徐 非，馬欣雨，龔蕾蕾，劉藝筱，程蕊棠，朱雨薇，繆孫涵，邱麗穎

(江南大學(xué)無(wú)錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

動(dòng)脈粥樣硬化是一種常見的動(dòng)脈血管疾病，特點(diǎn)是脂肪和纖維堆積使動(dòng)脈彈性降低、管腔變窄[1]。隨著人們生活水平的提高，動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病率逐年上升，并趨于年輕化。因此，探索干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化的新型藥物，從而改善動(dòng)脈粥樣硬化的治療效果，是迫切需要突破的科學(xué)問題。

動(dòng)脈粥樣硬化是一種受多因素影響的炎癥反應(yīng)和脂類平衡紊亂性疾病。目前認(rèn)為氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein， ox-LDL)是引起動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)及核心要素。ox-LDL是一種氧化應(yīng)激損傷蛋白，不經(jīng)常規(guī)LDL受體途徑代謝，而是由清道夫受體(CD36)和ox-LDL受體(lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1，LOX1)識(shí)別并內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞，引起胞內(nèi)脂質(zhì)沉積和泡沫樣改變[2]。動(dòng)脈粥樣硬化最早的病變過(guò)程是單核細(xì)胞趨化至血管內(nèi)皮下的間隙，分化為巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞隨后可使侵入到內(nèi)膜下的脂蛋白發(fā)生氧化，產(chǎn)生ox-LDL，使其喪失與LDL受體結(jié)合的能力。ox-LDL可與巨噬細(xì)胞表面的清道夫受體結(jié)合。清道夫受體與LDL受體不同，不受胞內(nèi)膽固醇水平高低的限制，使得脂質(zhì)在巨噬細(xì)胞內(nèi)大量積聚，并逐步轉(zhuǎn)變?yōu)楦缓罅磕懝檀嫉呐菽瓨蛹?xì)胞[3]?；钚匝?reactive oxygen species，ROS)是氧化應(yīng)激過(guò)程的主要參與者。ROS是心血管疾病中重要的危險(xiǎn)因子之一，參與了包括細(xì)胞炎癥在內(nèi)的病理過(guò)程。p38/MAPK信號(hào)通路能夠被不良刺激如ROS，激活并介導(dǎo)發(fā)生炎癥反應(yīng)[4],進(jìn)而參與胞內(nèi)脂質(zhì)沉積過(guò)程。

王不留行是石竹科植物麥藍(lán)菜[vaccariasegetalis(Neck.) Garcke]的種子，王不留行黃酮苷(vaccarin)是從王不留行中分離純化的天然有活性的黃酮苷[5]。本課題組近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，vaccarin可通過(guò)抑制Notch信號(hào)通路從而保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受高糖損傷[6-7]。vaccarin還可激活FGF2/FGFR-1信號(hào)通路誘導(dǎo)新生血管的形成[8]，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移[6]?，F(xiàn)有的證據(jù)表明vaccarin在維護(hù)心血管功能中的重要作用。然而，有關(guān)vaccarin對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的形成以及過(guò)程中導(dǎo)致的巨噬細(xì)胞胞內(nèi)脂質(zhì)沉積的作用尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

