王鑫 陳曉 時(shí)海波 楊恒 張新笑 徐為民 鄒燁 王道營(yíng) 苗穎

摘要：動(dòng)物膽汁作為藥物使用已有幾千年的歷史，伴隨科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，動(dòng)物膽汁中活性成分膽汁酸的研究也逐步深入，本文介紹了不同動(dòng)物膽汁的主要膽汁酸成分，尤其是鵝去氧膽酸和熊去氧膽酸及其藥理作用。就膽汁酸的分離提純方法、理化性質(zhì)及測(cè)定方法展開討論，并對(duì)鵝去氧膽酸和熊去氧膽酸的藥理作用展開綜述。

關(guān)鍵詞：膽汁酸;鵝去氧膽酸;熊去氧膽酸;制備與提純;藥理作用

中圖分類號(hào)： R284;R285文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）18-0036-08

收稿日期：2019-09-06

基金項(xiàng)目：國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（肉雞）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（編號(hào)：CARS-41）;國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31901612）;江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號(hào)：CX（18）1006];江蘇省自然科學(xué)基金（編號(hào)：BK20180300）。

作者簡(jiǎn)介：王?鑫（1994—），男，江蘇南通人，碩士研究生，研究方向?yàn)閯?dòng)物源副產(chǎn)物綜合利用及高值化開發(fā)。E-mail：937411786@qq.com。

通信作者：鄒?燁，博士，副研究員，研究方向?yàn)閯?dòng)物源副產(chǎn)物綜合利用及高值化開發(fā)。E-mail：zouye@jaas.ac.cn。

膽汁味苦黏稠，pH值約為7.4，具有明目、消腫、清熱解毒等功效[1]。動(dòng)物膽汁作為藥物使用已有數(shù)千年，《中華本草》和《本草綱目》中都記錄了幾十種動(dòng)物膽汁，包含畜類動(dòng)物豬、牛、羊，禽類動(dòng)物雞，及其他動(dòng)物如熊、蛇、兔等的膽汁。不同動(dòng)物的膽汁化學(xué)成分不同，其主要成分是50%～70%的膽汁酸，除膽汁酸外還含有一些膽色素、脂類、黏蛋白、無機(jī)物、氨基酸、常量元素及微量元素。膽汁的主要生理功能來自于膽汁酸，為了更好地利用動(dòng)物膽汁的藥用價(jià)值，國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)其化學(xué)成分及藥理作用做了大量的研究[2]。近年來膽汁酸被充分應(yīng)用于醫(yī)療食品等行業(yè)，消費(fèi)者對(duì)膽汁酸制品的需求也越來越大。因此，動(dòng)物膽汁酸的分離提純方法及藥理作用的研究就顯得格外重要，如何高效廉價(jià)地得到動(dòng)物膽汁酸也是相關(guān)科研人員一直研究的問題。

1?動(dòng)物膽汁研究

膽汁在傳統(tǒng)中醫(yī)藥的應(yīng)用有很長(zhǎng)的歷史，其主要應(yīng)用于預(yù)防疾病。研究人員為了充分利用現(xiàn)有的動(dòng)物膽汁資源，對(duì)不同動(dòng)物膽汁中的膽汁酸和膽紅素等物質(zhì)進(jìn)行化學(xué)分析，相關(guān)科研人員對(duì)于膽汁的藥理活性研究也在逐步加深。

目前對(duì)于禽類動(dòng)物膽汁研究最為廣泛的是雞膽汁。雞膽汁呈墨綠色，有一定的黏性，能夠溶于水。臨床上雞膽汁具有瀉肺火利肺氣、清熱解毒明目、溶解膽結(jié)石、促進(jìn)消化吸收的功能，也可用于治療瘧疾、百日咳。雞膽汁的主要成分為膽汁酸（膽酸、去氧膽酸、鵝去氧膽酸等），另外雞膽汁中還含有鉀、鈉、鈣、鎂等金屬元素，以及一些氨基酸[3]。

