楊謙，楊蒙蒙，張軍，譚雪敏，馬玉泉

肺癌是我國(guó)的主要健康問(wèn)題，約占所有癌癥相關(guān)死亡人數(shù)的28%[1]。肺癌的2種主要形式是小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，分別占15%和85%[2]。常規(guī)治療和手術(shù)方法難以控制肺癌，導(dǎo)致預(yù)后不良，NSCLC的總體5年生存率僅為15%。顯然，有必要對(duì)NSCLC的替代治療方案進(jìn)行研究，有望減輕這一主要的死亡負(fù)擔(dān)[3]。Hippo通路的失調(diào)和肺癌發(fā)展有關(guān)，并有助于肺癌細(xì)胞的發(fā)展和轉(zhuǎn)移[4]。鈣黏蛋白4(FAT4)可以作為Hippo通路調(diào)節(jié)劑來(lái)抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲，并且在24%的肺癌患者中發(fā)生突變[5]。FAT4是一種腫瘤抑制因子，可誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，F(xiàn)AT4的抑制導(dǎo)致Yes結(jié)合蛋白(YAP)激活，從而誘導(dǎo)YAP靶基因的上調(diào)[6]。葉黃素(3,3-二羥基-α-胡蘿卜素)又稱“植物葉黃素”，是一種氧化的類胡蘿卜素，在自然界廣泛存在，可以從萬(wàn)壽菊中提取。大量的流行病學(xué)證據(jù)表明，葉黃素在預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化和與年齡有關(guān)的黃斑變性，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)及作為抗腫瘤藥方面具有多種功能[7]。本研究擬探討葉黃素對(duì)人肺癌H1975細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的抑制作用及Hippo信號(hào)通路的影響，為肺癌的治療提供理論依據(jù)，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要藥品、試劑及儀器 (1) 主要藥品、試劑:葉黃素(純度99.95%)、5-氟尿嘧啶(純度99.99%)(美國(guó)sigma公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)、NP-40裂解緩沖液、結(jié)晶紫染液(碧云天生物技術(shù)研究所)；Matrigel小室(美國(guó)BD公司)；膜聯(lián)蛋白V-PE凋亡檢測(cè)試劑盒、核糖核酸酶(RNase)、碘化丙啶(PI)染色液(上海群己生物科技有限公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTM RT)(寶日醫(yī)生物技術(shù)北京有限公司)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司)；聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、硝酸纖維素膜(德國(guó)默克公司)；FAT4、YAP、β-actin一抗(美國(guó)Abcam公司)；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(上海研卉生物科技有限公司)；SuperSignal West Pico化學(xué)發(fā)光底物試驗(yàn)試劑盒(美國(guó)Pierce公司)。(2)主要儀器：UV1901型紫外分光光度計(jì)(上海奧析科學(xué)儀器有限公司)；IX71型倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；FACS Calibur型流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)；ABI 7900HT型熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 實(shí)驗(yàn)于2019年8—9月在邯鄲市中心醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。人肺癌H1975細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，批號(hào)S2019061703。將細(xì)胞置于10%FBS和1%青霉素、鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為37℃、5%CO2、2% O2、93%N2。分組設(shè)計(jì)：H1975細(xì)胞組，將H1975細(xì)胞在含有10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為37℃、5%CO2、2% O2、93%N2；5-氟尿嘧啶組，H1975細(xì)胞培養(yǎng)方法同H1975細(xì)胞組，加入5-氟尿嘧啶，使5-氟尿嘧啶劑量為100.0 μg/ml(預(yù)試驗(yàn)求得5-氟尿嘧啶對(duì)H1975細(xì)胞的LC50為200.0 μg/ml，以1/2 LC50為作用劑量)；葉黃素低、高劑量組的H1975細(xì)胞培養(yǎng)方法同H1975細(xì)胞組，各組分別加入葉黃素，使葉黃素劑量為100.0 μg/ml、200.0 μg/ml(預(yù)試驗(yàn)求得葉黃素對(duì)H1975細(xì)胞的LC50為400.0μg/ml，以1/4、1/2 LC50為低、高劑量)。以上各組每孔設(shè)6個(gè)平行樣，培養(yǎng)72 h。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 細(xì)胞存活率及克隆形成數(shù)目測(cè)定：使用CCK-8試劑評(píng)估細(xì)胞存活率。將細(xì)胞以1×103個(gè)/孔的密度接種到96孔板的100 μl培養(yǎng)基中，將100 μl CCK-8試劑添加到培養(yǎng)物中。然后用紫外分光光度計(jì)在450 nm下測(cè)量OD值。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組OD/空白組OD×100%?？瞻捉M為蒸餾水調(diào)零組。

