蔣晉豫，施智寶，李 云，劉永華，郝新忠，艾 茹

(1.北京林業(yè)大學 林木育種國家工程實驗室/生物科學與技術學院，北京 100083；2.陜西省林業(yè)科學院 ,西安 710082；3.國家林業(yè)草原長柄扁桃工程技術研究中心；4.榆林學院，陜西 榆林 719000)

長柄扁桃(Amygdaluspedunculata)屬薔薇科(Rosaceae)桃屬(Amygdalus)多年生落葉灌木，是我國西北地區(qū)防風固沙重要木本油料植物，具有較高的藥用和觀賞價值[1-2]。核仁含油量高達55%，可作為品質優(yōu)良的食用油,具有抗氧化、降血脂和保護肝臟功能[3]，另外還含有大量的粗蛋白(25%)、苦杏仁苷(4%)和豐富的維生素、18種氨基酸和礦質元素[4]。長柄扁桃油也可制成生物柴油，緩解我國能源短缺的問題，有益于改善環(huán)境[5]。由此可見，長柄扁桃的用途多種多樣，具有廣闊的發(fā)展前景及開發(fā)潛能。

自然環(huán)境變化、人為活動等原因導致全球降水量減少，水資源短缺，生活生產用水面臨極大困難，并嚴重威脅農林業(yè)發(fā)展，干旱問題已成為全球焦點。與之呼應，植物對干旱脅迫響應機理研究也成為重要課題之一，眾多問題有待解決。長柄扁桃為適應干旱、強烈光照、土壤貧瘠等惡劣環(huán)境形成了許多旱生特征，但抗旱機理仍不甚清楚，為此，我們在完成長柄扁桃不同種源抗旱性評價基礎上，以抗旱性較強的榆林榆陽種源和抗旱性較弱的河北豐寧種源為材料，研究干旱脅迫對2個種源植株葉片滲透調節(jié)物質、保護性酶活性等生理生化指標的影響，以期推進瀕危資源保護及產業(yè)化開發(fā)和分子生物學研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用長柄扁桃1 a生幼苗，為2017年自繁實生苗，繁殖所需成熟種子2016年7月下旬分別采集于氣候干旱程度較強的陜西省榆林市榆陽區(qū)補浪河鄉(xiāng)和干旱程度較弱的河北省豐寧縣壩上，去除核殼后于2017年 3月8日在位于榆陽區(qū)的陜西省林業(yè)科學院治沙研究所特色經濟林示范基地播種育苗，5月18日選擇生長整齊一致的優(yōu)良植株，移栽于防雨棚中，統(tǒng)一栽培管理，定時定量澆水。栽植時每個種源取 50株長勢基本一致的苗，移栽至直徑30 cm、深25 cm的塑料桶。桶底斜鋪碎石子，上面平鋪一層濾紙(防止土壤滲入石子中)。沿桶壁插入一根塑料管(高度超出桶面2～3 cm)作為灌水和通氣管道(桶重+石子+濾紙+塑料管=1 kg)。每個桶放入土壤10 kg。最后用珍珠巖覆蓋土表抑制水分蒸發(fā)。移栽時充分灌水，以保證長柄扁桃幼苗成活。

1.2 試驗處理方法

從7月1日起，對兩個種源的長柄扁桃盆栽苗進行兩種處理，分別為：對照(水分供應正常，保障生長旺盛)和持續(xù)干旱脅迫處理即從開始處理到處理結束持續(xù)40 d不澆水，利用持續(xù)土壤水分蒸發(fā)和植物蒸騰延長和加重干旱脅迫。在試驗開始第 8、16、24、32和40 d分別采集葉樣，用于測定相關生理指標。

1.3 指標測定

1.3.1 土壤含水量測定 從土壤相對含水量達到 45%～50%開始，每隔8 d采樣1次，采樣時在每盆植物根部附近取原狀土樣10 g左右并密封，帶回實驗室采用烘干法測定，每個種源重復3 次。