畜類動(dòng)物膽汁中對(duì)豬膽、羊膽、牛膽研究較多。豬膽是豬科動(dòng)物的膽汁，豬膽汁性苦味寒，具有止咳平喘、清肝膽熱、通便解毒的功能，通常用于導(dǎo)腸通便，清肝明目[4]。以豬膽汁作為原料經(jīng)過干燥等加工過程而生產(chǎn)的豬膽粉的主要成分是豬去氧膽酸。羊膽汁是綿羊或者山羊的膽汁，具有清肝明目、清熱解毒、潤(rùn)肺抗菌的作用?，F(xiàn)代化學(xué)分析表明，羊膽汁中含有膽酸鹽、水分、色素、無機(jī)鹽、蛋白質(zhì)等[5]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)通常將羊膽汁臨床應(yīng)用于抗炎、抑菌、治療肺結(jié)核，也用于治療喉頭紅腫、肝熱目赤、黃疸等疾病。牛膽汁是常見?？苿?dòng)物水?；蛘唿S牛的膽汁。它具有解毒消腫、利膽通腸、清肝明目的作用，臨床應(yīng)用于治療消化不良及便秘，促進(jìn)脂肪消化，鎮(zhèn)靜或麻醉中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，水分、色素、無機(jī)鹽、膽固醇、脂肪和膽酸鹽是牛膽汁的主要成分[6]。

文獻(xiàn)表明，科研人員對(duì)熊、蛇、兔等其他動(dòng)物的膽汁也有相關(guān)的研究。熊膽汁是除了畜類、禽類膽汁外被科研人員研究最多的膽汁，是熊科動(dòng)物黑熊或棕熊的膽汁。熊膽作為藥源最早記錄于唐朝的《新修本草》中，是我國(guó)四大珍稀動(dòng)物藥材之首。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，熊膽汁中主要有效成分是熊去氧膽酸，此外熊膽汁中還含有膽酸、鵝去氧膽酸、膽固醇、膽紅素和許多無機(jī)鹽離子[7]。蛇膽汁的主要成分是膽汁酸、膽色素、膽固醇、氨基酸、無機(jī)鹽和磷等。根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，蛇膽的多種藥理效應(yīng)和生理功能來源于膽汁酸，?；悄懰崾谴蠖鄶?shù)蛇膽的主要成分[8]。近年來，我國(guó)兔子養(yǎng)殖行業(yè)發(fā)展迅速，產(chǎn)生了大量的兔膽汁。這些兔膽資源通常作為廢料被丟棄從而造成巨大的浪費(fèi)，同時(shí)對(duì)環(huán)境造成了一定的污染，為了實(shí)現(xiàn)資源的有效利用，降低對(duì)環(huán)境的污染，許多研究人員將注意力轉(zhuǎn)向兔膽汁的利用與開發(fā)。經(jīng)研究表明，兔膽汁的主要成分為膽酸、去氧膽酸、鵝去氧膽酸、膽色素等[9]。

2?膽汁酸研究

膽汁酸的結(jié)構(gòu)是以膽烷酸為母核，根據(jù)膽烷酸取代基位置和數(shù)目的不同構(gòu)成了不同結(jié)構(gòu)的膽汁酸[10]。膽汁酸對(duì)動(dòng)物的代謝有很大作用[11]，在動(dòng)物體內(nèi)通常以鈉鹽或者鉀鹽的形式存在，按其結(jié)構(gòu)可以分為兩大類：游離型膽汁酸和結(jié)合型膽汁酸[12]。結(jié)合型膽汁酸的形成是由于氨基化合物與膽酸結(jié)合在一起，主要是甘氨酸（Gly）和牛磺酸（Tau）與游離型膽汁酸結(jié)合而形成的。而根據(jù)來源的不同膽汁酸又可以分為初級(jí)膽汁酸、次級(jí)膽汁酸和三級(jí)膽汁酸。初級(jí)膽汁酸（primary bile acid）由膽固醇直接合成，包含膽酸、鵝去氧膽酸以及相應(yīng)的結(jié)合型膽汁酸;次級(jí)膽汁酸（secondary bile acids）是初級(jí)膽汁酸經(jīng)過腸道菌酶的催化，脫去羥基轉(zhuǎn)化而成，次級(jí)膽汁酸包括去氧膽酸和石膽酸;三級(jí)膽汁酸（tertiary bile acid）是次級(jí)膽汁酸經(jīng)過肝臟和腸道的重吸收作用后所得的產(chǎn)物，熊去氧膽酸就是典型的三級(jí)膽汁酸。膽汁酸的結(jié)構(gòu)通式見圖1、表1。膽汁酸有很多種，其中較為重要的是膽酸、鵝去氧膽酸、熊去氧膽酸等。在動(dòng)物膽汁中，鵝去氧膽酸通常不以游離態(tài)存在，而是與?；撬岷透拾彼嵝纬山Y(jié)合物而存在。當(dāng)人或動(dòng)物的肝發(fā)生病變時(shí)，體內(nèi)以結(jié)合態(tài)存在的鵝去氧膽酸會(huì)轉(zhuǎn)化為游離態(tài)[13]。大多數(shù)動(dòng)物膽汁內(nèi)都不含有熊去氧膽酸，但其良好的生物活性及藥理作用吸引了眾多研究者的關(guān)注。下面著重介紹一下鵝去氧膽酸和熊去氧膽酸的研究進(jìn)展。

