付鵬程， 林清銀， 孫姍姍

(洛陽師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院， 洛陽 471934)

龍膽屬植物是典型的高山植物，以青藏高原及其周邊地區(qū)為分布中心和分化中心[1-2]。線葉龍膽(Gentianalawrenceivar.farreriT. N. Ho)是龍膽屬多枝組中的常見物種，多年生草本，是青藏高原特有植物，也是高山草甸的重要組成部分。線葉龍膽可用于醫(yī)藥，具有較高的藥用價值；同時其花色素雅，形態(tài)優(yōu)美，也具有較高的園藝觀賞價值。已有的進(jìn)化研究表明，線葉龍膽的葉綠體基因組存在ndh基因缺失[3]；基于葉綠體片段和微衛(wèi)星標(biāo)記的群體研究表明，該物種目前的遺傳格局受到了冰川運(yùn)動及環(huán)境氣候變化的顯著影響[4]。

ITS序列(Nuclear ribosomal internal transcribed spacer)是核糖體RNA 18S、5.8S和25S的間區(qū)序列，分別為ITS1和ITS2，其中ITS1-5.8S-ITS2序列是進(jìn)化生物學(xué)中常用的分子標(biāo)記之一[5-6]。相較于葉綠體或線粒體的單親遺傳，ITS序列位于細(xì)胞核，遵循雙親遺傳規(guī)律，在揭示種間雜交等復(fù)雜進(jìn)化過程中具有重要作用。由于ITS位點(diǎn)的通用引物在不同物種中均易于擴(kuò)增，且其基因間區(qū)的序列變異較大，是重要的barcoding標(biāo)記之一[5]，能較好地反映種間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。ITS序列在物種居群內(nèi)往往也存在較豐富的變異，可用于群體遺傳學(xué)研究[7-8]。然而，由于ITS序列常存在雜合現(xiàn)象，經(jīng)PCR擴(kuò)增后直接Sanger法測序的結(jié)果常出現(xiàn)套峰或亂峰，導(dǎo)致無法準(zhǔn)確獲取部分物種的序列。

本研究以線葉龍膽的7個居群為研究對象，通過對部分個體進(jìn)行基因克隆與測序，探討線葉龍膽ITS序列的基本特征及其遺傳分化，研究結(jié)果將為龍膽屬植物的進(jìn)化研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

在青海、四川和西藏等地采集線葉龍膽7個居群共39個個體。在居群內(nèi)，每個個體間距至少10 m；選取幼嫩的葉子用干燥硅膠快速干燥，密封保存于-20 ℃中。

1.2 DNA提取與PCR擴(kuò)增

用CTAB法[9]提取總DNA，用1%瓊脂糖檢測。選用通用的ITS1a-ITS4引物[10]進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系和擴(kuò)增反應(yīng)見表1，得到線葉龍膽的ITS1-5.8S-ITS2序列。將PCR產(chǎn)物純化后用ABI3730xl(Applied Biosystems, USA)進(jìn)行雙端測序，發(fā)現(xiàn)測序結(jié)果存在嚴(yán)重的套峰和亂峰，可能存在高度的雜合性。

1.3 分子克隆與測序

為解決序列雜合性問題，將PCR產(chǎn)物用MiniBEST膠回收試劑盒(TaKaRa, China)回收，1%瓊脂糖電泳檢測，用分光光度計(jì)NanoDrop 2000(Thermo Scientific, USA)測定濃度后，與pMD 18-T載體(TaKaRa, China)在16 ℃連接4 h，5 μL反應(yīng)體系如下：載體50 ng，PCR純化產(chǎn)物20 ng, Solution I 1.0 μL。連接后的產(chǎn)物與E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞(Takara, 大連)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，操作參見產(chǎn)品說明書。37 ℃培養(yǎng)1 h后涂平板做藍(lán)白斑篩選，37 ℃倒置過夜培養(yǎng)。每個樣品挑取3～10個陽性單克隆在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)3～5 h，對菌液做PCR檢測，反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序見表1。陽性克隆用BigDye v3.1(Applied Biosystems, USA)和ABI3730xl(Applied Biosystems, USA)測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