將細(xì)胞以800個(gè)/孔的濃度接種到6孔板中72 h。然后，每3天用含有10%FBS的培養(yǎng)基更新培養(yǎng)基一次，觀察到單克隆形成。計(jì)數(shù)具有40個(gè)以上細(xì)胞的單克隆，應(yīng)用結(jié)晶紫染色，并使用顯微鏡拍攝代表性照片。

1.3.2 細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移水平測(cè)定：進(jìn)行Matrigel小室侵襲測(cè)定，將1×104個(gè)細(xì)胞添加到包被Matrigel小室(孔徑為8 μm微孔)的上腔室中。將含有10%FBS的600 μl培養(yǎng)基添加到下腔室中。固定細(xì)胞并在72 h后分別用0.05%的結(jié)晶紫染色。使用顯微鏡以200倍放大率拍攝每個(gè)腔室的6個(gè)隨機(jī)視野。

1.3.3 細(xì)胞凋亡水平測(cè)定：使用膜聯(lián)蛋白V-PE凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡。收獲預(yù)處理的細(xì)胞，在4℃的冰冷70%乙醇中固定過(guò)夜，然后重懸于1 ml含1 mg/ml RNase和50 μg/ml PI的磷酸緩沖液，并在暗盒中于室溫放置30 min，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。通過(guò)計(jì)數(shù)右上象限Annexin-V陽(yáng)性—PI陽(yáng)性細(xì)胞的比例，即為凋亡率。

1.3.4 細(xì)胞FAT4、YAP基因表達(dá)測(cè)定：通過(guò)Trizol試劑從細(xì)胞中提取總RNA。RNA的純度和濃度通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)量。用PrimeScriptTM RT試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件為37℃ 15 min逆轉(zhuǎn)錄，85℃ 5 s逆轉(zhuǎn)錄酶滅活。獲得的cDNA在-80℃保存。引物由寶日醫(yī)生物技術(shù)北京有限公司合成，序列如下，F(xiàn)AT4正向：5′-CTGTGAGTACCTGTGACTGGTGTGACCCTGT-3′，反向：5'-GTGTCTGTGTGGAVCTGAAGTGAC-3'；YAP正向：5'-CTGTGACTACCCGTCTGCCTGTGA-3'，反向：5'-CTGTGACTGCGGCGAGTGCTGA-3'；β-actin正向：5'-CTGTGACTGACCGTCTACTGTGAC-3'，反向：5'-CCGTGTGACGTCGGCGACGTGTGAC-3'。β-actin作為內(nèi)參基因。在ABI 7900HT型熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件如下：在95℃預(yù)變性30 s，在95℃下變性40 s，在58℃下退火30 s。通過(guò)2-ΔΔCt方法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3.5 細(xì)胞FAT4、YAP蛋白水平測(cè)定：NP-40裂解緩沖液提取總蛋白，并通過(guò)BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行定量。用12%SDS-PAGE電泳分離出每個(gè)樣品中的蛋白質(zhì)(50 μg)，并將其電印跡到硝酸纖維素膜上。在室溫下用5%牛奶封閉1 h后，將膜與FAT4(1∶2 000稀釋)、YAP(1∶2 000稀釋)、β-actin(1∶2 000稀釋)一抗、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(1∶5 000稀釋)在4℃孵育過(guò)夜。使用Super Signal West Pico化學(xué)發(fā)光底物試驗(yàn)試劑盒可視化標(biāo)記有抗體的蛋白條帶。使用Chemi Doc XRS系統(tǒng)獲取圖像，使用Band Scan 5.0版軟件分析蛋白質(zhì)表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 各組肺癌H1975細(xì)胞OD值、存活率比較 與H1975細(xì)胞組比較，5-氟尿嘧啶組及葉黃素低、高劑量組OD值、存活率均降低(P<0.05)；與5-氟尿嘧啶組比較，葉黃素低、高劑量組OD值、存活率升高(P<0.05)；與葉黃素低劑量組比較，葉黃素高劑量組OD值、存活率降低(P<0.05)，見表1。

