肖楚麗，李金成，李碧蓉，肖志勇，張文超，于旭東

(1. 邵陽學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖南 邵陽 422000；2. 南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院，湖南 衡陽 421001)

應(yīng)激對記憶產(chǎn)生深遠(yuǎn)而多樣的影響，一般來講，一定程度的應(yīng)激可增強(qiáng)記憶，然而應(yīng)激時間過長或強(qiáng)度過大可損害記憶[1]。并且應(yīng)激可增加個體患精神疾病的風(fēng)險。然而應(yīng)激對記憶影響的分子機(jī)制仍沒有完全闡明。因此闡明應(yīng)激影響記憶的分子機(jī)制，尋找有效的抗應(yīng)激性記憶障礙的藥物具有重要意義。

對香豆酸(p-coumaric acid，p-CA)是一種衍生自芳香族氨基酸的苯丙酸，廣泛分布于許多植物和人類飲食中，如谷物、水果和蔬菜，具有多種藥用活性，包括抗氧化、心臟保護(hù)、抗瘧原蟲、抗突變、抗血小板、抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用[2-4]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，研究表明p-CA可改善腦缺血/再灌注損傷,改善LPS誘導(dǎo)的抑郁樣行為[5-6]。然而p-CA在學(xué)習(xí)記憶中的作用卻研究滯緩，尤其是在應(yīng)激性記憶障礙的作用并無報道。

應(yīng)激通常誘導(dǎo)各種細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑的下調(diào)，如蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)和胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)，而抗應(yīng)激治療通過激活這些信號傳導(dǎo)途徑來拮抗應(yīng)激誘導(dǎo)的負(fù)性影響。拮抗氧化應(yīng)激可改善應(yīng)激誘導(dǎo)記憶障礙。在細(xì)胞實驗中，p-CA 可激活ERK信號改善氧化應(yīng)激現(xiàn)象[3]。這些證據(jù)提示p-CA可能在應(yīng)激性記憶障礙中發(fā)揮重要作用。為驗證p-CA在應(yīng)激性記憶障礙中的作用，當(dāng)前研究基于急性束縛應(yīng)激(acute stress, AS)誘導(dǎo)的新穎物體識別(novel object recognition，NOR)與物體位置識別(object location recognition，OLR)記憶提取障礙范式探索p-CA對應(yīng)激性記憶障礙的影響以及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物♂，ICR小鼠,7周齡，體質(zhì)量(30～35) g，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，許可證號：SCXK湘2019-0004，2只每籠，均飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)實驗動物環(huán)境，(23±2) ℃，12 h/12 h明暗交替中，并保證小鼠可自由攝食和飲水。所有ICR小鼠在實驗處理之前飼養(yǎng)1周，以適應(yīng)新環(huán)境。所有實驗程序均完全按照國家衛(wèi)生研究院關(guān)于和使用實驗室動物的指南進(jìn)行。

1.2 實驗設(shè)計

1.2.1實驗1 實驗1A p-CA對AS誘導(dǎo)小鼠新穎物體識別記憶提取障礙的影響。小鼠隨機(jī)分成對照組(Control)，急性應(yīng)激組(AS)，急性應(yīng)激組(AS)+p-CA組(AS+ p-CA)，每組8只，實驗流程如Fig 1A所示，3組小鼠進(jìn)行新穎物體識別測試流程，測試階段開始前1.5 h開始束縛，束縛1 h后立即注射p-CA或10%的Tween 80(溶媒1)，觀察小鼠在測試中的記憶表現(xiàn)。

實驗1B p-CA對AS誘導(dǎo)小鼠物體位置識別記憶提取障礙的影響。小鼠隨機(jī)分成對照組(Control)，急性束縛應(yīng)激組(RS)和急性束縛應(yīng)激+p-CA組(AS+p-CA)，每組8只，實驗流程如Fig 1A所示，3組小鼠進(jìn)行物體位置識別記憶測試流程，測試階段開始前1.5 h開始束縛，束縛1 h后立即注射p-CA或溶媒1，觀察小鼠在測試中的記憶表現(xiàn)。

Fig 1 Schematic of experimental designs in experiment 1A：Experiment 1；B： Experiment 2. AS, acute stress; p-CA, p-coumaric acid; PD, PD98059.