1.3.2 葉片組織含水量測定 在采集土壤的同時，采集從植株頂部下數(shù)第4～5片生長正常、無病蟲害和損傷的葉片并密封帶回實驗室，重復3次；部分葉樣及時用于測定含水量，部分葉樣存于冰箱冷藏、備用于測定生理指標。

土壤(葉片)絕對含水量R

×100%

1.3.3 植株其它生理指標測定 葉片自由水/束縛水含量利用阿貝折射儀采用馬林契克法測定[6]；葉片細胞質膜相對透性(RPMP)采用電導儀法測定[6]；葉片游離脯氨酸含量用磺基水楊酸浸提法測定，葉片丙二醛含量用硫代巴比妥酸(TBA)反應法測定[6]；葉片超氧化物歧化酶(SOD)活性用氮藍四唑法(NBT)測定[6]，葉片過氧化物酶活性用愈創(chuàng)木酚法測定[6]；葉片可溶性蛋白含量用考馬斯亮藍G-250 法測定[6]。每個指標測定3次即3次重復，取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel對原始數(shù)據(jù)整理及圖表制作，采用SPSS14.0 進行顯著性分析、權重分析和散點圖的繪制。

采用Microsoft Excel和SPSS軟件對進行數(shù)據(jù)整理和分析計算。

2 結果與分析

2.1 各處理土壤絕對含水量隨處理時間的變化

從表1看出，處理開始后前8 d土壤含水量處于適宜狀態(tài)，第9 d開始進入水分脅迫期。根據(jù)土壤相對含水量的變化，試驗期土壤含水量可分為5個時期，即適宜期(處理后第1～9 d),輕度脅迫期(處理后第10～17 d),中度脅迫期(處理后第18～25 d),重度脅迫期(處理后第26～33 d)和極重度脅迫期(處理后第34～40 d)。

表1 處理后土壤含水量

2.2 干旱脅迫對2個種源長柄扁桃葉片相對含水量的影響

一般而言，土壤含水量與植物葉片相對含水量正相關，即當土壤含水量降低時，植物葉片含水量也會相應下降。如果在干旱脅迫下，葉片仍能保持較高的相對含水量，則其對干旱脅迫有較強的適應性。因此，葉片相對含水量高低在一定程度上可以反映植株抗旱能力的強弱[7]。

本研究中，2個種源長柄扁桃葉片相對含水量都隨著脅迫程度的加劇呈下降趨勢，而正常灌水苗木(對照)葉片相對含水量變化不大(圖1)。當脅迫后第8 d，榆林榆陽種源與河北豐寧種源的長柄扁桃葉片相對含水量都開始快速下降，下降幅度分別為10.99%和32.58%，至干旱脅迫第40 d時，2個種源的葉片相對含水量均降至各自的最低，分別為32.97%和55.06%，榆陽種源葉片含水量高于豐寧種源，說明榆林榆陽種源葉片對干旱脅迫自身調節(jié)的能力強于河北豐寧種源。

圖中F為河北豐寧種源，Y為榆林榆陽種源，CK為對照，下同。

2.3 干旱脅迫對2個種源長柄扁桃幼苗葉片質膜透性和丙二醛含量的影響

2.3.1 葉片質膜透性 從圖2可見，長柄扁桃葉片質膜相對透性隨著干旱脅迫的加劇呈上升趨勢，而正常灌水苗木對照組葉片質膜透性變化不大。在最初脅迫時上升緩慢，在脅迫24 d后急劇上升。其中河北豐寧種源(F)的質膜相對透性增幅相對較大，脅迫第32 d比第24 d增大48.05%，說明其細胞膜被破壞程度較大；而榆林榆陽種源(Y)的質膜透性變化幅度較小，說明其細胞受干旱脅迫的影響小。

圖2 2個種源長柄扁桃葉片質膜透性

2.3.2 葉片丙二醛含量 隨著干旱脅迫時間的增加，長柄扁桃兩個種源丙二醛含量總體呈增加趨勢，但動態(tài)變化略有不同(圖3)，而正常灌水苗木對照組丙二醛含量變化不大。長柄扁桃兩個種源MDA的含量在脅迫第16 d后就開始急劇上升，河北豐寧種源、榆林榆陽種源比脅迫開始時上升了46.15%和28.00%，對干旱的敏感度較質膜透性大,并且在脅迫后期河北豐寧種源(F)MDA含量遠遠高于榆林榆陽種源Y，這說明其生物膜受損程度和發(fā)生膜脂過氧化作用的程度較嚴重。