2.2 各組肺癌H1975細(xì)胞克隆形成數(shù)目比較 與H1975細(xì)胞組比較，5-氟尿嘧啶組及葉黃素低、高劑量組克隆形成數(shù)目降低(P<0.05)；與5-氟尿嘧啶組比較，葉黃素低、高劑量組克隆形成數(shù)目升高(P<0.05)；與葉黃素低劑量組比較，葉黃素高劑量組克隆形成數(shù)目降低(P<0.05)，見表2、圖1。

表1 各組肺癌H1975細(xì)胞OD值、存活率比較

表2 各組肺癌H1975細(xì)胞克隆形成數(shù)目比較個(gè))

2.3 各組肺癌H1975細(xì)胞穿膜數(shù)比較 與H1975細(xì)胞組比較，5-氟尿嘧啶組及葉黃素低、高劑量組穿膜數(shù)降低(P<0.05)；與5-氟尿嘧啶組比較，葉黃素低、高劑量組穿膜數(shù)升高(P<0.05)；與葉黃素低劑量組比較，葉黃素高劑量組穿膜數(shù)降低(P<0.05)，見表3、圖2。

表3 各組肺癌H1975細(xì)胞穿膜數(shù)比較個(gè))

AH1975細(xì)胞組 5-氟尿嘧啶組 葉黃素低劑量組 葉黃素高劑量組

H1975細(xì)胞組 5-氟尿嘧啶組 葉黃素低劑量組 葉黃素高劑量組

2.4 各組肺癌H1975細(xì)胞凋亡率比較 與H1975細(xì)胞組比較，5-氟尿嘧啶組及葉黃素低、高劑量組凋亡率升高(P<0.05)；與5-氟尿嘧啶組比較，葉黃素低、高劑量組凋亡率降低(P<0.05)；與葉黃素低劑量組比較，葉黃素高劑量組凋亡率升高(P<0.05)，見表4。

表4 各組肺癌H1975細(xì)胞凋亡率比較

2.5 各組肺癌H1975細(xì)胞FAT4、YAP mRNA表達(dá)比較 與H1975細(xì)胞組比較，5-氟尿嘧啶組及葉黃素低、高劑量組FAT4 mRNA表達(dá)水平升高，YAP mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)；與5-氟尿嘧啶組比較，葉黃素低、高劑量組FAT4 mRNA表達(dá)水平降低，YAP mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)；與葉黃素低劑量組比較，葉黃素高劑量組FAT4 mRNA表達(dá)水平升高，YAP mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)，見表5。

表5 各組肺癌H1975細(xì)胞FAT4、YAP mRNA表達(dá)比較

2.6 各組肺癌H1975細(xì)胞FAT4、YAP蛋白表達(dá)比較 與H1975細(xì)胞組比較，5-氟尿嘧啶組及葉黃素低、高劑量組FAT4 蛋白表達(dá)水平升高，YAP蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)；與5-氟尿嘧啶組比較，葉黃素低、高劑量組FAT4蛋白表達(dá)水平降低，YAP蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；與葉黃素低劑量組比較，葉黃素高劑量組FAT4蛋白表達(dá)水平升高，YAP蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，見表6、圖3。

