehicle group.

2.4 EPT對(duì)NK細(xì)胞脫顆粒的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EPT處理后與A549和H1299細(xì)胞共培養(yǎng)的NK細(xì)胞的CD107α表達(dá)水平，結(jié)果如Fig 4所示，使用EPT 0、1和2 μmol·L-1處理腫瘤細(xì)胞24 h后，與NK細(xì)胞效靶比1 ∶1共孵育4 h，發(fā)現(xiàn)在A549、H1299細(xì)胞中，隨著藥物濃度增加，NK細(xì)胞脫顆粒水平增加。

Fig 4 Effect of EPT on CD107α degranulation of NK cells A: Detection of CD107α expression in NK cells co-cultured with A549 cells after EPT treatment by flow cytometry (culture time: 24 h). B: Detection of CD107α expression in NK cells co-cultured with H1299 cells after EPT treatment by flow cytometry (culture time: 24 h). C: CD107α+ NK cell percentage in A549 cells n=3); * P<0.05, **P<0.01 vs vehicle group.

2.5 EPT對(duì)NSCLC細(xì)胞MICA/B表達(dá)的影響為考察EPT的免疫增強(qiáng)效應(yīng)是否與NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的識(shí)別有關(guān)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了EPT對(duì)A549、H1299腫瘤細(xì)胞表面的NK細(xì)胞識(shí)別配體MICA/B、HLA-ABC表達(dá)的影響，結(jié)果如Fig 5所示。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EPT(濃度為1和2 μmol·L-1)可以上調(diào)A549和H1299細(xì)胞表面MICA/B表達(dá)，但沒(méi)有上調(diào)抑制性配體 HLA-ABC表達(dá)。EPT可以增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)A549、H1299腫瘤細(xì)胞的識(shí)別。

Fig 5 Effect of EPT on expression of MICA/B in A549 and H1299 cellsA: Detection of MICA/B and HLA-ABC expression in A549 cells after EPT treatment by flow cytometry (culture time: 24 h). B: Relative expression of MICA/B and HLA-ABC in A549 cells after EPT treatment n=3). C: Detection of MICA/B and HLA-ABC expression in H1299 cells after EPT treatment by flow cytometry (culture time: 24 h). D: Relative expression of MICA/B and HLA-ABC in H1299 cells after EPT treatment (x±s, n=3); *P<0.05, **P<0.01 vs vehicle group.

3 討論

NK細(xì)胞為固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，與T、B細(xì)胞不同，T、B細(xì)胞的激活依賴(lài)于抗原致敏、抗體或主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)的參與，而NK細(xì)胞不需要以上步驟的參與便能夠直接殺傷靶細(xì)胞，因此，NK細(xì)胞對(duì)比于其他免疫細(xì)胞，可以更加快速有效地清除病變細(xì)胞，其免疫監(jiān)視作用更為直接有效[6-7]。自然殺傷細(xì)胞2族成員D(natural-killer group 2 member D，NKG2D)為NK細(xì)胞表面的重要受體，與配體結(jié)合可以激活NK細(xì)胞，NKG2D配體包括MHC-I類(lèi)分子相關(guān)蛋白A和B(major histocompatibility complex class I homologues A/B，MICA/B)以及人巨細(xì)胞病毒UL16蛋白的結(jié)合蛋白(UL16-binding proteins，ULBPs)等[8]。NK細(xì)胞與靶細(xì)胞接觸活化后，可以通過(guò)釋放穿孔素、顆粒酶、IFN-γ等途徑殺傷靶細(xì)胞，當(dāng)靶細(xì)胞表面NKG2D配體表達(dá)增高，會(huì)NK細(xì)胞的殺傷活性。而在腫瘤或感染的細(xì)胞中DNA損傷持續(xù)被激活， NKG2D配體的表達(dá)相對(duì)于正常細(xì)胞增加，當(dāng)腫瘤細(xì)胞DNA被藥物等刺激因素進(jìn)一步損傷后， NKG2D配體的表達(dá)升高，能夠增加NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別殺傷作用[9]。

很多傳統(tǒng)化療和靶向藥物可以對(duì)腫瘤細(xì)胞DNA產(chǎn)生損傷，這一作用可以提高NK細(xì)胞的抗腫瘤活性，如舒尼替尼可以增強(qiáng)肝癌HepG2細(xì)胞MICA/B、ULBP1/2/3的表達(dá)，強(qiáng)化NK細(xì)胞的識(shí)別與殺傷，這一作用于與舒尼替尼上調(diào)NF-κβ2的表達(dá)有關(guān)[10]。5-fluorouracil(5-FU)也可以強(qiáng)化NK細(xì)胞對(duì)小鼠結(jié)腸癌MC38細(xì)胞的殺傷作用，在此過(guò)程中，5-FU可以上調(diào)NKG2D活化相關(guān)的DNAM-1和Rae-1配體的表達(dá)，將NK細(xì)胞人為耗竭后，5-FU誘導(dǎo)的殺傷作用被明顯抑制[11]。部分天然化合物也能夠提高NK細(xì)胞抗腫瘤活性，沙苑子的黃酮成分(flavonoid component from the seeds of Astragalus complanatus，F(xiàn)AC)可以上調(diào)NKG2D、NKp44的表達(dá)，強(qiáng)化NK-92細(xì)胞對(duì)白血病、肝癌細(xì)胞的殺傷[12]。

EPT可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞周期阻滯，同時(shí)誘導(dǎo)凋亡，其抗腫瘤機(jī)制與抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ和共價(jià)修飾DNA有關(guān)[13]，Savorani等[14]報(bào)道，EPT可以抑制皮膚T細(xì)胞淋巴瘤(cutaneous T-cell lymphoma，CTCL)細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡，而抑制EPT誘導(dǎo)DNA氧化損傷的親脂性抗氧化劑α-生育酚(α-tocopherol)能夠逆轉(zhuǎn)EPT的凋亡誘導(dǎo)作用。EPT的抗腫瘤作用與DNA損傷具有重要聯(lián)系。

在本研究中，EPT對(duì)NSCLC細(xì)胞具有較強(qiáng)抑制作用，誘導(dǎo)DNA損傷。在EPT本身誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞DNA損傷的同時(shí)，腫瘤細(xì)胞表面MICA/B的表達(dá)被上調(diào)，從而增加了腫瘤細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞的敏感性，增強(qiáng)了NK細(xì)胞識(shí)別殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，在自身具備抑制作用的前提下，還強(qiáng)化了周邊NK細(xì)胞對(duì)NSCLC細(xì)胞的識(shí)別與殺傷。這是一種強(qiáng)化固有免疫中NK細(xì)胞監(jiān)視功能從而殺傷腫瘤細(xì)胞的特殊作用。但是，目前腫瘤細(xì)胞的DNA損傷與腫瘤細(xì)胞表面MICA/B的表達(dá)的直接關(guān)系尚缺乏報(bào)道，DNA損傷導(dǎo)致的細(xì)胞表面抗原的變化具體機(jī)制目前仍待進(jìn)一步探索。

EPT具備轉(zhuǎn)化為抗NSCLC藥物的潛力，而更進(jìn)一步的藥效學(xué)與藥物代謝動(dòng)力學(xué)及毒理學(xué)研究將加速這一進(jìn)程。天然化合物很多具備高效低毒的特點(diǎn)，進(jìn)一步深化抗腫瘤免疫的研究將有助于其成為新興的抗腫瘤藥物群體。