在軟件GENEIOUS PRO 3.5.6[11]中查看測序結(jié)果，去掉載體序列，進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和比對。在軟件DnaSP 5.1[12]中統(tǒng)計(jì)單倍型個數(shù)，在ARLEQUIN 3.5[13]中計(jì)算基因多態(tài)性(h)與核苷酸多態(tài)性(π)，并通過分子變異分析(AMOVA)[14]檢測遺傳變異在居群內(nèi)和居群間的分布情況。

采用最大似然法，在IQ-TREE[15]中基于單倍型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，核苷酸替換模型由IQ-TREE自動計(jì)算，設(shè)置bootstrap為100。參照龍膽屬的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[2]，從GenBank中下載序列，以線葉龍膽的近緣類群藍(lán)玉簪龍膽(AY858677)，以及龍膽屬秦艽組的麻花艽(MF579734)、粗莖秦艽(MF506958)和粗壯秦艽(KM190185)，龍膽屬龍膽草組的三花龍膽(KM051451)和一年生類群的鉆葉龍膽(AY858671)為外類群。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列特征

本研究對來自7個居群的39個個體進(jìn)行基因克隆與測序，共得到81條ITS序列，長度為631～646 bp。這些序列在175個位置存在堿基變異，包含153個堿基突變和23個缺失/插入，共鑒定出76個單倍型(GenBank No. MN124292-MN124367, 表2)。在153處堿基突變中，兩種堿基間的突變有142處，3種堿基間的突變有11處，分別占92.8%和7.2%。缺失/插入的堿基片段長度從1～14 bp，其中14 bp的缺失/插入只出現(xiàn)在居群6025的一個個體(6025_8)中。在這些線葉龍膽ITS序列中，堿基變異主要來源于ITS1和ITS2這兩個間區(qū)，分別包含67處和76處變異，分別占總變異位點(diǎn)的38.28%和43.43%；5.8S核糖體RNA長度為156 bp，其中包含31個單堿基突變和1個14 bp的缺失/插入，占所有變異位點(diǎn)數(shù)的18.29%。這種高度雜合性，說明在線葉龍膽中對ITS序列的PCR產(chǎn)物直接測序是無法得到高質(zhì)量結(jié)果的。

在鑒定出的76個單倍型中，僅有2個單倍型在多個克隆中共享，剩余74個單倍型均為單個克隆特有。在共享的2個單倍型中，一個單倍型分布于4123居群的2個個體中，另一個單倍型分布于6025居群的1個個體和6039居群的3個個體中。

2.2 遺傳多樣性與遺傳分化

本研究中，線葉龍膽7個居群的基因多態(tài)性為0.9429～1，核苷酸多態(tài)性為0.007 924～0.034 529，遺傳多樣性高，但居群間的差異小(表2)。AMOVA分析表明，遺傳變異中的87.61%來自居群內(nèi)，僅有12.39%的遺傳變異來自居群間(表3)。由于幾乎每條序列均為一種單倍型，因此用個體名稱來描述系統(tǒng)發(fā)育樹，并將不同居群用顏色加以區(qū)分，以考察居群間是否存在譜系關(guān)系。結(jié)果顯示，線葉龍膽ITS序列構(gòu)成了5個遺傳支系，但不同支系的支持率普遍較低，其中低于60%的支持率在圖中均未標(biāo)注(圖1)。同一居群的不同個體在系統(tǒng)發(fā)育樹上并不能聚到一支，而是分散于發(fā)育樹中。