1.2.2實驗2 實驗2A PD98059對p-CA改善AS小鼠記憶障礙的影響。小鼠隨機(jī)分成急性應(yīng)激組(AS)，急性應(yīng)激+ PD98059組(AS+PD)，急性應(yīng)激+p-CA組(AS+ p-CA)和急性應(yīng)激+ PD98059+p-CA組(AS+ p-CA + PD)，每組8只，實驗流程如Fig 1B所示，4組小鼠進(jìn)行新穎物體識別測試，測試階段開始前1.5 h開始束縛，束縛1 h后立即注射p-CA或溶媒1，5 min后側(cè)腦室注射PD98059或1% DMSO(溶媒2)，觀察小鼠在測試中的記憶表現(xiàn)。

實驗2B H89對p-CA改善AS小鼠記憶障礙的影響。小鼠隨機(jī)分成急性應(yīng)激組(AS)，急性應(yīng)激+ H89組(AS+ H89)，急性應(yīng)激+p-CA組(AS+ p-CA)和急性應(yīng)激+ H89+p-CA組(AS+ p-CA + H89)，每組8只，實驗流程如Fig 1B所示，4組小鼠進(jìn)行新穎物體識別測試，測試階段開始前1.5 h開始束縛，束縛1 h后立即注射p-CA或溶媒1，5 min后側(cè)腦室注射H89或1% DMSO(溶媒2)，觀察小鼠在測試中的記憶表現(xiàn)。

1.3 新穎物體識別測試新穎物體識別裝置為黑色隔音箱(30 cm長×30 cm寬×50 cm高)，箱內(nèi)光線柔和，并且一排氣扇提供約50 Hz的噪音。識別物體為偏好相同而形狀顏色不同的兩個物體，識別物體通過雙面膠粘貼于箱底并平衡其位于箱底的位置。

實驗分為習(xí)慣化、采樣和測試三個階段，在習(xí)慣化階段小鼠放入空隔音箱適應(yīng)10 min。采樣階段在習(xí)慣化后24 h進(jìn)行，隔音箱內(nèi)對稱放入兩個相同的識別物體，小鼠放入箱中自由探索10 min。采樣階段結(jié)束后24 h進(jìn)行測試階段，采樣階段的兩個相同物體被隨機(jī)替換一個新物體，再次將小鼠放入探索5 min。每次放入小鼠前用75%的酒精清潔箱內(nèi)。通過攝像頭拍攝,記錄小鼠分別探求兩個物體的時間。小鼠的鼻子距物體小于1 cm則視為探索。小鼠的記憶通過測試階段的辨別指數(shù)(DI)進(jìn)行衡量。DI =(新物體的探索時間-舊物體的探索時間)/(新物體的探索時間+舊物體的探索時間)。

1.4 物體位置識別測試物體位置識別裝置為黑色隔音箱(35 cm 長×25 cm寬×50 cm高)，箱內(nèi)光線柔和，并且一排氣扇提供約50 Hz的噪音。識別物體為形狀顏色完全相同的兩個物體，識別物體通過雙面膠粘貼于箱底并平衡其位于箱底的位置。

實驗分為習(xí)慣化、采樣和測試三個階段，在習(xí)慣化階段小鼠放入空隔音箱適應(yīng)10 min。采樣階段在習(xí)慣化后24 h進(jìn)行，兩識別物體放入隔音箱內(nèi)分別在箱底長邊的垂直平分線上并距長邊4 cm處對稱粘貼，小鼠放入箱中自由探索10 min。采樣階段結(jié)束后24 h進(jìn)行測試階段，隨機(jī)將采樣階段的一個識別物體移動并粘貼于短邊的垂直平分線上，且距短邊4 cm處，再次將小鼠放入箱內(nèi)探索5 min。每次放入小鼠前用75%的酒精清潔箱內(nèi)。通過攝像頭拍攝,記錄小鼠分別探求兩個物體的時間。小鼠的鼻子距物體小于1 cm則視為探索。小鼠的記憶通過測試階段的辨別指數(shù)(DI)進(jìn)行衡量。DI =(新物體的探索時間-舊物體的探索時間)/(新物體的探索時間+舊物體的探索時間)。

