烏曉

(上藥康德樂(lè)（浙江）醫(yī)藥有限公司·浙江寧波·315100)

浙貝母，為多年生草本植物，具有極高的藥用價(jià)值，其屬百合科屬種。藥用部位主要集中于地下鱗莖，由2～3枚鱗片所組成，呈元寶狀或半球形狀。浙貝母鱗莖藥用部位具有清熱解毒、化痰、止咳、開(kāi)郁、散結(jié)等功效[1-3]，尤以治風(fēng)熱咳嗽，肺癰喉痹，瘡瘍腫毒為最佳，因此，具有極高的藥用應(yīng)用價(jià)值，在民間，應(yīng)用較為廣泛[4-6]。目前，浙貝母主要分布和種植于浙江南部、江蘇北部和湖南等地區(qū)，其中，道地藥材尤以浙江的浙貝母為最佳，其主要分布和種植于寧波樟水鎮(zhèn)四明山麓一帶。因其具有較高藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，應(yīng)用范圍廣泛，列為“浙八味”藥材之一[7]。通過(guò)藥效學(xué)和化學(xué)成分提取分離等試驗(yàn)結(jié)果表明，浙貝母地下部分鱗莖的主要活性物質(zhì)為生物堿化合物，尤以貝母素甲和貝母素乙為主[8]，2015版《中國(guó)藥典》對(duì)浙貝母質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定也以貝母素甲和貝母素乙為主[9]。

但近年來(lái)，隨著浙貝母?jìng)鹘y(tǒng)的無(wú)性繁殖方式帶來(lái)了一定的問(wèn)題，主要表現(xiàn)在浙貝母鱗莖的繁殖率低、繁殖速度慢、藥效品質(zhì)的逐步退化，育種方式的過(guò)于傳統(tǒng)，導(dǎo)致了浙貝母目前在種植方向出現(xiàn)了對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力差，容易產(chǎn)生病蟲(chóng)害，種植面積的不斷擴(kuò)大，但產(chǎn)量方面逐年減少，使得浙貝母的道地藥材產(chǎn)區(qū)影響較大[10]。同時(shí)，科技工作者試圖采用多種技術(shù)方法來(lái)解決此些問(wèn)題，如克服浙貝母鱗莖部位的休眠期，采用物理降溫、化學(xué)臭氧處理等方式方法來(lái)解決浙貝母的休眠期[11]。隨著科技的日新月異，已有多種誘變育種處理方式已在其他農(nóng)作物等種植方向取得了不斷創(chuàng)新和突破，受到廣大科技工作者所青睞，顯現(xiàn)出良好的市場(chǎng)應(yīng)用價(jià)值。

為提高道地藥材產(chǎn)區(qū)浙貝母給農(nóng)民所帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)效益，本研究通過(guò)選育目前浙貝母中品質(zhì)好、產(chǎn)量高和適應(yīng)性強(qiáng)的寬葉、窄葉和狹葉種球作為實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象，采用60Co-γ的不同輻射劑量處理育種，后期對(duì)對(duì)不同月份的三個(gè)品種浙貝母進(jìn)行采集收樣，通過(guò)HPLC-ELSD法測(cè)定和比較三個(gè)品種的浙貝母貝母素甲和貝母素乙的含量高低，從而對(duì)浙貝母的新品種選育提供一定的參考和指導(dǎo)。

1 儀器與試劑

儀器：1260型高效液相色譜—2424型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器聯(lián)用儀(HPLC-ELSD，液相色譜儀，美國(guó)安捷倫科技有限公司；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，美國(guó)沃特斯科技有限公司；KQ-250B型超聲波清洗劑，寧波新芝生物科技有限公司；6202型高速粉碎機(jī)，北京開(kāi)創(chuàng)同和科技發(fā)展有限公司；AX2202ZH電子天平，蘇州梅特勒科技有限公司。

試劑：甲醇和乙腈色譜純流動(dòng)相均為美國(guó)天地公司；丙酮、三氯甲烷和丙酮均為分析純，購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；貝母素甲和貝母素乙對(duì)照品，分別購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司和中國(guó)生物檢定所。