另外，本課題組前期研究表明， vaccarin可有效抑制內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ROS水平[9-10]，但vaccarin對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS水平以及胞內(nèi)脂質(zhì)沉積的影響目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)主要研究在ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)沉積過(guò)程中，vaccarin對(duì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，p38/MAPK信號(hào)通路的活化及脂質(zhì)沉積的影響。為今后動(dòng)脈粥樣硬化的治療提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 主要藥品與試劑DMEM培養(yǎng)基(HyClone，美國(guó)，AE29170268)；ox-LDL(上海索萊寶科技有限公司，20190806)；油紅O染料(上海索萊寶科技有限公司，1219D051)；DCFH-DA探針試劑盒(上海索萊寶科技有限公司，803A021)；vaccarin(上海士峰生物科技有限公司，19042671)；H2O2(Sigma，美國(guó)，323381)；N-乙酰半胱氨酸(NAC)(Sigma，美國(guó)，1724426)；SB203580(SB)(Merck，德國(guó)，559389)；anisomycin(ani)(Cell Signaling Technology，美國(guó)，931398-72-0)、p-p38MAPK(Thr180/Tyr182)抗體(Cell Signaling Technology，美國(guó)，4511)；甘油三酯(triglyceride,TG)試劑盒(南京建成生物有限公司，20171216)；膽固醇酯(cholesteryl ester,CE)試劑盒(Abcam，英國(guó)，ab65359)；p38MAPK抗體(Abcam，英國(guó)，ab31828)；β-actin抗體(Abcam，英國(guó)，ab179467)；辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的羊抗兔及鼠抗體(江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司，01334/10426及01325/20348)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱(Thermo，美國(guó))；HS-840-U型超凈工作臺(tái)(常熟市雪科電器有限公司)；低速離心機(jī)(上海醫(yī)療器械廠)；電泳儀、濕轉(zhuǎn)儀、全能型凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad，美國(guó))；蔡司全自動(dòng)正置熒光顯微鏡(Zeiss，德國(guó))；酶標(biāo)儀(BioTek，美國(guó))。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)將Raw 264.7細(xì)胞接種于含有10% FBS，1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)處理。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1油紅O染色法檢測(cè)巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積情況 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Raw 264.7細(xì)胞，消化處理后，以1×104個(gè)/孔接種于96孔板中。按照細(xì)胞油紅O染色方法[11]進(jìn)行處理，顯微鏡下拍照觀察。

1.4.2細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測(cè) DCFH-DA探針能夠用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。在處理好的Raw 264.7細(xì)胞中加入10 μmol·L-1的DCFH-DA。 37 ℃避光孵育 30 min，用PBS清洗3遍，使用熒光顯微鏡拍照檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.4.3細(xì)胞內(nèi)TG和CE水平檢測(cè) 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Raw264.7細(xì)胞，消化，計(jì)數(shù)后，以20×105個(gè)/孔均勻接種于6孔板中。按照不同的分組加入相應(yīng)的試劑進(jìn)行處理。24 h后，再按照試劑盒的說(shuō)明書處理細(xì)胞，使用酶標(biāo)儀分別在510 nm和570 nm下檢測(cè)OD值，并進(jìn)行分析。

1.4.4免疫印跡(Western blot)檢測(cè)p38蛋白及其磷酸化表達(dá)水平 RIPA緩沖液裂解細(xì)胞后，提取細(xì)胞總蛋白，定量變性后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，隨后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用5%的脫脂牛奶封閉1 h，p38MAPK、p-p38MAPK(Thr180/Tyr182)、β-actin抗體按說(shuō)明書稀釋，4 ℃孵育過(guò)夜。用1×TBST充分清洗后，使用HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h。用1×TBST清洗后進(jìn)行顯影，最后使用ImageJ分析目標(biāo)蛋白灰度值。

2 結(jié)果

2.1 vaccarin改善ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞脂質(zhì)沉積通過(guò)油紅O染色發(fā)現(xiàn)，Raw 246.7細(xì)胞經(jīng)100 mg·L-1ox-LDL處理24h后，與對(duì)照組相比出現(xiàn)明顯脂質(zhì)沉積(Fig 1A)。另外，TG以及CE測(cè)定結(jié)果顯示，ox-LDL處理組脂質(zhì)含量明顯升高(Fig 1B)。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)vaccarin能夠改善胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，通過(guò)不同濃度的vaccarin(1、2、5、10 μmol·L-1)與ox-LDL共同處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)與ox-LDL組相比，在vaccarin為5 μmol·L-1時(shí)能夠明顯降低TG和CE水平，改善胞內(nèi)脂質(zhì)沉積(Fig 1A，B)，故選取5 μmol·L-1vaccarin進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Fig 1 Effect of vaccarin on lipid deposition in Raw 264.7 induced by A.Oil red O staining of different groups; B.TG、CE levels.*P<0.05 vs control,#P<0.05 vs ox-LDL.