1.5 急性應(yīng)激(AS)流程通過50 mL的離心管對小鼠進(jìn)行束縛進(jìn)行急性應(yīng)激，離心管均勻分布直徑為4 mm的透氣孔以保證小鼠自由呼吸，束縛時間為1 h，束縛結(jié)束后放回鼠籠。

1.6 側(cè)腦室置管及給藥小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(65 mg·kg-1)，待其麻醉后固定于腦立體定位儀上，暴露顱骨并標(biāo)記前囟點，以前囟點為原點，將導(dǎo)管(62202型，瑞沃德生命科學(xué)有限公司)向后0.3 mm，向右1.0 mm向下2.5 mm植入右側(cè)腦室。手術(shù)后，小鼠單籠飼養(yǎng)恢復(fù)5～7 d。實驗結(jié)束后，組織解剖來確定導(dǎo)管位置是否正確，并剔除導(dǎo)管位置錯誤動物的數(shù)據(jù)。

1.7 藥物與試劑p-CA(阿拉丁，上海)分散于10%的Tween 80(溶劑為生理鹽水)中(溶媒1)，劑量為25 mg·kg-1；經(jīng)腹腔注射，藥物及溶媒的注射體積為10 mL·kg-1。H89與PD98059 (selleck,美國)均分散于1% DMSO(溶劑為生理鹽水)中(溶媒2)，最終濃度分別為1 g·L-1和2 g·L-1。兩種藥物均經(jīng)側(cè)腦室微量給藥，在小鼠清醒狀態(tài)下用毛巾輕微束縛，然后用微量注射泵通過引導(dǎo)管向側(cè)腦室注射，注射體積為1 μL，耗時約2 min，并停留1 min。

2 結(jié)果

2.1 p-CA改善AS誘導(dǎo)小鼠新穎物體識別記憶提取障礙在NOR采樣階段(Fig 2A)，單因素方差分析顯示，各組小鼠對兩物體的總探索時間無明顯差異(P>0.05)。在測試階段，各種處理均不影響小鼠對兩物體的總探索時間(P>0.05,Fig 2A右)和活動距離(P>0.05,Fig 2B)，卻明顯影響小鼠的DI(P<0.01,Fig 2C)，具體來說，AS明顯降低小鼠DI(P<0.01)，而p-CA明顯上調(diào)AS誘導(dǎo)的DI降低(P<0.05)。

Fig 2 Effect of p-CA on NOR memory retrieval deficit induced by AS in mice n=8)A: The total time spent on exploring both objects is shown for the three groups in NOR sample and test section; B: The distance travelled is shown for the three groups in NOR test section; C: The discrimination index is shown for the three groups in NOR test phase. p-CA: p-coumaric acid, AS: acute stress, NOR: novel objective recognition.**P<0. 01 vs control group;#P<0. 05 vs AS group.

2.2 p-CA改善AS誘導(dǎo)小鼠物體位置識別記憶提取障礙在ORL采樣階段(Fig 3A)，單因素方差分析顯示，各組小鼠對兩物體的總探索時間無明顯差異(P>0.05)。在測試階段，各種處理均不影響小鼠對兩物體的總探索時間(P>0.05,Fig 3A右)和活動距離(P>0.05,Fig 3B)，卻明顯影響小鼠的DI(P<0.01,Fig 3C)，具體來說，AS明顯降低小鼠DI(P<0.05)，而p-CA明顯上調(diào)AS誘導(dǎo)的DI降低(P<0.05)。

Fig 3 Effect of p-CA on OLR memory retrieval deficit induced by AS in mice n=8)A:The total time spent on exploring both objects is shown for the three groups in OLR sample and test section; B: The distance travelled is shown for the three groups in OLR test section; C: The discrimination index is shown for the three groups in OLR test phase. p-CA: p-coumaric acid, AS: acute stress, OLR: objective location recognition.*P<0. 05 vs control group;#P<0. 05 vs AS group.