表3 基于ITS序列的線葉龍膽分子變異分析

3 討論與結(jié)論

通過基因克隆，本研究發(fā)現(xiàn)線葉龍膽居群內(nèi)ITS序列存在高度的雜合性和遺傳分化，具體主要表現(xiàn)在兩個方面。一是變異位點(diǎn)非常豐富。在線葉龍膽長度為646 bp的ITS序列中，變異位點(diǎn)占比27.24%，顯著高于青藏高原的其他特有物種[7,16-18]。相較于基于葉綠體片段得到的遺傳多樣性指數(shù)[3]，本研究的研究結(jié)果明顯高于前者。二是個體間共享的單倍型少。在已鑒定的76個單倍型種，僅有2個共享單倍型，個體間以及居群間的遺傳分化大，AMOVA的分析結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。

每個單倍型用個體標(biāo)號表示；若一個單倍型為多個個體共享時，圖中用“/”分隔；同一居群的個體用同一種顏色標(biāo)注

對于線葉龍膽居群中ITS序列的高度雜合性，可能有如下3個原因。一是擴(kuò)增與測序錯誤。本研究采用的一代測序方法，即Sanger測序法，是目前準(zhǔn)確率最高的測序方法之一，常用于高通量測序結(jié)果的驗(yàn)證。然而，由于聚合酶存在一定的錯配率，通過PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物可能存在一些人為突變，尤其是擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)過大時錯誤率會增高，而測序過程本身也包括了一次PCR擴(kuò)增。因此，測序錯誤是客觀存在的，但錯誤率一般很低[18]。然而，本研究所檢測的個體，均出現(xiàn)了大量的堿基替換以及缺失，且其頻率遠(yuǎn)大于測序錯誤率，因此我們可以排除測序錯誤這一因素。二是核基因的雜合性。ITS序列是雙親遺傳，雜合性是其特征之一。雖然在部分物種中ITS序列基本上為純合，如石礫唐松草[8]等；但由于重組和自然雜交，ITS雜合性在生物中是普遍存在的，如菊葉紅景天[3]、鮮卑花屬[17]等。然而已報(bào)道的ITS序列在居群中的雜合性多為堿基突變，缺失與插入報(bào)道較少，而在本研究中發(fā)現(xiàn)個體內(nèi)存在長達(dá)14 bp的缺失與插入。三是純化選擇不完全。由于ITS是串聯(lián)重復(fù)序列，在生物體內(nèi)存在大量的拷貝，經(jīng)過長期的進(jìn)化作用，生物體內(nèi)的ITS串聯(lián)序列一般是純合的。然而，若串聯(lián)序列在復(fù)制過程中出現(xiàn)變異，且純化選擇不完全時，一個個體內(nèi)就會出現(xiàn)多種變異類型共存的情況。線葉龍膽的ITS序列的雜合度很高，可能是由核基因特性與不完全的純化選擇共同導(dǎo)致的。

ITS序列作為常用的分子標(biāo)記片段之一，廣泛用于系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建和群體遺傳結(jié)構(gòu)分析。然而，在處理ITS雜合序列時，如果人工選取某一條序列或采用PHASE方法[19]進(jìn)行分型，都無法得到個體內(nèi)ITS序列的真實(shí)情況。由于同一個個體的不同單倍型在系統(tǒng)發(fā)育樹上并不能聚成單系群，因此從同一個個體內(nèi)的單倍型中選取一個來代表該個體的做法可能會影響系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系重建及相關(guān)進(jìn)化分析。雖然本研究中線葉龍膽ITS序列并未形成高支持率的支系結(jié)構(gòu)，但不同個體間很少共享單倍型，而居群間共享的單倍型更少，隨機(jī)取樣仍可能給后續(xù)分析產(chǎn)生影響。盡管本研究對每個個體測序的單克隆數(shù)目有限，不足以覆蓋全部的變異類型，但已充分說明線葉龍膽的 ITS序列存在高度的雜合性和豐富的遺傳變異。因此，對于ITS序列存在高度雜合的物種，深入的克隆與測序工作是有必要的。