表6 各組肺癌H1975細(xì)胞FAT4、YAP蛋白表達(dá)比較

注：A.H1975細(xì)胞組；B.5-氟尿嘧啶組；

3 討 論

肺癌是全球范圍內(nèi)與癌癥相關(guān)死亡的主要原因，男性吸煙者的發(fā)病率為17.2%，女性吸煙者的發(fā)病率為11.6%，而非吸煙者分別為1.3%和1.4%[8]。肺癌以NSCLC為主，包括腺癌、鱗癌、腺鱗癌和大細(xì)胞肺癌。盡管在過(guò)去的幾十年中，人們一直在努力開發(fā)針對(duì)NSCLC的新療法，包括化學(xué)療法和分子靶向療法，但對(duì)于轉(zhuǎn)移性NSCLC患者，其5年生存率仍低于5%[9]。葉黃素是一種含氧的類胡蘿卜素，在自然界廣泛存在。葉黃素存在于許多有色水果(石榴、漿果和深色葡萄)和蔬菜(茄子、西紅柿、胡蘿卜和紅洋蔥)中，具有抗氧化劑、抗炎、抗增殖和抗癌活性。葉黃素在炎性反應(yīng)、心血管疾病、年齡相關(guān)性黃斑變性及癌癥中的有益作用已被探索[10]。研究已經(jīng)證明，葉黃素對(duì)冠心病患者具有抗炎性反應(yīng)作用，葉黃素可抑制PDGF和H2O2信號(hào)傳導(dǎo)，并抑制血管平滑肌細(xì)胞的遷移[11]。葉黃素是一種多目標(biāo)治療性天然藥物，可阻斷RTK活性及EGFR、VEGFR2的下游信號(hào)傳導(dǎo)，以提高治療癌癥效果并將對(duì)正常宿主細(xì)胞的毒性降至最低[12]。本研究結(jié)果顯示，與H1975細(xì)胞組比較，5-氟尿嘧啶組、葉黃素低劑量組、葉黃素高劑量組OD值、存活率、克隆形成數(shù)目、穿膜數(shù)均降低，凋亡率升高；與葉黃素低劑量組比較，葉黃素高劑量組OD值、存活率、克隆形成數(shù)目、穿膜數(shù)降低，凋亡率升高。說(shuō)明葉黃素能明顯抑制人肺癌細(xì)胞H1975增殖及轉(zhuǎn)移，且葉黃素高劑量組抑制人肺癌細(xì)胞H1975增殖及轉(zhuǎn)移更顯著。

Hippo信號(hào)通路是一種腫瘤抑制通路，它通過(guò)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡來(lái)調(diào)節(jié)器官的大小。該途徑主要由核心抑制激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)組成，包括MST1/2和LATS1/2，這些成分會(huì)磷酸化轉(zhuǎn)錄共激活因子YAP。一旦被激活，YAP就會(huì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，并與TEAD1-4相互作用以激活Hippo信號(hào)通路的下游靶標(biāo)，從而促進(jìn)細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[13]。FAT4是鈣黏著蛋白超家族的鈣黏著蛋白相關(guān)蛋白，是Hippo信號(hào)的調(diào)節(jié)劑和抑癌劑，可抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[14]。FAT4在肺癌中下調(diào)，并在各種人類癌癥中反復(fù)突變，涉及肝細(xì)胞癌和胃癌[15]。FAT4是Hippo生長(zhǎng)控制途徑的重要組成部分，在39%的腫瘤中被甲基化[16]。FAT1和FAT4通過(guò)激活與lamellipodia和filopodia上的肌動(dòng)蛋白聚合相關(guān)的Hippo信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)。FAT4也被指出可誘導(dǎo)YAP易位，YAP易位于胃癌的細(xì)胞增殖和遷移[17-19]。本研究結(jié)果顯示，與H1975細(xì)胞組比較，5-氟尿嘧啶組及葉黃素低、高劑量組FAT4 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高，YAP mRNA和蛋白表達(dá)水平降低；與葉黃素低劑量組比較，葉黃素高劑量組FAT4 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高，YAP mRNA和蛋白表達(dá)水平降低。這與上述討論一致，同時(shí)說(shuō)明，葉黃素可促進(jìn)FAT4 mRNA和蛋白的表達(dá)，抑制YAP mRNA和蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制Hippo通路。近期，許多研究報(bào)道了肺癌中Hippo信號(hào)的失活與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。這種失活也被證明會(huì)導(dǎo)致Hippo通路下游基因如CTGF、CYR61、FOXM1和CDX2的上調(diào)，而這些基因是否會(huì)在肺癌中改變，將在后續(xù)研究中進(jìn)行證實(shí)。

綜上所述，葉黃素能明顯抑制人肺癌細(xì)胞H1975增殖及轉(zhuǎn)移；其機(jī)制與葉黃素可促進(jìn)FAT4 mRNA和蛋白表達(dá)、抑制YAP mRNA和蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制Hippo通路有關(guān)。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

楊謙：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過(guò)程，論文撰寫；楊蒙蒙：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核；張軍：實(shí)施研究過(guò)程，資料搜集整理，論文修改；譚雪敏：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；馬玉泉：課題設(shè)計(jì)，論文撰寫