2.3 PD98059阻斷了p-CA對急性應(yīng)激小鼠記憶提取的改善作用在NOR采樣階段結(jié)果顯示，各組小鼠對兩物體的總探索時間無明顯差異(P>0.05)。在測試階段，各種處理均不影響小鼠對兩物體的總探索時間(P>0.05,Fig 4A)和活動距離(P>0.05,Fig 4B)，卻明顯影響小鼠的DI(P<0.01,Fig 4C)，具體來說，p-CA明顯上調(diào)AS小鼠DI(P<0.05)，而PD98059明顯降低p-CA誘導(dǎo)的AS小鼠DI上調(diào)(P<0.05)。此外，單獨注射PD98059不影響應(yīng)激小鼠DI(P>0.05)。

Fig 4 Effect of PD98059 on p-CA improved NOR memory retrieval deficit in AS mice n=8)A:The total time spent on exploring both objects is shown for the four groups in NOR sample and test section; B: The distance travelled is shown for the four groups in NOR test section; C: The discrimination index is shown for the four groups in NOR test phase. p-CA: p-coumaric acid, AS: acute stress, NOR: novel objective recognition, PD: PD98059.*P<0. 05 vs AS group;#P<0. 05 vs AS+p-CA group.

2.4 H89阻斷了p-CA對急性應(yīng)激小鼠記憶提取的改善作用在NOR采樣階段(Fig 5A)，單因素方差分析顯示，各組小鼠對兩物體的總探索時間無明顯差異(P>0.05)。在測試階段，各種處理均不影響小鼠對兩物體的總探索時間(P>0.05,Fig 5A)和活動距離(P>0.05,Fig 5B)，卻明顯影響小鼠的DI(P<0.05,Fig 5C)，具體來說，p-CA明顯上調(diào)AS小鼠DI(P<0.05)，而H89明顯降低p-CA誘導(dǎo)的AS小鼠DI上調(diào)(P<0.05)。此外，單獨注射H89不影響應(yīng)激小鼠DI(P>0.05)。

Fig 5 Effect of H89 on p-CA improved NOR memory retrieval deficit in AS n=8)A:The total time spent on exploring both objects is shown for the four groups in NOR sample and test section; B: The distance travelled is shown for the four groups in NOR test section; C: The discrimination index is shown for the four groups in NOR test phase. p-CA: p-coumaric acid, AS: acute stress, NOR: novel objective recognition.*P<0. 05 vs AS group;#P<0. 05 vs AS+p-CA group.

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，p-CA可提高急性應(yīng)激小鼠新穎物體測試及物體位置測試中小鼠辨別指數(shù)。此外，考慮到PKA信號和ERK信號在學(xué)習(xí)記憶中的作用，本文應(yīng)用ERK抑制劑 PD98059和PKA信號抑制劑H89分別探索其對p-CA改善急性應(yīng)激小鼠記憶提取障礙的作用。結(jié)果顯示， H89和 PD98059分別阻斷了p-CA對急性應(yīng)激小鼠記憶提取障礙的改善作用。這些結(jié)果表明，p-CA改善急性應(yīng)激誘導(dǎo)小鼠記憶提取障礙，并且這種作用可能依賴于ERK及PKA信號。

NOR及OLR測試?yán)脟X類對新物體或新位置的天然偏好來檢測動物記憶。其中NOR測試常用于檢測動物的識別記憶，一般認(rèn)為，嗅內(nèi)側(cè)皮層是控制這種記憶的關(guān)鍵腦區(qū)。而OLR測試常用于檢測動物由海馬控制的空間記憶[7]。急性應(yīng)激對記憶的作用非常復(fù)雜，不同類型、強(qiáng)度、持續(xù)時間的應(yīng)激作用于記憶的相同階段可增強(qiáng)、損害記憶或?qū)τ洃洘o影響。相同類型、強(qiáng)度、持續(xù)時間的應(yīng)激作用于記憶的不同階段可增強(qiáng)、損害記憶或?qū)τ洃洘o影響[8]。急性束縛應(yīng)激是一種廣泛接受的嚙齒動物應(yīng)激模型，它引起無條件和不可避免的神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)，其特征是外周血漿皮質(zhì)酮明顯升高。雖然急性束縛應(yīng)激對多種記憶類型的影響不盡相同，一致的是急性束縛應(yīng)激破壞NOR和OLR記憶提取過程[9-10]。故當(dāng)前研究表明1 h急性束縛應(yīng)激破壞小鼠NOR和OLR記憶提取過程,進(jìn)一步支持了應(yīng)激對記憶提取的損害作用。