2.1?鵝去氧膽酸

2.1.1?鵝去氧膽酸的理化性質(zhì)

鵝去氧膽酸，化學(xué)名為3α，7α-二羥基-5-β-膽烷酸，分子式 C24H40O4，其結(jié)構(gòu)見圖2。鵝去氧膽酸的分子量為 392.56，味苦，無臭，呈白色針狀結(jié)晶，屬于酸性化合物。鵝去氧膽酸幾乎不溶于水、石油醚和苯等，微溶于三氯甲烷，易溶于甲醇、乙醇、冰乙酸，熔點(diǎn)為 167～171 ℃，比旋光度為10°～13°，是大多數(shù)動(dòng)物膽汁的主要膽汁酸。鵝去氧膽酸是一種甾體化合物，包含一個(gè)剛性的甾環(huán)和一個(gè)5碳的脂肪側(cè)鏈，共24個(gè)碳原子，順式稠合甾核的A環(huán)和B環(huán)而形成一個(gè)凹腔，位于3位和7位上的一個(gè)α羥基都指向凹面，與側(cè)鏈上的羥基組合形成α面，從而表現(xiàn)出親水性;而3個(gè)疏水的甲基則指向另一面，形成了憎水的β面，由此產(chǎn)生了水/脂雙親特性[14]。

2.1.2?鵝去氧膽酸的制備與提純

目前市場(chǎng)上的鵝去氧膽酸來源有以下2種，一是從動(dòng)物膽汁中提取，二是化學(xué)合成?？捎糜谥苯犹崛※Z去氧膽酸的動(dòng)物膽汁有豬膽汁、雞膽汁和鴨膽汁，但絕大部分從動(dòng)物膽汁中提取的鵝去氧膽酸都是以雞膽汁為原料[15]。提取方法主要是樹脂法、超臨界萃取法、有機(jī)溶劑提取法和沉淀法?；瘜W(xué)合成法通常以膽酸、去氧膽酸和豬去氧膽酸為原料。

樹脂法是一種利用大孔樹脂來提取鵝去氧膽酸的方法。Wan等通過使用大孔樹脂吸附層析法分離純化出鵝去氧膽酸，首先將鴨膽汁用氫氧化鈉皂化，再加入氯化鈣使膽汁中的鵝去氧膽酸形成鵝去氧膽酸的鈣鹽，使用碳酸鈉沉淀鈣離子，得到了游離的鵝去氧膽酸[15]。通過大孔樹脂HZ-802純化，用50%和60%的乙醇梯度洗脫，最終得到了純度為99%、熔點(diǎn)為160～170 ℃的鵝去氧膽酸。該方法因?yàn)榫哂薪?jīng)濟(jì)環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。席曉志等使用價(jià)格便宜、能重復(fù)利用且對(duì)鵝去氧膽酸有強(qiáng)吸附力的大孔樹脂D101優(yōu)化了鵝去氧膽酸的提取和純化工藝，使用活性炭將鵝去氧膽酸粗提物回流脫色2 h，45%乙醇溶解上樣，用55%和75%的乙醇洗脫得到鵝去氧膽酸[16]。

超臨界萃取是一種新技術(shù)，因它具有選擇性好、清潔、高效等優(yōu)點(diǎn)而被使用到鵝去氧膽酸的提取分離。該方法不但有效地保存了原料中的活性成分，且綠色環(huán)保無污染[17]。由于超臨界萃取法提取鵝去氧膽酸全程不適用有機(jī)溶劑，因此得到的鵝去氧膽酸不會(huì)產(chǎn)生有機(jī)溶劑的殘留，防止了提取過程中對(duì)人體有害物質(zhì)的滯留和對(duì)環(huán)境的污染。Scalia等以牛膽汁為原料，利用超臨界CO2萃取技術(shù)，增加了去氧膽酸的溶解性，去除了脂肪酸膽固醇等雜質(zhì)，實(shí)現(xiàn)了膽汁酸的提取和分離[18]。