2.2 vaccarin抑制ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞ROS產(chǎn)生及p38/MAPK信號(hào)通路活化實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定ROS水平，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，ox-LDL組ROS產(chǎn)生增加，而vaccarin能夠逆轉(zhuǎn)這一效果(Fig 2A)。另外，Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ox-LDL組p38蛋白磷酸化水平增加，而vaccarin能夠使其表達(dá)降低(Fig 2B)。推測(cè)vaccarin能夠抑制ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞ROS產(chǎn)生及 p38/MAPK信號(hào)通路活化。

Fig 2 Effect of vaccarin on ROS production and p38/MAPK in Raw 264.7 induced by A.Intracellular levels of ROS in different groups; B.Expression of protein p38 and p-p38. 1:Control; 2:ox-LDL;3:ox-LDL+Vaccarin;4:Vaccarin；*P<0.05 vs control,#P<0.05 vs ox-LDL.

2.3 vaccarin通過(guò)ROS/p38信號(hào)通路抑制ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞脂質(zhì)沉積油紅O染色以及CE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，預(yù)孵ROS抑制劑NAC和p38/MAPK抑制劑SB后能夠增強(qiáng)vaccarin對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞脂質(zhì)沉積的清除作用(Fig 3A，C ；Fig 3D，F(xiàn))。而預(yù)孵ROS激活劑H2O2和p38/MAPK激活劑ani能夠一定程度逆轉(zhuǎn)這一效果(Fig 3B，C；Fig 3E，F(xiàn))。綜上，推測(cè)vaccarin可能通過(guò)ROS/p38信號(hào)通路抑制ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞脂質(zhì)沉積。

Fig 3 Effect of vaccarin on lipid deposition in Raw 264.7 induced by ox-LDL through ROS/p38 signaling pathways A.Oil red O staining of different groups pre-incubated with NAC; B.Oil red O staining of different groups pre-incubated with H2O2; C.CE levels of different groups pre-incubated with NAC and H2O2; D.Oil red O staining of differentgroups pre-incubated with SB; E.Oil red O staining of different groups pre-incubated with ani; F.CE levels of different groups pre-incubated with SB and ani.*P<0.05 vs ox-LDL,#P<0.05 vs ox-LDL+Vaccarin.

2.4 p38/MAPK信號(hào)通路在 vaccarin抑制ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞脂質(zhì)沉積中起決定作用Western blot結(jié)果顯示，預(yù)孵ROS抑制劑NAC和p38/MAPK抑制劑SB后能夠降低ox-LDL誘導(dǎo)的p38蛋白磷酸化水平，同時(shí)能夠協(xié)同增強(qiáng)vaccarin降低p38 蛋白磷酸化水平的程度(Fig 4A，C)。另外，預(yù)孵ROS激活劑H2O2和p38/MAPK激活劑ani后能夠明顯增加ox-LDL誘導(dǎo)的p38蛋白磷酸化水平，并且逆轉(zhuǎn)vaccarin對(duì)p38蛋白磷酸化的抑制效果(Fig 4B，D)。繼而表明，p38/MAPK信號(hào)通路或許在vaccarin抑制ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞脂質(zhì)沉積中起決定作用，即ox-LDL可以通過(guò)增加ROS的產(chǎn)生進(jìn)而激活p38/MAPK信號(hào)通路從而導(dǎo)致巨噬細(xì)胞脂質(zhì)沉積，而vaccarin可以改善這一效果。

Fig 4 Expression of protein p38 and p-p38 in Raw 264.7 A.Western blot analysis of groups incubated by NAC; B.Western blot analysis of groups incubated by H2O2; C.Western blot analysis of groups incubated by SB; D.Western blot analysis of groups incubated by ani.*P<0.05 vs ox-LDL,#P<0.05 vs ox-LDL+Vaccarin.