樣品：研究所選的浙貝母種子為細(xì)葉、寬葉和狹葉浙貝母品種，通過(guò)三個(gè)不同劑量的60Co-γ輻射誘變處理，輻射劑量率為22Gy/min，其誘變劑量大小分別為15Gy、50Gy和70Gy，后再經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室相關(guān)處理，種植于研究實(shí)驗(yàn)地寧波鄞州區(qū)章水鎮(zhèn)樟村浙貝母示范基地示范圃內(nèi)，后期進(jìn)行1～5月份的收集采樣。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品的制備

對(duì)1～5月份的細(xì)葉、狹葉和寬葉三品種浙貝母采樣收集，將鱗莖洗凈后采用40℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱進(jìn)行烘干處理，再用中藥粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，得到各月份的三個(gè)品種浙貝母藥材粉末，之后精密稱定各月份、品種的浙貝母藥材粉末2g左右，分別置圓底燒瓶中，并做好相應(yīng)記錄。分別加入氨水10ml和三氯甲烷溶液40ml，后將其靜止30min，后在60℃水浴進(jìn)行冷凝回流提取，提取時(shí)間為1h，最后將提取液在漏斗濾紙進(jìn)行過(guò)濾，得1～5月份和不同品種的浙貝母生物堿活性成分貝母素甲和貝母素乙提取液，備用待測(cè)。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取各對(duì)照品，并做好記錄，其中，貝母素甲對(duì)照品：0.0097g、貝母素乙對(duì)照品：0.0089g，對(duì)照品合置于10ml容量瓶中，以色譜級(jí)的甲醇定容至10ml，對(duì)照樣品溶解采用超聲波溶解，再用色譜級(jí)甲醇依次稀釋成貝5個(gè)濃度的溶液，其中貝母素甲為：970、485、242.5、121.25、60.63mg/L，貝母素乙：890、445、222.5、111.25、55.63mg/L的混合對(duì)照品溶液，備用待測(cè)。

2.3 色譜條件

液相色譜參數(shù)：流動(dòng)相：乙腈︰水︰二乙胺﹦70︰30︰0.03；柱溫箱：30℃；流速：1.0ml/min；進(jìn)樣量：20μL； 色譜柱： 安捷倫 （Agilent）Plus C18250mm×4.6mm 5μm；ELSD檢測(cè)器參數(shù)：恒定氮?dú)鈿怏w壓力

2.0 L/min。

3 HPLC-ELSD法測(cè)定

采用HPLC-ELSD測(cè)定法，通過(guò)2.1樣品的制備處理后，對(duì)誘變輻射處理后的細(xì)葉、狹葉和寬葉三個(gè)品種浙貝母藥材的生物堿活性成分貝母素甲和貝母素乙含量進(jìn)行分析，對(duì)照品的HPLC-ELSD分析見(jiàn)圖1，其中：1號(hào)峰為貝母素甲，保留時(shí)間為12.8min；2號(hào)峰為貝母素乙，保留時(shí)間為16.4min。按照2.3色譜條件和ELSD檢測(cè)器參數(shù)進(jìn)樣分析，得到相應(yīng)線性回歸方程，貝母素甲標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=1.628X+90.69（r2=0.998），貝母素乙標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=1.723X+80.12（r2=0.999）。

圖1 對(duì)照品浙貝母的HPLC-ELSD貝母素甲和貝母素乙的色譜圖Fig.1 HPLC-ELSD chromatograms of Fritillaria thunbergii alkaloids peimine A and peimine B

4 結(jié)果和討論

4.1 不同輻射強(qiáng)度，采收月份為1～5月浙貝母活性生物堿測(cè)定結(jié)果

對(duì)采用收集的1～5月份浙貝母三個(gè)品種：細(xì)葉、狹葉和寬葉，通過(guò)2.1樣品制備方法，并采用上述的HPLC-ELSD法測(cè)定不同月份的浙貝母進(jìn)行生物堿貝母素甲和貝母素乙。

其中，在不同輻射誘變劑量處理后，收集采樣的浙貝母細(xì)葉品種在1～5月份，浙貝母生物堿活性成分的貝母素甲和貝母素乙含量測(cè)定結(jié)果之和具體見(jiàn)表1。