有機(jī)溶劑提取法獲得鵝去氧膽酸的原理是使用活性炭脫色，再用有機(jī)溶劑加熱提取，再經(jīng)過濾得到鵝去氧膽酸。我國(guó)研究人員曾利用乙醇作為有機(jī)溶劑，后有研究者開始使用三氯甲烷。馮娜使用鴨膽膏為原料，使用乙酸乙酯作為提取溶劑，溫度為78 ℃，濃縮固液比為3.5，時(shí)間為1 h，獲得了提取率為80.2%的鵝去氧膽酸[19]。此方法工藝簡(jiǎn)單，制取時(shí)間短，但試驗(yàn)過程中會(huì)使用大量有機(jī)溶劑，成本較高且會(huì)造成一定的環(huán)境污染。若使用有機(jī)溶劑循環(huán)應(yīng)用技術(shù)則能在一定程度上降低生產(chǎn)成本以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要。

沉淀法提取鵝去氧膽酸的原理是利用其與金屬陽(yáng)離子相結(jié)合會(huì)形成沉淀，通常是鈣鹽或鋇鹽。但鋇鹽含有毒性對(duì)人體有害，不利于工業(yè)化生產(chǎn)，因此使用氯化鈣代替氯化鋇。曹榮安等用氯化鈣提取法從豬膽汁中提取了鵝去氧膽酸，為動(dòng)物膽汁的提取純化及加工生產(chǎn)開辟了一條切實(shí)可行的新途徑[20]。Hu等用鴨膽膏來代替?zhèn)鹘y(tǒng)方法的雞膽汁為原料，研究了鈣鹽法提取鵝去氧膽酸的新工藝，采用正交試驗(yàn)確定了每100 g鴨膽膏配以甲醇 1 000 mL，20%氯化鈣500 mL，過氧化氫520 mL，60%冰乙酸600 mL的最佳提取條件，所得鵝去氧膽酸的收率為30%[21]。該工藝簡(jiǎn)單，適合工業(yè)化生產(chǎn)，能提高畜禽副產(chǎn)品的利用率。

化學(xué)合成鵝去氧膽酸通常是利用還原12位羰基或C11烯烴加氫的方法制備鵝去氧膽酸。以膽酸甲酯為原料，通過Fieser法氧化為羰基化合物，再與對(duì)甲苯磺酰肼反應(yīng)后用NaBH4還原水解后得到鵝去氧膽酸。張飛等利用豬去氧膽酸為原料，經(jīng)甲酯化、消去、Oppenauer氧化、6，7位脫氫、環(huán)氧化、催化氫化、3位選擇性還原等反應(yīng)得到鵝去氧膽酸，總產(chǎn)率26%，有較高的應(yīng)用價(jià)值[22]。

樹脂法、超臨界萃取、有機(jī)溶劑萃取、沉淀法等直接從動(dòng)物膽汁中提取鵝去氧膽酸的方法使得鵝去氧膽酸制備方法更加多樣。有機(jī)溶劑提取法和沉淀法在生產(chǎn)過程中可能會(huì)產(chǎn)生毒性物質(zhì)而對(duì)于環(huán)境產(chǎn)生污染，也會(huì)造成生產(chǎn)成本的提高，如需工業(yè)化生產(chǎn)，須要進(jìn)一步研究。而超臨界萃取和樹脂法具有經(jīng)濟(jì)、高效、環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)，更適用于工業(yè)化生產(chǎn)?；瘜W(xué)合成法的發(fā)明解決了動(dòng)物的膽汁來源有限、難以滿足醫(yī)療需求的問題，應(yīng)用價(jià)值較高。

2.2?熊去氧膽酸

2.2.1?熊去氧膽酸的理化性質(zhì)

熊去氧膽酸，化學(xué)名3α，7β-二羥基-5β-膽甾烷-24-酸，分子式C24H40O4，分子量392.57，是鵝去氧膽酸的同分異構(gòu)體，其結(jié)構(gòu)見圖3。熊去氧膽酸呈白色粉末，味苦、無臭，不溶于水、三氯甲烷，易溶于冰乙酸、乙醇、氫氧化鈉等。熔點(diǎn)為200～201 ℃，比旋光度為59～62°。熊去氧膽酸的主要特征在3位α羥基、5位β氫和7位β羥基，其中7位β羥基是區(qū)分熊去氧膽酸與鵝去氧膽酸的唯一特征。

2.2.2?熊去氧膽酸的制備與提純

熊去氧膽酸的制備方法有3種：從熊膽汁中提取、化學(xué)合成和生物轉(zhuǎn)化法[23]。最初，我國(guó)制備熊去氧膽酸的途徑是從黑熊的膽汁中分離出熊去氧膽酸，主要是人工養(yǎng)殖的黑熊，利用活熊膽汁引流法，現(xiàn)已使用無管引流。但是此方法步驟繁雜，制備周期長(zhǎng)且來源有限，無法滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要，而且熊是國(guó)家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物，不利于野生珍稀動(dòng)物物種的延續(xù)。所以現(xiàn)研究人員已把目光轉(zhuǎn)向化學(xué)合成和生物轉(zhuǎn)化法。

