朱學(xué)軍*，黃曉巍 ，王 昊，梁 靜，王 虹

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長春130118；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長春130118）

桔梗（Platycodon grandiflorus）是桔?？浦参锝酃５母稍锔?，是傳統(tǒng)中藥常用藥，具有止咳，平喘，排膿等功效。研究人員采用現(xiàn)代分析技術(shù)對桔梗中小分子進(jìn)行了分析研究，發(fā)現(xiàn)桔梗中主要活性成分為三萜類和黃酮類物質(zhì)[1-3]。

β-D-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)屬于水解酶類，又稱β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，是一類生物大分子，能夠水解結(jié)合于末端非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵。廣泛存在于植物、微生物和動物細(xì)胞中[4-8]。因此本文以桔梗為原料，以對硝基苯-β-D-葡萄糖為底物，測定在提取過程中酶活力的變化，對桔梗中β-D-葡萄糖苷酶提取主要影響因素進(jìn)行探索，為中藥藥物在生物大分子方面的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

桔梗（市售，新鮮桔梗室溫通風(fēng)干燥，粉碎，過40目篩，備用）。

1.1.2 試劑

對硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside,pNPG)，上海旭碩生物科技有限公司；對硝基苯酚（PNP），分析純，天津市鑫鉑特化工有限公司；其他試劑均為分析純。

1.1.3 儀器

L5S紫外可見分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酶活力測定方法

粗酶液的制備：在一定條件下，將桔梗粉末加入適量稀鹽溶液浸提一段時間后，用定量濾紙進(jìn)行過濾，收集濾液，即為粗酶液。

測定方法[5-7,9]：吸取粗酶液0.1 mL加入0.5 mL pH4.5緩沖液中，于37℃恒溫水浴預(yù)熱5 min，再加入已預(yù)熱的5 mmol/L pNPG 0.4 mL，精確計(jì)時30 min，迅速放入沸水中水浴5 min，流水冷卻至室溫，吸取0.5 mL反應(yīng)液加入1 mol/L Na2CO3溶液中，混勻，室溫放置5 min，于405 nm處測OD值。

空白對照管中加入0.1 mL沸水處理使酶失活，按上述操作。

試驗(yàn)中以每克桔梗粉末提取的總酶活力為縱坐標(biāo)作圖。

參照文獻(xiàn)[10-11],配制1 mmol/L對硝基苯酚溶液，然后用 1 mol/L Na2CO3， 分別稀釋為 0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0 μmol/L。 以蒸餾水為空白對照，在405 nm波長處測定吸光值，以吸光值為縱坐標(biāo)，對硝基苯酚的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

酶活力定義：在pH4.5，溫度37℃，以pNPG為底物，每分鐘水解產(chǎn)生1 μmol對硝基苯酚的酶量為1個活力單位（U）。計(jì)算公式如下：

式（1）中A：酶活力單位（U/g單位質(zhì)量原料提取液測定的酶活力）；

C濃：對應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)曲線上的對硝基苯酚的濃度；

V總：單位質(zhì)量原料提取液的總體積；

V反：用于酶活力測定提取液的體積；

30：反應(yīng)時間，單位min

1.2.2 提取溫度對酶活力的影響

分別在不同溫度下，其他條件固定，提取一定時間后，過濾，收集濾液，按照酶活力測定方法測定酶活力，以溫度為橫坐標(biāo)，酶活力為縱坐標(biāo)繪圖。

1.2.3 提取時間對酶活力的影響

分別在不同時間下，其他條件固定，進(jìn)行提取，收集濾液，按照酶活力測定方法測定酶活力，以時間為橫坐標(biāo)，酶活力為縱坐標(biāo)繪圖。

1.2.4 提取料液比對酶活力的影響

分別按照不同原料質(zhì)量與提取液體積的比值（m/V），其他條件固定，提取一定時間后，過濾，收集濾液，按照酶活力測定方法測定酶活力，以料液比為橫坐標(biāo)，酶活力為縱坐標(biāo)繪圖。

1.2.5 鹽濃度對酶活力的影響

分別使用不同濃度的氯化鈉溶液，其他條件固定，進(jìn)行提取，收集濾液，按照酶活力測定方法測定酶活力，以時間為橫坐標(biāo)，酶活力為縱坐標(biāo)繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

對硝基苯酚曲線見圖1

圖1 對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of PNP

線性回歸方程為 ，R2=0.9998說明線性關(guān)系良好。

2.2 提取溫度對酶活力的影響

圖2 溫度對酶活力的影響Fig.2 Effect of temperature on activity of β-glucosidase

由圖2可知，酶活力在溫度25～35℃之間隨著溫度的增加而增大；溫度增加有利于酶的溶出，但是溫度過高會使酶蛋白變性，使酶活力降低，在35℃以后酶活力隨著溫度的升高而降低。結(jié)果表明，最適提取溫度為35℃。

2.3 提取時間對酶活力的影響

圖3 時間對酶活力的影響Fig.3 Effect of time on activity of β-glucosidase

由圖3可知，酶活力在時間0.5～2 h之間隨著時間的延長而增加；在提取時間2 h處酶活力最高，提取時間2～3 h酶活力迅速下降。從結(jié)果可知，提取最佳時間為2 h，提取時間短β-葡萄糖苷酶溶出量較低，提取時間過長酶容易受到細(xì)菌污染，蛋白酶水解和其他導(dǎo)致酶變性物理因素的影響，使酶蛋白變性同時伴隨著酶活力降低。結(jié)果表明，最適提取時間為2 h。

2.4 提取料液比對酶活力的影響

圖4 料液比對酶活力的影響Fig.4 Effectofsolid-liquidratioonactivityofβ-glucosidase

由圖4可知，酶活力隨著料液比的增加而增大，通過酶活力的比較可知1∶35料液比酶活力最多，但是由于料液比增加酶活力增加幅度并不大，從經(jīng)濟(jì)原則上看，選擇1∶25作為最佳提取的料液比。

2.5 鹽濃度對酶活力的影響

圖5 鹽濃度對酶活力的影響Fig.5 Effectofsaltconcentrationonactivityofβ-glucosidase

由圖5可知，鹽濃度對β-葡萄糖苷酶酶活力影響比較大，鹽濃度在0.05～0.2 mol/L之間酶活力隨著鹽濃度增加而增加，主要是鹽溶作用增大，鹽濃度在0.2～0.3 mol/L之間隨著鹽濃度的增加而減少，這是由于鹽析作用增強(qiáng)而引起酶活力的降低。從結(jié)果可知，提取最佳鹽濃度為0.2 mol/L

3 結(jié)論

通過單因素控制變量法，使用稀鹽溶液提取β-葡萄糖苷酶的最適條件：提取溫度35℃，提取時間2 h，料液比 1:25，鹽濃度為 0.2 mol/L。