3 討論

心血管系統(tǒng)疾病病死率目前居世界首位，遠(yuǎn)高于惡性腫瘤。動(dòng)脈粥樣硬化為心血管疾病發(fā)展進(jìn)程中的特征性病理改變，機(jī)制非常復(fù)雜。LDL在動(dòng)脈粥樣硬化病程進(jìn)展的各階段均扮演重要角色[12]。起初LDL在動(dòng)脈壁處聚集，受到氧化修飾后，生成ox-LDL可募集循環(huán)血液中的單核細(xì)胞，進(jìn)入動(dòng)脈中膜層分化成巨噬細(xì)胞[13]。動(dòng)脈粥樣硬化與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，其特征是動(dòng)脈中脂質(zhì)和纖維性物質(zhì)積累。早期病變過(guò)程包括：巨噬細(xì)胞通過(guò)清道夫受體CD36等吞噬LDL以后，將其修飾為L(zhǎng)DL-C為主的膽固醇，并且積聚成為“泡沫細(xì)胞”。本研究結(jié)果表明，ox-LDL可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生明顯的脂質(zhì)沉積，表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)甘油三酯和膽固醇酯水平均顯著升高。

正常生理狀態(tài)，胞內(nèi)維持著氧化與抗氧化的平衡。當(dāng)細(xì)胞遭遇如ox-LDL等病理因素的刺激時(shí)，胞內(nèi)平衡被破壞，產(chǎn)生大量ROS，后續(xù)表現(xiàn)為多種細(xì)胞毒效應(yīng)的產(chǎn)生[14]。本研究結(jié)果顯示，ox-LDL使巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS 水平顯著升高。表明ox-LDL暴露，使巨噬細(xì)胞的抗氧化能力受損，氧化應(yīng)激加劇。既往研究顯示，p38/MAPK信號(hào)通路的激活，致使胞內(nèi)炎性相關(guān)細(xì)胞因子水平升高，進(jìn)而使胞內(nèi)ROS水平升高[14]。本研究中，ROS抑制劑NAC在抑制巨噬細(xì)胞胞內(nèi)ROS產(chǎn)生后，我們觀察到脂質(zhì)沉積的現(xiàn)象有所改善，這種改善可被vaccarin進(jìn)一步加強(qiáng)。同時(shí)ROS激活劑H2O2處理細(xì)胞后，脂質(zhì)沉積情況顯著加重，且這種現(xiàn)象可被vaccarin逆轉(zhuǎn)。以上研究結(jié)果表明，oxLDL可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS水平增加，且ROS可導(dǎo)致胞內(nèi)脂質(zhì)沉積現(xiàn)象的發(fā)生，而vaccarin可改善ox-LDL誘導(dǎo)的脂質(zhì)沉積。

為了進(jìn)一步研究p38/MAPK信號(hào)通路的作用，本研究使用p38/MAPK特異性抑制劑SB203580，抑制通路活性。結(jié)果表明，p38/MAPK通路抑制后，可降低巨噬細(xì)胞胞內(nèi)脂質(zhì)沉積現(xiàn)象，且這種抑制作用被vaccarin進(jìn)一步加強(qiáng)。反之，p38/MAPK特異性激活劑anisomycin能夠加重胞內(nèi)脂質(zhì)沉積現(xiàn)象，而能夠被vaccarin反轉(zhuǎn)。另外，研究中發(fā)現(xiàn)，使用ROS抑制劑NAC后能夠抑制p38/MAPK信號(hào)通路活性，而ROS激活劑H2O2則相反。表明ROS是p38/MAPK信號(hào)通路激活的始動(dòng)因子，干預(yù)ROS水平或p38/MAPK信號(hào)通路活性，均可引起胞內(nèi)脂質(zhì)沉積現(xiàn)象的改變，而在此過(guò)程中，vaccarin起正向調(diào)節(jié)作用。

根據(jù)以上結(jié)果，可得出以下結(jié)論：ox-LDL能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激，產(chǎn)生ROS。ROS能夠誘導(dǎo)p38/MAPK信號(hào)通路激活，進(jìn)而誘發(fā)巨噬細(xì)胞胞內(nèi)脂質(zhì)沉積的發(fā)生，而vaccarin可通過(guò)調(diào)節(jié)ROS水平和p38/MAPK信號(hào)通路活化程度，改善ox-LDL誘導(dǎo)的胞內(nèi)脂質(zhì)沉積現(xiàn)象。vaccarin對(duì)于ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞胞內(nèi)脂質(zhì)沉積的改善作用，為今后干預(yù)治療提供了新的思路。