邸元帥，徐秀林，紀(jì)春陽

(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093)

1 引 言

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)存在于人類外周血中，但數(shù)量極少，1mL血液中血細(xì)胞的含量約109個(gè)，而CTCs只有1～100個(gè)[1-2]，對(duì)CTCs進(jìn)行精確檢測(cè)，可對(duì)腫瘤進(jìn)行早期預(yù)防和精準(zhǔn)治療并判斷預(yù)后[3-5]。而CTCs分選的效果會(huì)直接影響后續(xù)的檢測(cè)結(jié)果，因此，建立一種精準(zhǔn)分選CTCs的方法非常重要。微流控技術(shù)[6-8]是一種在微米尺寸的流道內(nèi)對(duì)納升或者皮升量級(jí)的液體進(jìn)行操縱或控制的技術(shù)，其特點(diǎn)是低試劑樣本消耗、快速、低成本、高通量、使用簡便等[9]。

慣性分選是一種靠不同粒徑的粒子在流道內(nèi)受慣性升力和Dean曳力共同作用下，在微流控芯片中橫向的不同位置達(dá)到平衡，從而達(dá)到分選富集目的的分選方法，該方法可以實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分選富集。近年來，研究者針對(duì)如何利用慣性分選高效、精準(zhǔn)地分選CTCs進(jìn)行了大量的研究。Hou等[10]提出一種單螺旋通道微流控芯片，在3 mL/h的流速下該芯片的回收率大于85%；Li等[11]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，“Dean數(shù)”相同時(shí)，彎流道的“寬高比”越小(即管道高度越大)，粒子聚集點(diǎn)位置離彎管內(nèi)側(cè)越遠(yuǎn)；粒子相對(duì)直徑越大，其聚集點(diǎn)位置離彎管內(nèi)側(cè)越近。目前，“小寬高比”微管道常被用來分離10、15、20 μm直徑的粒子；Sun等[12]采用雙螺旋結(jié)構(gòu)分離全血液中的MCF-7及HeLa細(xì)胞，該雙螺旋結(jié)構(gòu)可以視作兩條螺旋流道在中間由“S”型結(jié)構(gòu)連接而成。

本研究設(shè)計(jì)了一種微流控芯片，用于分選富集外周血液中的CTCs，通過Ansys fluent仿真軟件對(duì)其分選性能進(jìn)行模擬，根據(jù)模擬結(jié)果設(shè)計(jì)微流控芯片，并通過試驗(yàn)驗(yàn)證該芯片對(duì)CTCs的分選富集效果。

2 微流體技術(shù)

均勻分布著某些特定粒徑粒子的流體以低雷諾(Re)數(shù)流入直圓管，流過足夠長的距離后，流體中的粒子會(huì)穩(wěn)定地聚集在某一半徑的同心圓環(huán)上隨流向運(yùn)動(dòng)[13]。這表明粒子在低雷諾(Re)數(shù)直管內(nèi)運(yùn)動(dòng)時(shí)，除了受到流體沿流動(dòng)方向的驅(qū)動(dòng)力以外，還受到垂直于流向的橫向升力，發(fā)生橫向遷移。該橫向升力被稱為“慣性升力”[14]。對(duì)于“慣性升力”，利用攝動(dòng)法中的“漸近匹配展開方法”對(duì)流動(dòng)控制方程N(yùn)S方程(Navier-Stokes方程)求近似解[15-18]，可獲得粒子在層流通道內(nèi)的力學(xué)特征。研究發(fā)現(xiàn)，慣性升力是由剪切誘導(dǎo)升力和壁面誘導(dǎo)升力組成的，其關(guān)系式為：

FL=fL(Re，xL)·ρU2a4/Dh2

(1)

其中，fL(Re,xL)是升力系數(shù)，與流場Re數(shù)及顆粒所在徑向位置x有關(guān)，ρ是液體密度，a是粒子直徑，U是流體的特征流速，Dh是通道的特征尺寸，Dh=4wh/2(w+h)w是通道的寬度，h是通道的高度。由式(1)可知，粒子直徑對(duì)慣性升力有著顯著的影響，是決定粒子在流道內(nèi)平衡位置的主要因素。

在彎曲流道內(nèi)，除了受直流道內(nèi)的慣性升力的作用，還受Dean渦流的拖曳作用，Dean渦流是垂直于流動(dòng)方向，沿著流道中心上下分布的兩個(gè)旋轉(zhuǎn)方向相反的回旋流，由于Dean渦流的拖曳作用，會(huì)使粒子受到一個(gè)作用力，稱為Dean曳力。Dean曳力的大小與無量綱數(shù)Dean數(shù)(De)有關(guān)：

(2)