化學(xué)合成法是現(xiàn)在工業(yè)生產(chǎn)鵝去氧膽酸的主要方式，通常以膽酸、豬膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸和一些非膽酸類甾體化合物為原料。Ferrari等將膽酸甲酯化乙?；?位和7位羥基后得到3α，7α- 二乙酰-12α-羥基膽酸甲酯、氧化12位羥基還原酮基，水解3，7，24位酯基得到鵝去氧膽酸，再氧化7位羥基還原7位酮基得到了熊去氧膽酸[24]。He等以廉價(jià)易得的膽酸為原料合成熊去氧膽酸，同時(shí)研究了甲磺酸酯類化合物的關(guān)鍵消元反應(yīng)條件，確定了最佳溶劑、堿和反應(yīng)溫度。豬去氧膽酸具有價(jià)格便宜、來源廣泛等優(yōu)點(diǎn)，具備很大的研發(fā)前景[25]。王鐘麟等使用豬膽汁中的豬膽酸為原料，經(jīng)過甲酯化反應(yīng)、3，6，7位羥基三乙?；磻?yīng)、選擇性水解、Jones氧化、碳酸氫鈉水解得到 6α- 羥基-3，7-二酮基-5β膽酸烷甲酯，再經(jīng)甲磺酰氯反應(yīng)、碘化鈉-鋅粉還原、鋰-液氨得到了熊去氧膽酸[26]。豬去氧膽酸與熊去氧膽酸的差異僅在6，7位羥基，且豬去氧膽酸廉價(jià)易得，因此竇倩等以豬去氧膽酸為原料，經(jīng)過酯化反應(yīng)、選擇性氧化、環(huán)氧化和脫保護(hù)等過程，以夏皮羅（Shapiro）反應(yīng)為關(guān)鍵步驟合成了熊去氧膽酸，產(chǎn)率為258%[27]。然后又對(duì)該方法進(jìn)行優(yōu)化，使用硅基保護(hù)、Rubuttom氧化、Clemmensen還原縮短了反應(yīng)過程，最終產(chǎn)率288%。鵝去氧膽酸也是化學(xué)法合成熊去氧膽酸的重要原料，盧茂芳等利用鵝去氧膽酸，經(jīng)過氧化和還原反應(yīng)得到了熊去氧膽酸，并對(duì)其工藝進(jìn)行改進(jìn)，在氧化過程以N-溴琥珀酰亞胺（NBS）為氧化劑使用次氯酸鈉代替Jounes試劑后減少了毒性，簡(jiǎn)化了后處理且提高了熊去氧膽酸的收率[28]。除了膽酸類物質(zhì)，一些非膽酸類甾體化合物也能夠合成熊去氧膽酸，韓興春等以黃酮體為原料，經(jīng)過乙酰化反應(yīng)、NBS加溴并消除得到6，7位脫氫物，再以單過氧鄰苯二甲酸氧化雙鍵環(huán)、鈀碳催化加氫、硼氫化鈉還原、Wittig反應(yīng)、二氧化鉑催化加氫7步反應(yīng)合成鵝去氧膽酸區(qū)，再經(jīng)氧化和還原反應(yīng)合成了熊去氧膽酸[29]。

近年來，利用生物轉(zhuǎn)化法合成熊去氧膽酸的報(bào)道越來越多。酶法和微生物發(fā)酵等方法均可用于熊去氧膽酸的制備。隨著固定化細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，研究人員開始將生物法制備熊去氧膽酸的研究方向從單酶系統(tǒng)轉(zhuǎn)向多酶系統(tǒng)。伴隨著帶有輔酶的多酶系統(tǒng)細(xì)胞包埋技術(shù)的突破，使固定化細(xì)胞合成熊去氧膽酸的設(shè)想成為可能。來自梭狀芽孢桿菌的7α羥基類固醇脫氫酶（7α-HSDHs）、7β羥基固醇脫氫酶（7β-HSDHs）、12α羥基類固醇脫氫酶（12α-HSDH）等脫氫酶能夠參與到鵝去氧膽酸的酶法合成中，有報(bào)道首次利用Clostridium absonum固定化細(xì)胞得到了熊去氧膽酸，膽酸轉(zhuǎn)化率不高[30-31]。到目前為止，微生物或酶法合成熊去氧膽酸的工藝還不成熟，生產(chǎn)成本高，還未能實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