表1 浙貝母細(xì)葉品種生物堿貝母素甲+貝母素乙含量(mg)Fig.1 Content of alkaloids peimine a+peimine B in Fritillaria thunbergii fine leaf varieties

在不同輻射誘變劑量處理后，收集采樣的浙貝母狹葉品種在1～5月份，浙貝母生物堿活性成分的貝母素甲和貝母素乙含量測(cè)定結(jié)果之和具體見(jiàn)表2。

表2 浙貝母狹葉品種生物堿貝母素甲+貝母素乙含量(mg)Fig.2 Contents of alkaloids peimine a+peimine B in Fritillaria thunbergii Narrow Leaf Varieties

在不同輻射誘變劑量處理后，收集采樣的浙貝母寬葉品種在1～5月份，浙貝母生物堿活性成分的貝母素甲和貝母素乙含量測(cè)定結(jié)果之和具體見(jiàn)表3。

表3 浙貝母寬葉品種生物堿貝母素甲+貝母素乙含量(mg)Fig.3 Contents of alkaloids peimine a+peimine B in Fritillaria thunbergii broad leaf varieties

4.2 不同品種浙貝母，采收月份為1～5月浙貝母活性生物堿測(cè)定結(jié)果

按照1～5月份的浙貝母藥材采收，浙貝母的三個(gè)品種細(xì)葉、狹葉和寬葉在在不同誘變劑量的影響下，各品種的生物堿活性成分貝母素甲和貝母素乙的檢測(cè)結(jié)果做成相關(guān)圖示，細(xì)葉、狹葉和寬葉在1～5月的浙貝母生物堿活性成分貝母素甲和貝母素乙折線圖以圖2—6所示。

圖2 浙貝母細(xì)葉、狹葉和寬葉在1月份含量變化圖Fig.2 Variation of fine,narrow and wide leaves in Fritillaria thunbergii in January

圖3 浙貝母細(xì)葉、狹葉和寬葉在2月份含量變化圖Fig.3 Variation of fine,narrow and wide leaves in Fritillaria thunbergii in February

圖4 浙貝母細(xì)葉、狹葉和寬葉在3月份含量變化圖Fig.4 Variation of fine,narrow and wide leaves in Fritillaria thunbergii in March

圖5 浙貝母細(xì)葉、狹葉和寬葉在4月份含量變化圖Fig.5 Variation of fine,narrow and wide leaves in Fritillaria thunbergii in April

圖6 浙貝母細(xì)葉、狹葉和寬葉在5月份含量變化圖Fig.6 Variation of fine,narrow and wide leaves in Fritillaria thunbergii in May

通過(guò)對(duì)折射圖2—6可知，對(duì)三個(gè)品種的細(xì)葉、狹葉和寬葉浙貝母活性物質(zhì)生物堿貝母素甲和貝母素乙的HPLC-ELSD測(cè)定結(jié)果表明，各品種的浙貝母活性物質(zhì)生物堿貝母素甲和貝母素乙含量跟采收的月份呈正向關(guān)系，隨著采收月份的遞增，各品種的活性物質(zhì)生物堿貝母素甲和貝母素乙含量也相應(yīng)增加，通過(guò)這一檢測(cè)可知，為浙貝母在不同品種在采收季節(jié)上提供了參考意義，其中尤以5月份采摘為最佳。另外，通過(guò)對(duì)圖2—6的折射圖可知，浙貝母寬葉品種在1～5月份的生物堿活性成分貝母素甲和貝母素乙含量測(cè)定結(jié)果都高于另外細(xì)葉和狹葉兩個(gè)品種，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)輻射誘變育種后，浙貝母細(xì)葉、狹葉和寬葉的活性生物堿浙貝母甲和貝母素乙測(cè)定結(jié)果都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于未做輻射處理的對(duì)照浙貝母樣品，這為浙貝母的新品種選育和核心種質(zhì)構(gòu)建提供一定的指導(dǎo)意義，為農(nóng)民在種植增產(chǎn)增收起到了科技幫扶作用，同時(shí)也為其他農(nóng)作物在輻射誘變方面提供了參考意義。