p-CA在中樞疾病中發(fā)揮廣泛的神經(jīng)保護(hù)作用[5,6,11]。p-CA可改善小鼠氧化應(yīng)激及腦缺血/再灌注損傷，炎性抑郁大鼠強(qiáng)迫游泳及懸尾測試中的抑郁樣行為[5,6]。重要的是，p-CA可改善東莨菪堿誘導(dǎo)大鼠被動回避和水迷宮測試中記憶障礙[11]。一致的是，當(dāng)前研究結(jié)果顯示p-CA明顯改善急性應(yīng)激誘導(dǎo)的NOR記憶提取障礙，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)p-CA可明顯改善急性應(yīng)激誘導(dǎo)的OLR記憶提取障礙，這進(jìn)一步支持了p-CA的神經(jīng)保護(hù)作用和擴(kuò)展了p-CA的促學(xué)習(xí)記憶作用。此外，為排除活動度及探索時間等非特異性因素對實驗結(jié)果的影響，在NOR及OLR測試中分別檢測了小鼠的行走距離及對兩物體的總探索時間，結(jié)果顯示急性應(yīng)激或p-CA均不影響小鼠的活動水平及探索時間，表明急性應(yīng)激或p-CA不是通過影響小鼠的活動水平及總探索時間來影響小鼠記憶表現(xiàn)。

ERK和PKA信號傳導(dǎo)途徑參與p-CA的多種生物學(xué)作用。 具體來說，p-CA通過ERK改善氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[3]。含有p-CA的竹莖提取物通過PKA信號發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用[12]。PD98059為ERK信號廣泛應(yīng)用的抑制劑，在之前研究中雙側(cè)前額葉皮層分別注射2 g·L-1的PD98059抑制了ERK蛋白的磷酸化，且損害NOR[13]。側(cè)腦室注射1μg的PD98059抑制ERK蛋白磷酸化[14]。當(dāng)前研究中，側(cè)腦室注射2 μg的PD98059阻斷了p-CA對應(yīng)激性記憶提取障礙的改善作用，可能與抑制ERK蛋白的磷酸化有關(guān)。此外，單獨側(cè)腦室注射2 μg PD98059不影響小鼠記憶提取。提示p-CA促應(yīng)激性記憶提取障礙可能依賴于ERK信號。H89為PKA信號廣泛應(yīng)用的抑制劑，在之前研究中雙側(cè)海馬分別注射5 pmol(約0.002 6 μg)的H89抑制了亞精胺對PKA蛋白磷酸化的增強(qiáng)作用及學(xué)習(xí)記憶的提高作用。此外,5 μmol·L-1(約2 596 μg)的H89均損害學(xué)習(xí)記憶。當(dāng)前研究中，側(cè)腦室注射1 μg的H89阻斷了p-CA對應(yīng)激性記憶提取障礙的改善作用，可能與抑制PKA蛋白的磷酸化有關(guān)。此外，單獨側(cè)腦室注射1 μg H89不影響小鼠記憶提取。提示p-CA促應(yīng)激性記憶提取障礙可能依賴于PKA信號?；谝陨涎芯績?nèi)容，本研究進(jìn)一步支持了ERK和PKA信號對p-CA生物學(xué)功能的參與作用。為進(jìn)一步證實ERK和PKA在p-CA促應(yīng)激性學(xué)習(xí)記憶中的作用，在將來的研究中應(yīng)檢測ERK和PKA總蛋白及蛋白磷酸化形式的影響以明確p-CA對ERK和PKA的激活作用及H89和PD98059對p-CA激活ERK和PKA的抑制作用。

本研究基于NOR和OLR范式，首次證明p-CA可逆轉(zhuǎn)急性應(yīng)激誘導(dǎo)記憶提取障礙，并且p-CA的這種作用可能依賴于PKA與ERK信號。此外，與其他酚類化合物相比，p-CA在腸道中被快速吸收，具有更高的生物利用度，提示其可能作為一種潛在的治療應(yīng)激性記憶障礙的藥物。ERK和PKA具有廣泛的下游靶點，需要在今后的研究中進(jìn)一步明確其下游機(jī)制。