這3種制備方法，從熊膽汁中提取熊去氧膽酸來源稀少，難以滿足市場(chǎng)的需求且有違對(duì)動(dòng)物的保護(hù)，逐漸被淘汰。化學(xué)合成法主要以動(dòng)物膽酸為原料，但這些方法中存在著反應(yīng)試劑昂貴、操作不便、分離困難、步驟多及收率較低等問題，今后應(yīng)該著重研究使用廉價(jià)易得的動(dòng)物膽酸為原料，步驟簡(jiǎn)單、收率高的合成路線。生物轉(zhuǎn)化法的發(fā)展，使得許多研究人員把它和化學(xué)合成法相結(jié)合，目前有把酶法、微生物發(fā)酵法與化學(xué)合成法結(jié)合的趨勢(shì)。

3?膽汁酸物性的測(cè)定方法

膽汁酸常用的測(cè)定方法有紫外可見分光光度法（UV-vis）、紅外光譜法（IR）、薄層色譜法（TLC）、核磁共振氫譜（1HNMR）、高效液相色譜（HPLC）、質(zhì)譜法（MS）等[32]。

3.1?紫外分光光度法

用UV-vis測(cè)定膽汁酸，該方法儀器使用簡(jiǎn)單、成本較低、操作簡(jiǎn)便，但樣品處理時(shí)間較長(zhǎng)。劉永貴等使用UV-vis法在605 nm處測(cè)定蛇膽中膽酸的含量，并且以此作為判斷蛇膽品質(zhì)的優(yōu)劣指標(biāo)，此方法簡(jiǎn)便有效[33]。趙啟苗等用UV-vis法，以膽南星中的鵝去氧膽酸為指標(biāo)，檢測(cè)波長(zhǎng)379 nm，建立了膽南星總膽酸含量的測(cè)定方法。此方法操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高，適用于評(píng)價(jià)膽南星的質(zhì)量[34]。

3.2?紅外光譜法

紅外光譜法是一種快速無損檢測(cè)技術(shù)，但是定量分析有較大誤差。李文龍等利用近紅外漫反射光譜分析了熊膽粉的提取物，比較不同光譜的預(yù)處理對(duì)建模結(jié)果的影響，確定了模型所用的最佳潛變量個(gè)數(shù)[35]。用此方法建立了鵝去氧膽酸和熊去氧膽酸含量的定量校正模型，通過此模型可以對(duì)熊膽粉提取物進(jìn)行快速準(zhǔn)確的定性定量分析。Li等利用近紅外光譜建立了一種熊膽粉水解過程的監(jiān)測(cè)方法，在水解過程中使用近紅外光譜儀對(duì)樣品進(jìn)行采集和測(cè)定，建立了TUDCA、TCDCA、UDCA、CDCA的定量校準(zhǔn)模型，可快速測(cè)定新批次的樣品[36]。此方法大大減少了樣品分析的工作量，能快速分析出結(jié)果，有利于對(duì)熊膽粉水解過程的理解與控制。

3.3?薄層色譜法

TLC能檢測(cè)膽汁酸的含量及鑒別雜質(zhì)，佟愛東等使用TLC法建立熊去氧膽酸相關(guān)物質(zhì)檢查方法[37]。此方法能較好地分離鵝去氧膽酸和熊去氧膽酸，熊去氧膽酸可能含有的各種相關(guān)物質(zhì)的斑點(diǎn)清晰可見，適用于熊去氧膽酸的質(zhì)量控制。陳蓉等將甲醇作為提取溶劑，用硅膠高效薄層板（G）、顯色劑10%硫酸乙醇溶液、展開劑異辛烷-乙酸乙酯-冰醋酸（體積比15 ∶7 ∶6），于460 nm處進(jìn)行薄層定量掃描，建立了同時(shí)測(cè)定珠黃散中膽酸、去氧膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸含量的方法。此方法重復(fù)性好、專屬性強(qiáng)、測(cè)定結(jié)果精確[38]。范艷美等運(yùn)用TLC法對(duì)從豬膽粉中提取的豬去氧膽酸進(jìn)行薄層分析，確定了提取物中含有豬去氧膽酸，此方法準(zhǔn)確有效，重復(fù)性好[39]。