這里，R是彎曲流道的曲率半徑。這個(gè)渦流產(chǎn)生的Dean曳力FD可以認(rèn)為是斯托克斯曳力，計(jì)算公式為[19]：

FD=ρU2aDh2/R

(3)

綜上可知，粒子在彎曲流道內(nèi)的平衡位置是由慣性升力和Dean曳力共同決定的，見圖1。當(dāng)FL大于FD時(shí)，粒子向流道內(nèi)壁運(yùn)動(dòng)；當(dāng)FL小于FD時(shí)，粒子向流道外壁運(yùn)動(dòng)；當(dāng)FL等于FD時(shí)，粒子在流道內(nèi)保持平衡。

圖1 粒子在彎曲管道內(nèi)受力示意圖

3 數(shù)值模擬

3.1 仿真

使用SolidWorks軟件建立了雙螺旋流道的三維模型，并采用Ansys Fluent 17.0對(duì)該芯片分選過程進(jìn)行仿真模擬。模型建好后進(jìn)行網(wǎng)格劃分，并將其導(dǎo)入Fluent 17.0中進(jìn)行物理場的設(shè)置和計(jì)算，為了研究流體對(duì)粒子的作用結(jié)果，需要導(dǎo)入離散相模型(discrete phase model，DPM)。導(dǎo)入DPM模型后，對(duì)芯片的邊界條件進(jìn)行設(shè)定，芯片入口的邊界條件設(shè)置為：流體流速分別設(shè)置為10、20、30、40 mL/h，芯片出口的邊界條件為恒壓，流道的管壁條件為反彈。此外，根據(jù)血液中紅細(xì)胞大小約為8 μm、白細(xì)胞大小約為12 μm、循環(huán)腫瘤細(xì)胞大小約為20 μm，故在仿真過程中我們?cè)O(shè)置三種粒子直徑分別為8、12、20 μm。粒子數(shù)量設(shè)置為與入口面網(wǎng)格數(shù)相同，每種粒子都有56個(gè)。采用二階迎風(fēng)格式求解無顆粒流場的納維-斯托克斯方程，并采用SIMPLEC算法求解壓力-速度耦合問題后，進(jìn)行迭代計(jì)算，見圖2，計(jì)算收斂得到穩(wěn)態(tài)流場后，將其解作為DPM模型的輸入，求解粒子在流道內(nèi)的運(yùn)動(dòng)軌跡，粒子軌跡符合牛頓第二定律，由施加在粒子上的作用力計(jì)算得出粒子運(yùn)動(dòng)的加速度為[20]：

(4)

3.2 結(jié)果

經(jīng)過迭代計(jì)算收斂后，仿真結(jié)果見圖3。由圖可見，流速在10 mL/h時(shí)，三種粒子不能分離；流速在20～40 mL/h時(shí)，20 μm粒子和8 μm、12 μm粒子可以完全分離，但流速在40 mL/h時(shí)，會(huì)有大量粒子無法逃出，所以20 mL/h和30 mL/h可以達(dá)到粒子分離的目的，為了減少試驗(yàn)時(shí)間，我們需要相對(duì)較高的流速，所以30 mL/h為最佳分選流速。

圖2 計(jì)算收斂圖

圖3 各流速下的仿真模擬結(jié)果

3.3 芯片設(shè)計(jì)

微流控芯片設(shè)計(jì)為正反共12圈的雙螺旋結(jié)構(gòu)，見圖4。為了提高芯片的分選效率，芯片寬度為340 μm，高度為100 μm，以降低寬高比。在此寬高比的流道內(nèi)，粒子在運(yùn)動(dòng)過程中，在FL和FD的作用下，沿流道寬度方向運(yùn)動(dòng)至平衡。

4 實(shí)驗(yàn)研究

4.1 樣本預(yù)處理

采用由上海津復(fù)生物科技有限公司提供的MDA-MB-453系細(xì)胞為試驗(yàn)系細(xì)胞，將細(xì)胞混懸于含有10%的胎牛血清和1%青霉素—鏈霉素的培養(yǎng)基中，并置于37℃、5%CO2的環(huán)境中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞系作為粘附單層培養(yǎng)至與培養(yǎng)瓶壁面積95%貼合時(shí)，用1 mL的0.25%胰蛋白酶(trypsin)溶液溶解MDA-MB-453系細(xì)胞與培養(yǎng)瓶壁之間的蛋白結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中溶解下來，分離時(shí)間2 min。在離心機(jī)中1 200 rpm離心3 min以去除培養(yǎng)基；加入1 mL PBS緩沖液進(jìn)行清洗；再次離心去除上清液后，加入1 mL PBS重懸。添加1 μLCFSE(綠色)熒光染料，室溫靜置15 min進(jìn)行細(xì)胞染色。染色后的MDA-MB-453系細(xì)胞將被分別添加到各個(gè)實(shí)驗(yàn)的溶液中，各溶液中均添加有抗凝劑(EDTA2K)和胰酶(trypsin)。實(shí)驗(yàn)前，將染色后的MDA-MB-453系細(xì)胞分別添加到配置好的PBS緩沖液及外周血樣本溶液中，均稀釋至1 mL溶液中，約含有100個(gè)腫瘤細(xì)胞，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次取樣1 mL，見圖5。