圖3 2個種源長柄扁桃葉片MDA含量

2.4 干旱脅迫對滲透調節(jié)物質脯氨酸和可溶性蛋白的影響

2.4.1 脯氨酸 從圖4可看出，當長柄扁桃受到干旱脅迫后兩個種源Pro含量整體呈先達到高峰，正常灌水苗木對照組Pro含量變化較小，說明其對干旱脅迫比較敏感，能盡快產生Pro調節(jié)細胞質溶液與環(huán)境的滲透平衡，在脅迫40 d時呈下降趨勢，較32 d相比，河北豐寧、榆林榆陽種源分別下降了24.3%和20.8%，說明兩個種源長柄扁桃干旱脅迫程度已經超過了Pro的調節(jié)能力。

圖4 2個種源長柄扁桃葉片脯氨酸含量

2.4.2 干旱脅迫對兩個種源長柄扁桃可溶性蛋白的影響 從圖5可以看出，可溶性蛋白含量在脅迫到32 d時下降幅度比較明顯，與第24 d相比，河北豐寧、榆林榆陽種源分別下降了37.64%、14.01%，正常灌水對照組中可溶性蛋白含量變化不大。說明在可溶性蛋白含量指標方面，榆林榆陽種源的抗旱性強于河北豐寧種源。

圖5 2個種源長柄扁桃葉片可溶性蛋白含量

2.5 干旱脅迫對2個種源長柄扁桃細胞內保護酶系統(tǒng)的影響

2.5.1 葉片SOD含量 從圖6可以看出，兩個種源長柄扁桃的SOD含量都是隨著脅迫時間的延長呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，但是正常灌水苗木對照組SOD含量幾乎沒有明顯變化。長柄扁桃兩個種源均在第24 d時達到高峰值，河北豐寧種源和榆林榆陽種源SOD含量分別為794 U·g-1·min-1和959 U·g-1·min-1，在整個脅迫過程中SOD含量差異顯著。而河北豐寧的SOD含量一直較小，說明其清除自由基的能力較弱，抵抗干旱破壞的能力較差。

圖6 2個種源長柄扁桃葉片SOD含量

2.5.2 葉片POD含量 從圖7可以看出，兩個種源長柄扁桃的POD含量都是隨著脅迫時間的延長呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，而對照組苗木POD含量變化不大。兩個種源長柄扁桃POD在第32 d時才達到高峰值，河北豐寧種源和榆林榆陽種源POD含量分別為8.9 U·g-1·min-1和10.1 U·g-1·min-1，POD含量較少，說明其清除自由基的能力較弱，抵抗干旱破壞的能力較差。

圖7 2個種源長柄扁桃葉片POD含量

3 討論與結論

3.1 討論

榆林榆陽種源長柄扁桃長期生長在干旱的沙地環(huán)境中，必然進化出適應這種干旱環(huán)境的生理生化以及分子機制。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫會使長柄扁桃葉片內組織相對含水量下降，在飽和虧持續(xù)上升土壤中度水分脅迫以上能維持較高水平。在處理后第8～40 d的脅迫處理下，脯氨酸含量隨脅迫濃度的增加以及脅迫時間的延長持續(xù)增加，與可溶性蛋白相比脯氨酸積累的速度以及幅度更快。在土壤干旱脅迫下，隨土壤相對含水量的減少，脯氨酸含量逐步增加而后減少，蛋白質含量持續(xù)下降。這說明河北豐寧長柄扁桃在逆境下生成蛋白質的能力相對較弱，這與郭改改等的研究結果一致[8]。第16 d的時候總葉綠素含量大幅度的升至最高，說明在干旱脅迫程度較輕時，長柄扁桃通過增強光合色素的含量來緩解外界干旱環(huán)境的脅迫，但隨時間的延長脅迫強度增大時，長柄扁桃的這種緩解能力下降。