3.4?核磁共振氫譜

1HNMR可以識(shí)別出參與分子間相互作用的特定質(zhì)子，此方法具有無損性，不會(huì)破壞樣品的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)，試驗(yàn)方法多樣，適合研究樣品中的復(fù)雜成分。Matsuok等利用核磁共振氫譜從分子間相互作用的角度對(duì)?；敲撗跄懰徕c（NaTDC）、?；切苊撗跄懰徕c（NaTUDC）、?；蛆Z膽酸鈉（NaTCDC）、牛磺膽酸鈉（NaTC）4種膽汁酸鹽形成的膠束進(jìn)行了比較和測(cè)定，研究表明NaTC和其他3種膽汁酸鹽不同，其膠束在溶液中仍然是小的初級(jí)結(jié)構(gòu)[40]。劉雙等用核磁共振氫譜圖測(cè)定了由豬去氧膽酸合成的異熊去氧膽酸結(jié)構(gòu)，確定了所合成化合物的結(jié)構(gòu)與異熊去氧膽酸結(jié)構(gòu)一致[41]。

3.5?質(zhì)譜與高效液相色譜

MS被廣泛應(yīng)用于復(fù)雜組分的分離與鑒定，有很高的靈敏度，是生物樣品研究的有效工具。HPLC具有強(qiáng)大的分離能力，因分離效率高時(shí)間短、柱效高、檢測(cè)靈敏度短、流動(dòng)相可控等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于物質(zhì)含量的測(cè)定。Mostafa等用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸混合物及片劑中熊去氧膽酸的含量[42]。Wang等用高效液相色譜法對(duì)7種膽汁酸樣品和膽汁酸進(jìn)行化學(xué)成分分析及體外細(xì)胞毒性的測(cè)定，證明了牛膽汁可能是肝癌治療中熊膽的潛在替代品[43]。高旭等采用HPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定了牛黃提取物及不同來源所得牛黃提取物中的膽酸、甘氨膽酸、甘氨石膽酸、石膽酸、?；敲撗跄懰徕c5種膽酸的含量，比較了不同提取方法對(duì)這5種膽汁酸含量的影響[44]。

除上述方法外，還有光學(xué)顯微鏡、掃描電鏡、熔點(diǎn)測(cè)定等用于測(cè)定膽汁酸。

4?藥理作用及臨床應(yīng)用

4.1?鵝去氧膽酸的藥理作用及臨床應(yīng)用

鵝去氧膽酸在各種不同動(dòng)物的膽汁中廣泛存在，是雞、鴨、鵝等家禽膽汁的主要成分。鵝去氧膽酸能抑制3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A（HMG-COA）還原酶的活性，擴(kuò)大膽汁酸池以便于膽固醇通過微膠粒狀態(tài)溶解，減少膽固醇的合成，抑制膽固醇的排泄和降低小腸中膽固醇的重吸收作用而達(dá)到溶解膽固醇型結(jié)石的功效[45]。魏松以100位膽結(jié)石患者為研究對(duì)象，對(duì)觀察組病患的常規(guī)治療藥物搭配鵝去氧膽酸治療，觀察對(duì)照組及觀察組B超結(jié)果的變化及臨床反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)搭配鵝去氧膽酸治療的觀察組的總治療率為92.0%，顯著高于僅用常規(guī)藥物治療的對(duì)照組[46]。

鵝去氧膽酸能夠減少全身血液和組織中的NO含量，抑制炎癥的加劇。NO會(huì)導(dǎo)致毛細(xì)血管的擴(kuò)張，使?jié)B透性增加，從而導(dǎo)致炎癥。鵝去氧膽酸可增加小鼠皮膚毛細(xì)血管通透性、對(duì)小鼠耳殼炎癥和甲醛性足腫脹等表現(xiàn)出了很好的抗炎作用，鵝去氧膽酸能夠抑制絕大多數(shù)急慢性炎癥。

鵝去氧膽酸也能夠增加器官組織中環(huán)磷酸腺苷（cAMP）的含量，松弛氣管平滑肌，擴(kuò)張支氣管，從而達(dá)到鎮(zhèn)咳、平喘、祛痰的作用。趙紅霞按 0.15 g/kg 和0.225 g/kg的劑量對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃，利用競(jìng)爭(zhēng)性蛋白質(zhì)結(jié)合分析法進(jìn)行檢測(cè)，灌胃給藥鵝去氧膽酸后的小鼠器官組織中的cAMP含量顯著提高，產(chǎn)生了極顯著的鎮(zhèn)咳、平喘、祛痰的作用[47]。