圖4 微流控芯片結(jié)構(gòu)

圖5 樣本

4.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)樣本準(zhǔn)備好后，開始搭建試驗(yàn)平臺(tái)，見圖6，將微流控芯片放在顯微鏡下。首先使用PBS緩沖液進(jìn)行預(yù)沖洗，確保試驗(yàn)臺(tái)各部件無漏液。然后取1 mL稀釋后的樣本溶液，使用壓力泵將待測(cè)樣品通過tygon軟管引入微流控芯片，通過調(diào)節(jié)泵的參數(shù)，精確地控制微流道內(nèi)的流速分別為10、20、30、40 mL/h。分選結(jié)束后，測(cè)定與出口相連接的離心管中回收的溶液體積，并分別計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞數(shù)量。單位體積中的細(xì)胞數(shù)量乘以總體積，即為從每個(gè)通道出口獲得的腫瘤細(xì)胞總數(shù)。需要注意的是，每次試驗(yàn)后都要用PBS緩沖液對(duì)微流道進(jìn)行沖洗，并對(duì)細(xì)胞混合液進(jìn)行生化預(yù)處理，以保證細(xì)胞不發(fā)生團(tuán)聚、貼壁現(xiàn)象，使腫瘤細(xì)胞在混合液中處于懸浮狀態(tài)。得到CTCs收集液后，采用計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，每次每孔取樣100 μL，取三次，將其置于Leica Dmi8倒置熒光顯微鏡下觀察，采用型號(hào)為DFC450C的CCD相機(jī)將曝光時(shí)間調(diào)為200 ms，獲得熒光細(xì)胞圖像。

圖6 試驗(yàn)裝置

4.3 試驗(yàn)結(jié)果

在試驗(yàn)過程中，截取了暗場條件下流速在10、20、30和40 mL/h時(shí)芯片分選口處的圖片，見圖7。由圖可知，流速在10～20 mL/h時(shí)，CTCs隨著血液中其它細(xì)胞一起從廢液口流出，只有少量CTCs從收集口流出；而流速為30 mL/h時(shí)，CTCs可以與其他細(xì)胞完全分離；當(dāng)流速達(dá)到40 mL/h時(shí)，由于流速過快，血液中的其他細(xì)胞也會(huì)與CTCs一起從收集口流出，從而影響CTCs的分選富集率，而且此時(shí)細(xì)胞開始發(fā)生貼壁現(xiàn)象，導(dǎo)致CTCs在試驗(yàn)過程中發(fā)生損耗。

圖7 各流速芯片分選口的分選情況

對(duì)不同流速下微流控芯片的分選結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見表1和圖8。

表1 各流速下CTCs分選率

圖8 各流速下CTCs分選率

試驗(yàn)結(jié)果表明，芯片內(nèi)流體的流速在10～30 mL/h之間時(shí)，其分選率逐漸增加，當(dāng)流速達(dá)到40 mL/h 時(shí)，分選率開始下降。10 mL/h時(shí)分選率為44%，20 mL/h時(shí)分選率為61%，30 mL/h時(shí)分選率為77%，40 mL/h時(shí)分選率為69%。

4 總結(jié)與展望

本研究開發(fā)了一種用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞高效分選的微流控芯片，用Ansys fluent軟件進(jìn)行仿真，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該芯片可有效地從人的全血中分選出CTCs，且進(jìn)樣速度達(dá)到30 mL/h時(shí)，最高分選率可以達(dá)到77%。對(duì)分選得到的CTCs可以進(jìn)行基因組和轉(zhuǎn)錄組的功能分析，為生命科學(xué)領(lǐng)域、遺傳學(xué)領(lǐng)域內(nèi)單細(xì)胞測(cè)序和基因分析等研究提供重要的細(xì)胞材料，繼而為臨床患者提供精準(zhǔn)的用藥指導(dǎo)。

目前在本研究中，對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分選仍有一些問題需要解決，如：血液中的白細(xì)胞濃度較高、一些白細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞尺寸相近、PDMS與玻璃的鍵合技術(shù)不成熟導(dǎo)致芯片開膠等。因此，如何降低白細(xì)胞對(duì)分選結(jié)果的影響以及改進(jìn)芯片的加工工藝、提高芯片質(zhì)量將有待進(jìn)一步研究。