3.1.1 干旱脅迫對葉片相對含水量(LRWC)、細胞膜透性以及MDA的影響 在干旱脅迫剛發(fā)生時，葉片相對含水量(LRWC)下降緩慢是因為在輕度脅迫下，植物通過自身調節(jié)水分吸收和消耗來滿足LRWC的平衡，從而限制光合速率等其他機能，同時若能維持較高的LRWC且下降越慢，表明植株的葉片持水力越強，抗旱性越強，常被用作衡量植株抗旱性的生理指標。本研究中榆林榆陽種源的葉片相對含水量在脅迫過程中一直處于較高水平，且下降緩慢，說明榆陽種源(Y)的長柄扁桃葉片具有較高的持水力，而河北豐寧種源(F)的長柄扁桃葉片則相反，說明其持水力弱，不能抵御干旱不良環(huán)境。LRWC變化的同時首先引起膜透性改變，膜上酶蛋白的變化和脂類組成都有所改變，同時各種代謝失去平衡，活性氧積累，發(fā)生膜脂過氧化，破壞膜的正常功能，而且過氧化產物MDA極其類似物也能直接對植物細胞起毒害作用。因此葉片相對含水量，質膜透性和MDA含量都可直接用來衡量植物的抗旱能力。

3.1.2 干旱脅迫對滲透調節(jié)物質及保護酶的影響 在干旱脅迫的影響下，生理過程的變化并非同時發(fā)生，一般認為抗氧化系統(tǒng)對脅迫等非生物因素的反應比較敏感。本研究中，榆林榆陽種源長柄扁桃葉片SOD和POD活性在整個脅迫過程中均處于最高水平，說明其有良好的旱害防御系統(tǒng)，而SOD活性在第24 d時先達到峰值，說明SOD保護酶系統(tǒng)較POD先受到損壞，POD在較嚴重的旱害條件下也能發(fā)揮較好的抗氧化能力，但是在脅迫后期SOD和POD活性均降低，不足以清除體內的自由基，引起膜脂過氧化作用，增加了植物的受害程度。由此分析可得出，榆林榆陽種源的長柄扁桃有較強的抗旱能力。一般植物在干旱脅迫下體內脯氨酸和可溶性蛋白的含量顯著增加，且抗旱性強的植物積累的脯氨酸和可溶性蛋白明顯高于不抗旱的植物。本研究中兩個種源長柄扁桃隨著脅迫的加劇游離脯氨酸呈先上升后下降的趨勢，且榆陽種源的Pro含量明顯高于其他種源，說明其的抗旱性最強；可溶性蛋白含量則隨干旱的加重而下降。可溶性蛋白含量下降，可能與初生代謝受到抑制使可溶性蛋白質合成受阻，降解加快有關，并且根據(jù)植物在受到干旱脅迫后蛋白質合成能維持在比較穩(wěn)定的水平，變化幅度較小者抗旱性強,可以得出兩個種源長柄扁桃的抗旱性由強到弱的順序與對細胞膜透性和MDA研究得出的結果一致。

3.2 結論

長柄扁桃的抗旱抗逆性是其生理生化狀態(tài)、結構等共同協(xié)調高度契合的結果。本試驗的榆林榆陽種源和河北豐寧種源長柄扁桃1 a生實生幼苗在輕度、中度、重度土壤水分脅迫下生理生化影響研究結論為，2個種源長柄扁桃在遭受土壤輕度脅迫時，葉片保護酶活性顯著提高，丙二醛含量、脯氨酸和可溶性蛋白能維持良好的協(xié)調關系，這幾種物質協(xié)同在前期輕度脅迫時起到了重要作用，從而在輕度脅迫時增強了其抗旱的能力。但在中度、重度、極重度脅迫時植株體內保護酶和其他物質的合協(xié)關系可能被打破，說明植株抗旱機理較弱，導致最后這幾種物質代謝紊亂，中度、重度脅迫時植株開始出現(xiàn)不正常的病態(tài)反應。