鵝去氧膽酸對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有明顯的抑菌作用，但對(duì)格蘭氏陰性菌抑菌效果不明顯。錢桂敏等構(gòu)建了膽道內(nèi)源膽汁酸缺乏的大鼠模型，給模型大鼠灌服鵝去氧膽酸，發(fā)現(xiàn)鵝去氧膽酸能顯著降低腸道內(nèi)芽孢桿菌屬、丹毒菌屬及紅椿菌屬的含量[48]。Shi等研究了鵝去氧膽酸對(duì)大腸桿菌的殺滅效果，培養(yǎng)3個(gè)月的處理組相比對(duì)照組有很好的抑制效果，表明鵝去氧膽酸能夠很好地抑制大腸桿菌活性[49]。經(jīng)研究，鵝去氧膽酸還可以顯著增加熱應(yīng)激小鼠肝臟的抗氧化能力，緩解熱應(yīng)激小鼠的肝臟氧化損傷[50]。

目前鵝去氧膽酸的應(yīng)用主要集中在溶解膽固醇型結(jié)石上，對(duì)其分子水平的研究及其他藥效的應(yīng)用較少[51]。目前為止，關(guān)于鵝去氧膽酸作用機(jī)理的研究還不多，須要相關(guān)科研人員進(jìn)一步研究。

4.2?熊去氧膽酸的藥理作用及臨床應(yīng)用

熊去氧膽酸能增加膽汁酸的分泌，促進(jìn)肝腸循環(huán)[52]，改變膽汁的成分，降低膽汁中膽固醇酯及膽固醇的含量，使結(jié)石中的膽固醇逐漸溶解，因此醫(yī)學(xué)上用熊去氧膽酸來溶解膽結(jié)石中的膽固醇，預(yù)防肝硬化。劉彤等以2014—2017年的243例膽囊結(jié)石病患為樣本，按數(shù)字隨機(jī)表分為對(duì)照組和觀察組，對(duì)觀察組的病人除給予常規(guī)治療外口服熊去氧膽酸膠囊。結(jié)果表明，觀察組92.62%的總有效率明顯高于對(duì)照組的81.82%[53]。因此，熊去氧膽酸能有效緩解膽固醇型結(jié)石的癥狀，縮小結(jié)石的直徑。

熊去氧膽酸還能激活蛋白激酶C和鈣離子形成的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)以及有分裂活性的蛋白激酶，以此來增強(qiáng)膽汁淤積于肝細(xì)胞時(shí)的分泌能力，降低血液和肝細(xì)胞中內(nèi)源性疏水膽酸的濃度，防止膽汁在肝膽淤積。張瑩等利用熊去氧膽酸對(duì)重度妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積患者進(jìn)行治療，顯著改善了患者肝功能及膽汁淤積所致的臨床癥狀[54]。

體外研究表明，熊去氧膽酸能夠顯著減弱乙醇對(duì)肝細(xì)胞的毒性，且能夠改善非乙醇性肝病的患者的血清指標(biāo)[55]。熊去氧膽酸是一種無毒的親水性膽汁酸，能通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制的方式減少回腸內(nèi)毒性內(nèi)源性膽酸的吸收。熊去氧膽酸還能通過競(jìng)爭(zhēng)方式取代細(xì)胞器和細(xì)胞膜上的毒性膽酸分子，防止膽管和肝細(xì)胞受到毒性膽酸的損害。

熊去氧膽酸因其藥理作用被廣泛應(yīng)用于原發(fā)性膽汁肝硬化（PBC）、膽囊纖維化肝?。–F）、妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥（ICP）、原發(fā)性硬化性膽囊炎（PSC）及非乙醇性脂肪肝（NAFLD）等疾病，有極高的臨床使用價(jià)值。

5?結(jié)束語(yǔ)

膽汁酸因其良好的生理活性越來越受到人們的關(guān)注，鵝去氧膽酸和熊去氧膽酸因其溶解膽結(jié)石、保護(hù)肝臟、止咳平喘、消炎抗菌等功效被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療食品等工業(yè)。然而還有一些問題尚未解決，目前的研究主要集中在膽汁酸制備提純技術(shù)的優(yōu)化上，膽汁酸的微生物合成方法技術(shù)還不成熟，如需工業(yè)化生產(chǎn)需降低成本，如何以廉價(jià)易得的原料制得膽汁酸需要相關(guān)研究人員進(jìn)一步研究。紫外分光光度法、薄層色譜法、紅外光譜法、核磁共振氫譜、高效液相色譜和質(zhì)譜等均可用于膽汁酸物性的測(cè)定，應(yīng)根據(jù)樣品的實(shí)際情況選擇合適的測(cè)定方法。伴隨著新技術(shù)的不斷突破，相信會(huì)有更多的新技術(shù)應(yīng)用于膽汁酸的定性定量測(cè)量，為膽汁酸的研究提供技術(shù)支撐。

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